עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הממשלה הספרדית &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (פרויקט AGL2008-05275-C01/ALI), על ידי האיחוד האירופי למחקר Framework 7 פרויקטים במימון VIROBATHE (חוזה מס &#39;513648), VIROCLIME (חוזה מס&#39; 243923 ) ועל ידי הסוכנות קטלאנית של מים, Agència Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departament דה קונטרול אני Millora dels Ecosistemes Aquatics. במהלך המחקר פיתחו מרתה Rusiñol היה בחור של ממשלת קטלאנית &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. ריכוז של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף ומיזוג של דגימות מים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מינימום של 2 משכפל של L 10 לדגימה במכלי פלסטיק עם תחתית שטוחה דגימה אחת נוספת כמו בקרת תהליך. מדגם זה האחרון יהיה ממוסמר עם כמות ידועה של חלקיקים נגיפיים לשמש מלאה. הערה: מומלץ יש חומר מיוחד נפרד (בקבוקים, צינור וכו &#39;) עבור דגימות ממוסמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקת כיול של conductimeter ו לכייל מחדש במידת הצורך. הכן בקרה שלילית על ידי שימוש במי ברז מותאם בעבר מוליכות מספיק (ראה להלן 1.6) באחד מיכל פלסטיק תוספת 10 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות ממוסמר: הוסף נפח סטנדרטי של הנגיף השליטה (כ -10 5 עותקים בגנום לכל 10 ליטר מים) המדגם. מערבבים מתיזים על ידי ערבוב הימנעות ו אירוסולים. שולטת חיובי יכול להכיל בזן נדיר של adenovirus such כמו HAdV-35 או bacteriophage כגון MS2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם מציג כמות גבוהה של חומר מושעה (חול או חומרים אחרים), תן לו משקעים במשך 15 דקות. מעבירים את המים לתוך מיכל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של המדגם מים 3.5 (± 0.1) על ידי תוספת של 1 N HCl. שלב זה חשוב לצורך ריכוז של וירוסים, כדי לוודא את רמת החומציות הותאם כראוי. מערבבים את המים באופן יסודי על ידי בחישה נמרצת תוך הוספת HCl. (הערה: אם רמת ה-pH נמוך מ 3.5 להוסיף 1 M NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המוליכות. אם המדגם יש המוליכות של 1500 μS / ס&quot;מ ומעלה, שלב זה אינו נחוץ. אם מוליכות נמוכה מ 1500 μS / cm היווצרות חומר flocculated (flocs) אינו מובטח כך להתאים את מוליכות אל μS 1500 / cm על ידי תוספת של מלחי ים מלאכותי (Sigma). מערבבים נמרצות על ידי ערבוב תוך הוספת מלחי הים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא ה-pH של דגימות לפני ואחרי מיזוג כמו גםs נפח HCl בשימוש. מוליכות צריך גם להיות מוקלט לאחר התאמת ה-pH. תמיד לחטא את ה-pH-מטר conductimeter האלקטרודות בתמיסת HCl טריים, טיהרת עם פתרון של 10% tiosulphate נתרן ולבסוף לשטוף עם מים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חלב מראש flocculated רזה 1% (PSM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את כיול מכשירי pH meter לבין conductimeter ו לכייל מחדש במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מראש flocculated פתרון חלב דל שומן (1% PSM, w / v) על ידי המסת 10 גרם אבקת חלב דל שומן (Difco) ב 1 ליטר מי ים מלאכותי (להמיס 33.3 גרם של מלחי ים מלאכותי L 1 של מי ברז החיטוי dechlorinated ו) ו בקפידה כדי להתאים את ה-pH 3.5 עם HCl 1N. Flocs צריך להיות גלוי. הכן את הפתרון ממש לפני לשמש או לאחסן ב 4 ° C למשך 24 ח עבור dechlorination להשתמש 1 מ&quot;ל של תמיסת tiosulphate 10% 100 מ&quot;ל מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתתה של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל של PSM 1% ל מדגם 10-L המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את דגימות עבור 8-10 שעות, כדי לאפשר וירוסים כדי לספוג את flocs. השתמש טיימר כיבוי כדי בחישה לאחר 8-10 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את ערבוב ולתת משקעים flocs על ידי כוח הכבידה של 8-10 ח </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מחדש המסת flocs. צנטריפוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות משאבה peristaltic ו פיפטה פלסטיק מחוברת צינורית פלסטיק. לקבלת דוגמיות ממוסמר supernatant צריך להיות נאסף לתוך בקבוק וחיטוי פי נהלים פנימיים. בכל המקרים לא לדאוג לאסוף את גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף משקעים עם flocs (כ 500 מ&quot;ל) לתוך בקבוק צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאזן את הסירים על ידי תוספת של 3.5 pH PSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הסירים בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב XG 8000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. ברגע צנטריפוגות מפסיק, להסיר בזהירות את הסירים צנטריפוגה מ בצנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד gently לשפוך וישאירו supernatant. עקבו האמצעים המתאימים לחומר זיהומיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ&quot;ל