وأيد هذا العمل جزئيا من قبل الحكومة الاسبانية &quot;MINISTERIO دي Educación ذ Ciencia&quot; (مشروع AGL2008-05275-C01/ALI) ، في إطار الاتحاد الأوروبي للبحوث 7 مشاريع ممولة VIROBATHE (العقد رقم 513648) ، VIROCLIME (العقد رقم 243923 ) والوكالة الكتلانية للمياه والوكالة الكتالونية DE L&#39; Aigua (ACA) ، Departament دي التحكم ط Millora dels Ecosistemes السباحة. أثناء الدراسة المتقدمة ومارتا Rusiñol زميل &quot;AGAUR&quot; الكاتالونية الحكومة (FI - DGR).

1. تركيز الجسيمات الفيروسية موجودة في عينات المياه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتكييف جمع عينات المياه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما لا يقل عن 2 لتر من 10 مكررات لكل عينة في حاويات من البلاستيك مع مسطحة القاع وعينة واحدة اضافية كعنصر تحكم العملية. وسيتم ارتفعت هذه العينة الأخيرة مع كمية معروفة من الجزيئات الفيروسية ويستخدم كعنصر تحكم. ملاحظة : من المستحسن أن يكون مادة مستقلة خاصة (الزجاجات والأنابيب وغيرها) لعينات ارتفعت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من معايرة مقياس التوصيل وإعادة تقويم إذا لزم الأمر. تعد السيطرة السلبية باستخدام ماء الصنبور سبق تعديلها إلى الموصلية الكافي (انظر أدناه 1.6) في واحدة من خارج الحاويات البلاستيكية L 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينات ارتفعت : إضافة حجم قياسي من السيطرة على الفيروس (نسخ الجينوم حوالي 10 5 لكل 10 لتر من الماء) إلى العينة. مزيج من قبل التحريك تجنب الرش والهباء الجوي. ويمكن التحكم إيجابية تتمثل في سلالة اتش المألوف من لياليكما اوك HAdV - 35 أو عاثية مثل MS2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت العينة تمثل كمية عالية من المواد العالقة (الرمل أو غيرها من المواد) ، والسماح لها الرواسب لمدة 15 دقيقة. نقل الماء في وعاء جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة من عينة المياه إلى 3.5 (± 0.1) عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك N 1. هذه الخطوة هامة للتركيز على فيروسات ، لذا تأكد من درجة الحموضة تم تعديلها بشكل صحيح. مزيج الماء بشكل دقيق من قبل اثارة قوية بينما إضافة حمض الهيدروكلوريك. (ملاحظة : إذا كانت درجة الحموضة أقل من 3.5 إضافة هيدروكسيد الصوديوم M 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التوصيل. إذا كان لديها عينة من 1500 الموصلية مايكروثانية / سم أو أكثر ، ليست هناك حاجة هذه الخطوة. إذا كان التوصيل هو أقل من 1500 ميكروثانية / سم ليست مضمونة تشكيل المواد flocculated (flocs) لذلك ضبط التوصيل إلى 1500 ميكرو ثانية / سم عن طريق إضافة أملاح البحر الاصطناعي (سيغما). مزيج بقوة التحريك مع إضافة أملاح البحر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل الرقم الهيدروجيني للعينات قبل وبعد وكذلك وتكييفق استخدام حجم حمض الهيدروكلوريك. وينبغي أيضا أن تسجل الموصلية بعد تعديل درجة الحموضة. تطهير دائما الأقطاب الحموضة متر ومقياس التوصيل بمحلول حمض الهيدروكلوريك الطازجة ، مع 10 ٪ dechlorinate الصوديوم حل tiosulphate وأخيرا شطف بالماء المقطر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحليب الخالي من الدسم قبل flocculated 1 ٪ (PSM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من معايرة متر الرقم الهيدروجيني ومقياس التوصيل وإعادة تقويم إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد مرحلة ما قبل حل flocculated الحليب الخالي من الدسم (1 ٪ PSM ، ث / ت) عن طريق إذابة 10 جرام من مسحوق الحليب منزوع الدسم (Difco) في مياه البحر L 1 الاصطناعي (حل 33.3 غرام من أملاح البحر الاصطناعي في 1 لتر من مياه الصنبور الكلور وتعقيم) و ضبط بعناية إلى 3.5 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك 1N. يجب أن تكون مرئية