של חיץ פוספט לפרק את גלולה בבקבוק כל צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר flocs כבר מומס, למדוד ולהוסיף למאגר פוספט להגיע בנפח כולל של 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize להתרכז ויראלי ידי vortexing ולהפיץ את 10 מ&quot;ל לתוך microtubes נקי שאמור להיות קפוא ב -80 ° C עד צורך בניתוח נוסף. </li></ol></li></ol> 2. חומצות גרעין ממוצא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיצוי חומצות גרעין עם ערכת QIAamp נגיפי RNA מיני הבאים הוראות היצרן. ערכה זו מאפשרת את השימוש של פלטפורמת אוטומטי (כגון Qiacube, Qiagen). </li></ol> 3. PCR כמותי של adenoviruses האנושי (HAdV), polyomaviruses JC (JCPyV), adenoviruses חזירי (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות של עותקים בגנום בדגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיןתמהיל qPCR באזור נפרד נקי באמצעות TaqMan הסביבה PCR מיקס מאסטר 2x (Applied Biosystems). התגובה מתרחשת צלחת תגובה 96-אופטי היטב מכוסה מכסה דבק אופטי. ריכוזים של מיקס מאסטר, primers ואת בדיקות מתוארים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לערבב הוכן, 15μl aliquot לתוך זה גם כולל את הפקדים (ראה 3.2). הנפח הכולל של תגובה אחת אחרי תוספת של היעד יהיה 25μl (לערבב 15μl + מדגם 10μl או רגילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את גרעין חומצה עקירות מן דגימות (10μl) באזור נפרד. הפעלה ישירה דילול של פי עשרה בתוך מים מטוהרים מדגם כל כפולים. מכסים את הבארות המכיל את הדגימות עם חלק לכסות דבק, לשמור את החלק השני של השער לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף דילולים של תקן ה-DNA השעיות (10μl) מ GC/10μl 0-10 6 10 על ידי בשלושה עותקים ושימוש micropipette בשימוש בלעדי של סטןגודארד DNA. מומלץ להוסיף תקנים באזור מצויד קרינת UV להשמדת DNA פלסמיד ולנקות את micropipette לאחר כל שימוש. מכסים את הבארות המכיל את הסטנדרטים עם כיסוי מראש לחתוך את הדבק. הערה: כדי להכין השעיות תקן לשמש כימות של עותקים בגנום, באזור ה-DNA היעד צריך להיות משובטים לתוך פלסמיד ו - לינארית. בשנת לכתובת הבאה תמצאו נוהל מפורט על איך ליצור עקומות רגיל עם תבניות DNA פלסמיד לשמש qPCR: <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את qPCR למערכת נאותה בחירת הפרמטרים המתאימים (בהתחשב בשימוש לכסות דבק ואת הנפח הכולל של כל טוב, וכו &#39;). הפעלה בעקבות הזהב AmpliTaq עבור 10 דקות בשעה 95 ° C, 40 מחזורים של הגברה מבוצעות כדלקמן: 15 זה על 95 מעלות צלזיוסו 1 דקות ב 60 ° C עבור HAdV, JCPyV ו BPyV, ו 15 שניות על 95 ° C, ה -20 בשעה 55 ° C ו -20 ב 60 ° C עבור PAdV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובות הושלמו, נתונים לאחסן תוצאות כמתואר במדריך למשתמש של הציוד שבשימוש. כמות ה-DNA יוגדר החציון של נתונים המתקבלים לאחר תיקון גורם לדילול בעת הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקרות חיוביות ושליליות. Assay חייב לכלול אחד או יותר שאינם תבנית שליטה (NTC) כדי להוכיח את תערובת אינו מייצר פלואורסצנטי. מומלץ להפעיל את בקרת תהליך חיובי על מנת להעריך את פוטנציאל עיכוב אנזימטי בשל מעכבי נוכח דגימות למד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא בתוצאות של מבחני qPCR שני דילולים שונים של ה-DNA רגיל מן לשלוט על התהליך. השתמש בתוצאות כדי להכין תרשימי בקרה על בקרת איכות (QC) תוכניות הקשורות הרגישות והיעילות של מבחני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישורתוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות חיוביות ניתן אישור נוסף באמצעות רצף מקוננות-PCR ו נוקלאוטיד של amplicons, הפקת נתונים נוספים על רצפי נוקליאוטידים של זנים זיהה 1,5,6,7,9,12. </li></ol></li></ol> בעקבות ההליך המתואר, וירוסים אדם ובעלי חיים שזוהו לכמת במימי ים, ים ומים הנהר 2,3. כדוגמה מייצגת, מי התהום דגימות מאזורים להציג רמות גבוהות של חנקות הוערכו על מנת להגדיר את מקורות הזיהום. עשרה ליטר מים דגימות נאספו 4 בארות שונים באזורים כפריים של אזור בצפון מזרח ספרד. חמש משכפל נאספו לשכפל כל אחד לשלומו seeded עם adenovirus האדם 2 משמש שליטה בתהליך. דוגמאות עובדו על פי פרוטוקול מיוצג באיור 1. ארבעת משכפל ניתח אחד מארבעת האתרים למד הראו תוצאות חיוביות עבור PAdV (ממוצע ערך 7.72 4x10 GC / L) אשר יהיה קשור לנוכחות של slurries חזיר באזורים הסובבים את האתר הדגימה יתמכו זיהום צואתי חזירי כמקור של חנקות במי התהום (טבלה 2). 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. נוהל איתור וכימות של וירוסים במים. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="טבלה 1" /> טבלה 1. ריכוז primers ו בדיקות עבור מבחני qPCR. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="לוח 3" /> טבלה 2. איתור וכימות של adenoviruses החיה האנושית polyomaviruses בדגימות מי התהום. מספר n של משכפל ניתח אחוז% מכלל חיובי משכפל (-) לא מזוהה

<ol>
	<li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission.">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li><li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li><li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool.">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment.">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment.">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li><li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR.">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li><li>de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Mart&#237;n, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination.">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li><li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses.">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li><li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water.">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li><li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand.">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li></ol>

שתי בקשות פטנט שהוגשו בשנת 2009 כדי להגן על הקניין הרוחני של פרוטוקולים כימות PAdV ו BPyV.

<html> ההליך המתואר היו מקיימים את התנאים של שיטה מתאים שגרתי במעבדות בריאות הסביבה והציבור: לשחזור, אמינה, פשוטה וחסכונית. פרוטוקול היא פשוטה, אך היא חייבת להיות מלווה בזהירות. מוליכות נמוכה בדגימות מבלי להוסיף את הריכוז המבוקש של מלחי ים מלאכותי יהיה להפחית באופן דרמט?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> צנטריפוגות מהירות גבוהה (8000 XG) </td><td> Berckman קולטר </td><td> אוואנטי J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> ה-pH מטר, מדחום conductimeter </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות פלסטיק 100-200 ס&quot;מ אורך </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי סיים pipettes הפנויה </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות פלסטיק סטרילית של 1.5 מ&quot;ל ו - 10-15 (Eppendorf, פלקונס, וכו &#39;) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה סירים (500 מ&quot;ל) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Stirrers מגנטיים מגנטים (אחד לכלהמדגם) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> מיכלי זכוכית או פלסטיק בעל תחתית שטוחה כדי לאפשר את השימוש stirrers מגנטי </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> משאבה peristaltic להסרת supernatant (או משאבת מים סילון ואקום) </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> טיימר כיבוי כדי בחישה לאחר 8-10 שעות </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית (1N ו 0.1N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> מלאכותית ים מי ים ומלחים </td><td> סיגמא </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> חלב נטול שומן (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט חיץ pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 01:02 v / v סטרילית של Na 2 HPO 4 0,2 M ו לאא 2 PO 4 0,2 M ב-pH 7.5 </td></tr><tr><td> Thiosulphate </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> הפוך את פתרון 10% מים </td></tr><tr><td> QIAamp נגיפי RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> 96, גם התגובה בצלחת אופטי (500 יחידות) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> מכסה דבק אופטי (100 יחידות) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan הסביבה PCR מיקס מאסטר 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses

זיהום מיקרוביאלית של הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי. קלאסי אינדיקטורים צואתי חיידקי הראו שיש מגבלות משמעותיות, וירוסים הם עמידים יותר בפני תהליכי איון הרבה אינדיקטורים צואה רגילה לא להודיע ​​על מקור הזיהום. פיתוח חסכונית שיטות ריכוז של וירוסים ממים מבחני מולקולרית מקלה את הישימות של וירוסים כאינדיקטורים לזיהום צואתי ו חיידקים כמו מעקב אחר המקור (MST) כלים. Adenoviruses ו polyomaviruses הם נגיפי DNA מדביק בעלי החוליות כולל בני אדם ספציפיים, ומופרשים בצואה בהתמדה ו / או שתן בכל האזורים הגיאוגרפיים למד. במחקרים קודמים, הצענו כימות adenoviruses האנושי (HAdV) ו polyomaviruses JC (JCPyV) על ידי ה-PCR כמותי (qPCR) כאינדקס של זיהום צואתי אנושי. לאחרונה, פיתחנו מבחני qPCR עבור כימות מסוים של porcine adenoviruses (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV) כסמנים של זיהום צואתי חיה עם רגישויות של עותקים בגנום 1-10 לכל מבחנה. במחקר זה, אנו מציגים את והנוהל לזהות את מקור הזיהום בדגימות מים באמצעות כלים אלה. כדוגמה נציג של תוצאות, ניתוח של וירוסים במים הקרקע הצגת רמות גבוהות של חנקות מוצג. איתור של וירוסים במים מזוהמים נמוך או בינוני דורש ריכוז של וירוסים מ לפחות כמה ליטרים של מים לתוך נפח קטן בהרבה, הליך שבדרך כלל כולל שני שלבים ריכוז בסדרה. זו פרוצדורה מסורבלת במקצת ואת השתנות נצפתה החלמה ויראלי משמעותי בסל עיבוד בו זמני של מספר גדול של דגימות המים. על מנת למנוע את צוואר הבקבוק נגרמת על ידי שני שלבים נהלים יישמנו פרוטוקול צעד אחד שפותח studie הקודםs ו החלים על מגוון של מטריצות מים. ההליך כולל: החמצה של עשרה ליטר דגימות מים, הפתתה על ידי חלב דל שומן, שקיעה הכובד של חומרי flocculated, אוסף של המשקע ו צנטריפוגה, resuspension של המשקע במאגר פוספט 10 מ&quot;ל. להתרכז ויראלי משמש להפקת חומצות גרעין ויראליות ואת adenoviruses ספציפיים polyomaviruses של הריבית על ידי לכמת qPCR. מספר גבוה של דגימות עשוי להיות מנותח בו זמנית בשיטה זו עלות נמוכה ריכוז. הנוהל הוחל על ניתוח של מי ים, מי ים ומים הנהר במחקר זה, אנו מציגים תוצאות ניתוח דגימות מי התהום. שיטה זו תפוקה גבוהה כמותי אמין, פשוט, וחסכוני.

Watch this Scientific Journal Video about Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses at JoVE.com

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

cost-effective-method-for-microbial-source-tracking-using-specific

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Statistics

Immunology and Infection

Unit 1

Control Charts

SCIENTISTS IN ACTION

12.1K Views.  University of Barcelona. המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

Video: Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Comprehensive &amp; Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical large scale diagnostic testing. In the low-income countries inexpensive ART has transformed the prospects for the survival of HIV seropositive patients but there are doubts whether there is a need for the laboratory monitoring of ART and at what costs - in situations when the overall quality of pathology services can still be very low. The appropriate answer is to establish economically sound services with better coordination and stricter internal quality assessment than seen in western countries. This video, photographed at location in the National Health Laboratory Services (NHLS-SA) at the Witwatersrand University, Johannesburg, South Africa, provides such a coordinated scheme expanding the original 2-color CD4-CD45 PanLeucoGating strategy (PLG). Thus the six modules of the video presentation reveal the simplicity of a 4-color flow cytometric assay to combine haematological, immunological and virology-related tests in a single tube. These video modules are: (i) the set-up of instruments; (ii) sample preparations; (iii) testing absolute counts and monitoring quality for each sample by bead-count-rate; (iv) the heamatological CD45 test for white cell counts and differentials; (v) the CD4 counts, and (vi) the activation of CD8+ T cells measured by CD38 display, a viral load related parameter. The potential cost-savings are remarkable. This arrangement is a prime example for the feasibility of performing &gt; 800-1000 tests per day with a stricter quality control than that applied in western laboratories, and also with a transfer of technology to other laboratories within a NHLS-SA network. Expert advisors, laboratory managers and policy makers who carry the duty of making decisions about introducing modern medical technology are frequently not in a position to see the latest technical details as carried out in the large regional laboratories with huge burdens of workload. Hence this video shows details of these new developments.

Anti-retroviral therapy to treat HIV/AIDS is monitored in South Africa on a large scale. Flow cytometry is combined for haematology (CD45), immunology (CD4) and viral-load linked CD38 assay. Recorded at NHLS-SA laboratories, Johannesburg, these modern methods are cost-efficient with heightened local internal quality control, serving as role-models for resource-limited diagnostics.

מקיף &amp; עלות מעבדה ניטור יעיל של HIV / איידס: מודל לחיקוי אפריקה

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...