flocs. إعداد الحل قبل لمجرد أن يكون استخدام أو تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لإزالة الكلور استخدم 1 مل من محلول tiosulphate 10 ٪ لكل 100 مل من الماء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تندف من الجسيمات الفيروسية موجودة في عينات المياه<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من PSM 1 ٪ إلى 10 عينة مياه - L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك العينات لمدة 8-10 ساعة للسماح للفيروسات ليمتز إلى flocs. استخدام جهاز توقيت لتبديل قبالة التحريك بعد 80-10 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التحريك وترك الرواسب flocs بواسطة الجاذبية لمدة 8-10 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وإعادة حل ، وflocs. الطرد المركزي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف باستخدام مضخة تمعجية وماصة بلاستيكية متصلة أنبوب بلاستيكي. وينبغي أن يكون للعينات جمعت ارتفعت طاف في زجاجة وتطهيرها وفقا للاجراءات الداخلية. في جميع الحالات الحرص على عدم جمع بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الرواسب مع flocs (حوالي 500 مل) في زجاجة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق التوازن بين الأواني بإضافة درجة الحموضة PSM 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القدور الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي بسرعات عالية 8000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. بمجرد أن توقف أجهزة الطرد المركزي ، وإزالة بعناية الأواني الطرد المركزي من أجهزة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ز جداصب ently الخروج وتجاهل طاف. اتباع التدابير المناسبة لمواد معدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 7 مل من الفوسفات عازلة بحل بيليه في كل زجاجة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يتم حل flocs وقياس وإضافة العازلة الفوسفات للوصول إلى إجمالي حجم 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس والتركيز الفيروسية التي vortexing وتوزيع مل 10 في microtubes النظيفة التي ينبغي أن تكون مجمدة في -80 درجة مئوية في حين الحاجة إلى مزيد من التحليل. </li></ol></li></ol> 2. حمض النووي استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء استخراج الحمض النووي مع مجموعة صغيرة QIAamp الفيروسية الحمض النووي الريبي لتعليمات الشركة المصنعة. هذه المجموعة تمكن من استخدام منصة الآلي (مثل Qiacube ، Qiagen). </li></ol> 3. PCR الكمي من الفيروسات الغدية البشرية (HAdV) ، polyomaviruses JC (JCPyV) ، الفيروسات الغدية الخنازير (PAdV) وpolyomaviruses البقري (BPyV) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكمي للنسخ الجينوم في العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعدادمزيج qPCR في منطقة منفصلة نظيفة باستخدام TaqMan PCR البيئية ماجستير ميكس 2X (النظم البيولوجية التطبيقية). رد الفعل يحدث رد فعل في لوحة 96 - البصرية مغطاة جيدا لاصق يغطي البصرية. تركيزات ميكس ماجستير ، موصوفة الاشعال وتحقيقات في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد أعد هذا المزيج ، 15μl قسامة في كل جانب بما في ذلك التحكم (انظر 3.2). فإن الحجم الكلي لأحد رد فعل بعد إضافة الهدف يكون 25μl (المزيج 15μl + عينة 10μl أو قياسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حمض النووي من العينات المستخرجة (10μl) في منطقة منفصلة. تشغيل المباشر والتخفيف من عشرة أضعاف في تنقية المياه من كل عينة في مكررة. تغطية الآبار التي تحتوي على عينات لجزء من غطاء لاصق ، والحفاظ على الجزء الآخر من غطاء للخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة التخفيفات من الايقاف القياسية الحمض النووي (10μl) من GC/10μl 0-10 6 10 بواسطة ثلاث نسخ واستخدام micropipette تستخدم حصرا لستاندارد الحمض النووي. فمن المستحسن أن تضيف المعايير في منطقة الأشعة فوق البنفسجية مجهزة لتدمير الحمض النووي البلازميد ولتنظيف micropipette بعد كل استعمال. تغطية الآبار التي تحتوي على المعايير مع غطاء لاصق قبل قطع. ملاحظة : لتحضير المعلقات القياسية ليتم استخدامها في تحديد مقدار نسخ الجينوم ، ينبغي استنساخ الحمض النووي في المنطقة المستهدفة الى البلازميد وخطي. في العنوان التالي ستجد إجراءات تفصيلية حول كيفية إنشاء منحنيات قياسية مع قوالب DNA البلازميد لاستخدامها في qPCR : <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفذ qPCR في اختيار نظام ملائم المعلمات المناسب (النظر في استخدام غطاء لاصق وحجم الكلي في كل بئر ، الخ). بعد تفعيل AmpliTaq الذهب لمدة 10 دقيقة في 95 درجة مئوية ، و 40 دورات من التضخيم تتم على النحو التالي : 15 درجة مئوية في ليالي 95و1 دقيقة عند درجة 60 للHAdV ، وJCPyV BPyV و 15 ثانية في 95 درجة مئوية ، 20S عند درجة حرارة 55 مئوية و 20S في 60 درجة مئوية لمدة PAdV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم الانتهاء من ردود الفعل ، تخزين البيانات والنتائج كما هو موضح في دليل المستخدم للمعدات المستخدمة. وسيتم تحديد كمية الحمض النووي كما وسيطة من البيانات التي تم الحصول عليها بعد تصحيح عامل التخفيف عند الحاجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضوابط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية. يجب أن تشمل فحص أكثر من دولة واحدة غير قالب التحكم (NTC) لاثبات مزيج لا تنتج مضان. فإنه من المستحسن لتشغيل مراقبة عملية إيجابية من أجل تقييم تثبيط الأنزيمية المحتملة نتيجة للمثبطات الموجودة في العينات المدروسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نتائج قياسية لفحوصات qPCR اثنين من التخفيفات مختلفة من الحمض النووي من القياسية ومراقبة العملية. استخدام النتائج لإعداد الرسوم البيانية لمراقبة الجودة (QC) البرامج ذات الصلة لحساسية وكفاءة المقايسات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيدالنتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون النتائج ايجابية وأكد كذلك باستخدام تسلسل المتداخلة - PCR والنوكليوتيدات من amplicons ، وإنتاج بيانات إضافية عن تسلسل النوكليوتيدات السلالات الكشف 1،5،6،7،9،12. </li></ol></li></ol> ووصف الإجراء التالي ، تم الكشف عن الفيروسات البشرية والحيوانية وكميا في مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه النهر 2،3. كمثال ممثل ، تم تقييم عينات من المياه الجوفية من المناطق تقديم مستويات عالية من النترات لتحديد مصادر التلوث. وقد تم جمع عينات من المياه لمدة عشر ليتر من 4 آبار مختلفة في المناطق الريفية في منطقة شمال شرق في اسبانيا. خمس نسخ مكررة تم جمعها في كل تكرار واحد يجري بشكل جيد مع المصنف اتش 2 الإنسان استخدامها لمكافحة العملية. تم تجهيز العينات وفقا لبروتوكول الممثلة في الشكل 1. الأربعة يعيد تحليلها في واحدة من أربعة مواقع وأظهرت الدراسة نتائج إيجابية لPAdV (متوسط ​​قيمة 7.74x10 2 GC / لتر) التي من شأنها أن تكون ذات صلة إلى وجود عجائن الخنازير في المناطق المجاورة للموقع وأخذ عينات البراز ستدعم تلوث الخنازير كمصدر من النترات في المياه الجوفية (الجدول 2). 4. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الداخلي للكشف والتحديد الكمي للفيروسات في الماء. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="الجدول 1" /> الجدول 1. تركيز الاشعال وتحقيقات عن المقايسات qPCR. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="الجدول 3" /> الجدول 2. الكشف النوعي والكمي لالفيروسات الغدية الحيوانية والبشرية وpolyomaviruses في عينات المياه الجوفية. ن عدد من يعيد تحليل النسبة المئوية ٪ من إيجابية متماثلة (--) غير المكتشفة

<ol>
	<li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission.">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li><li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li><li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool.">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment.">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment.">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li><li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR.">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li><li>de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Mart&#237;n, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination.">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li><li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses.">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li><li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water.">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li><li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand.">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li></ol>

وقد أودعت طلبات براءات الاختراع في عام 2009 اثنين لحماية الملكية الفكرية للبروتوكولات لتقدير حجم وPAdV BPyV.

<html> ووصف الإجراء استيفاء الشروط اللازمة للأسلوب المناسب لروتين مختبرات البيئة والصحة العامة : يمكن استنساخه ، موثوق بها ، واضحة وفعالة من حيث التكلفة. بروتوكول بسيط ، ولكن يجب اتباعها بعناية. والموصلية المنخفضة في العينات دون إضافة تركيز الأملاح المطلوبة من مياه الب...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الطرد المركزي عالية السرعة (8000 x ج) </td><td> Berckman كولتر </td><td> أفانتي J - 20XP </td><td></td></tr><tr><td> درجة الحموضة متر ، ومقياس الحرارة مقياس التوصيل </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب بلاستيكية طولها 100-200 سم </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> تخرج عقيمة ماصات المتاح </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب بلاستيكية معقمة 1.5 و 10-15 مل (إيبندورف ، الصقور ، الخ.) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> الأواني الطرد المركزي (500 مل) </td><td> فيشر العلمية </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> النمامون المغناطيسي والمغناطيس (واحدة لكلالعينة) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> الزجاج أو البلاستيك قيعان الحاويات وجود شقة للسماح للاستخدام النمامون المغناطيسي </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> مضخة تمعجية لإزالة طاف (أو فراغ مضخة مائية نفاثة) </td><td> واتسون ، مارلو </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> الموقت إلى التحول بعيدا عن اثارة بعد 8-10 ساعات </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الهيدروكلوريك (1N و0.1N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> أملاح البحر الاصطناعي مياه البحر </td><td> سيغما </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> الحليب الخالي من الدسم (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات الحموضة العازلة 7(5) </td><td></td><td></td><td> 01:02 ت / ت 2 من العقيمة نا هبو M 4 و 0،2 ناه 2 ص 4 0،2 م عند pH 7.5 </td></tr><tr><td> Thiosulphate </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> جعل حل 10 ٪ في الماء </td></tr><tr><td> QIAamp الفيروسي RNA ميني كيت </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - جيدا رد فعل لوحة بصرية (500 وحدة) </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> لاصق يغطي البصرية (100 وحدة) </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan PCR البيئية ماجستير ميكس 2X </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses

التلوث الميكروبي للبيئة يمثل مخاطر صحية كبيرة. المؤشرات البكتيرية الكلاسيكية البراز أظهرت أن يكون لها حدود كبيرة ، والفيروسات وأكثر مقاومة للكثير من عمليات التعطيل والمؤشرات القياسية البراز لا تبلغ عن مصدر التلوث. تطوير أساليب فعالة التكلفة للتركيز الفيروسات من الماء والمقايسات الجزيئية يسهل انطباق الفيروسات كمؤشرات للتلوث البراز والجراثيم كمصدر تتبع الأدوات (MST). والفيروسات الغدية polyomaviruses هي فيروسات تصيب الحمض النووي الأنواع الفقارية محددة بما في ذلك البشر وتفرز بشكل مستمر في البراز و / أو البول في جميع المناطق الجغرافية التي شملتها الدراسة. في الدراسات السابقة ، واقترح علينا تحديد مقدار الفيروسات الغدية البشرية (HAdV) وpolyomaviruses JC (JCPyV) بواسطة PCR الكمي (qPCR) وذلك في مؤشر تلوث البراز البشري. في الآونة الأخيرة ، وضعنا لفحوصات qPCR الكمي محددة من البرتغالالفيروسات الغدية سينمائية (PAdV) وpolyomaviruses البقري (BPyV) كدلالة على وجود تلوث برازي الحيوانات ذات حساسيات من نسخ الجينوم 10-10 في أنبوب اختبار. في هذه الدراسة ، فإننا نقدم الإجراءات الواجب اتباعها لتحديد مصدر تلوث في عينات المياه باستخدام هذه الأدوات. ومثال على نتائج ممثلة ، يظهر تحليل الفيروسات في المياه الجوفية تقديم مستويات عالية من النترات. الكشف عن الفيروسات في المياه الملوثة منخفضة أو متوسطة يتطلب تركيز الفيروسات ما لا يقل عن عدة لترات من الماء إلى حجم أصغر بكثير ، وهو الإجراء الذي عادة ما يتضمن الخطوات تركيز اثنين في السلسلة. هذا الإجراء مرهقة بعض الشيء ، والتباين الملحوظ في استرداد الفيروسي يعيق بشكل كبير في تجهيز المتزامن لعدد كبير من عينات المياه. من أجل القضاء على عنق الزجاجة بسبب الإجراءات على مرحلتين لدينا تطبيق البروتوكول خطوة واحدة وضعت في السابق studieق ، وتنطبق على مجموعة متنوعة من المصفوفات المياه. الإجراء يشمل : تحمض عينات من المياه لمدة عشر لتر ، تندف من الحليب الخالي من الدسم ، والترسيب خطورة المواد flocculated ، وجمع من تعجل والطرد المركزي ، إعادة تعليق من يعجل في 10 مل العازلة الفوسفات. يتم استخدام تركيز الفيروسي لاستخلاص الأحماض النووية الفيروسية والفيروسات الغدية محددة وpolyomaviruses من الفائدة التي qPCR كميا. قد يكون عدد كبير من العينات التي تم تحليلها في وقت واحد باستخدام هذا الأسلوب تركيز منخفض التكلفة. وقد تم تطبيق هذا الإجراء لتحليل مياه الاستحمام ومياه البحر ومياه النهر وفي هذه الدراسة ، فإننا نقدم نتائج تحليل عينات المياه الجوفية. هذا الأسلوب الإنتاجية العالية الكمية هو موثوق بها ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة.

Watch this Scientific Journal Video about Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses at JoVE.com

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

دراسة توضح طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث برازي / البول أو التلوث النترات في المياه باستخدام qPCR الكمي للفيروسات محددة من الحمض النووي البشري / الخنزير / البقر ، والفيروسات الغدية polyomaviruses ، على النحو المقترح أدوات MST.

طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

cost-effective-method-for-microbial-source-tracking-using-specific

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Statistics

Immunology and Infection

Unit 1

Control Charts

SCIENTISTS IN ACTION

12.1K Views.  University of Barcelona. دراسة توضح طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحديد مصدر تلوث برازي / البول أو التلوث النترات في المياه باستخدام qPCR الكمي للفيروسات محددة من الحمض النووي البشري / الخنزير / البقر ، والفيروسات الغدية polyomaviruses ، على النحو المقترح أدوات MST.

Video: Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Comprehensive &amp; Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical large scale diagnostic testing. In the low-income countries inexpensive ART has transformed the prospects for the survival of HIV seropositive patients but there are doubts whether there is a need for the laboratory monitoring of ART and at what costs - in situations when the overall quality of pathology services can still be very low. The appropriate answer is to establish economically sound services with better coordination and stricter internal quality assessment than seen in western countries. This video, photographed at location in the National Health Laboratory Services (NHLS-SA) at the Witwatersrand University, Johannesburg, South Africa, provides such a coordinated scheme expanding the original 2-color CD4-CD45 PanLeucoGating strategy (PLG). Thus the six modules of the video presentation reveal the simplicity of a 4-color flow cytometric assay to combine haematological, immunological and virology-related tests in a single tube. These video modules are: (i) the set-up of instruments; (ii) sample preparations; (iii) testing absolute counts and monitoring quality for each sample by bead-count-rate; (iv) the heamatological CD45 test for white cell counts and differentials; (v) the CD4 counts, and (vi) the activation of CD8+ T cells measured by CD38 display, a viral load related parameter. The potential cost-savings are remarkable. This arrangement is a prime example for the feasibility of performing &gt; 800-1000 tests per day with a stricter quality control than that applied in western laboratories, and also with a transfer of technology to other laboratories within a NHLS-SA network. Expert advisors, laboratory managers and policy makers who carry the duty of making decisions about introducing modern medical technology are frequently not in a position to see the latest technical details as carried out in the large regional laboratories with huge burdens of workload. Hence this video shows details of these new developments.

Anti-retroviral therapy to treat HIV/AIDS is monitored in South Africa on a large scale. Flow cytometry is combined for haematology (CD45), immunology (CD4) and viral-load linked CD38 assay. Recorded at NHLS-SA laboratories, Johannesburg, these modern methods are cost-efficient with heightened local internal quality control, serving as role-models for resource-limited diagnostics.

شاملة والتكلفة الفعالة لمختبر مراقبة فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز : قدوة الأفريقية

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest، طريقة نقطة الاستخدام للكشف عن الفيروسات في عينات المياه

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...