وأيد هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF، P20619 P22988 لوBZ).

إعداد نموذج الميكروويف بمساعدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء إعداد العينات يحتاج المرء لبرنامج نسيج الميكروويف التلقائي للمعالج المجهر الإلكتروني (لايكا EM AMW؛ ايكا مايكروسيستمز، فيينا، النمسا) مع البروتوكولات التالية (الجدول 1) لإعداد عينة بمساعدة الميكروويف لTEM: <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="الجدول 1" /> الجدول 1. بروتوكول لإعداد العينات باستخدام أشعة الميكروويف. وتظهر أعمدة مختلفة (من اليسار إلى اليمين): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد فيال (فيال NR.) يمثل الترتيب الذي يتم تحميل فيال في دائري من المعالج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة من العملية الفعلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف في قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مدة الخطوة الفعلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> درجة الحرارة العظمى التي تم التوصل إليها في القارورة قبل تشغيل أشعة الميكروويف قبالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الميكروويف الإعداد التشعيع: incre المستمر = درجة الحرارة السريعبورصة عمان، وعقد درجة حرارة مجموعة؛ المنحدر = ارتفاع درجة الحرارة لطيف، ودرجة الحرارة النهائية تم التوصل إليها في الغاية؛ نابض = ارتفاع درجة الحرارة السريع، والسلطة، إيقاف حتى انخفضت درجة الحرارة 5 درجات مئوية، والسلطة، استأنفت لتصل إلى درجة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقصى قوة أشعة الميكروويف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طازجة الحلول لمختلف الخطوات الموضحة في نموذج إعداد بروتوكول (لراتنج الايبوكسي آجار 100 انظر 1.7)، وملء لهم في قارورة المعينة وفقا لبروتوكول المبرمجة (الجدول 1)، تحميل قوارير على دائري، ثم إدراج دائري في الميكروويف المعالج الأنسجة، وأخيرا تحميل القارورة لأول مرة في غرفة أحادية النمط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أجزاء صغيرة من أوراق (1MM 2) من تبغ نيكوتيانا المصابين بفيروس موزاييك التبغ (TMV) مع شفرة حلاقة على النمذجة لوحة الشمع في قطرة من غلوتارالدهيد 3٪ (آجار العلمية المحدودة، ستانستيد، انكلترا) في سورنسن 60mM الفوسفات العازلة (درجة الحموضة 7.2) في درجة حرارة الغرفةerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع مع ملاقط غرامة على الفور في سلال المعينة مع عرض شبكة من 200μm تقريبا. كومة من سلال على رأس كل منهما الآخر وإدراجها في غرفة أحادية النمط. يجب توخي الحذر التي يتم تناولها باستمرار مع عينات حل مثبت أثناء التحميل والتراص من سلال بحيث لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المبرمجة سابقا الميكروويف إعداد العينات بمساعدة بروتوكول للجفاف، وتثبيت التسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين يتم تنفيذ إعداد العينات تلقائيا باستخدام الميكروويف المعالج الأنسجة تواصل مع تلطيخ السلبية مع المواد النباتية المتبقية كما هو موضح في القسم 3 (تلطيخ السلبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طازجة الراتنج الايبوكسي آجار 100 من خلط المكونات التالية كما هو موضح: التعبئة 24G آجار 100، 16G أنهيدريد السكسينيك dodecenyl، و 10 أنهيدريد الميثيل ز نادك (لجميع مكونات انظر آجار العلمية المحدودة، ستانستيد، انكلترا) في كوب من البلاستيك، والحرارة إلى40 ° C ويخلط جيدا. إضافة 1.2G ثنائي ميثيل أمين من البنزيل ومزيج دقيق. الراتنج الايبوكسي ملء أجار 100 في البلمرة المعينة تشكل قبل بروتوكول إعداد العينات إلى نهايته (على سبيل المثال أثناء الخطوة 22 في الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من البروتوكول (بعد الخطوة 22 في الجدول 1) الإفراج عن سلال تحتوي على عينات مكدسة تسللوا الى البلاد من دائرة أحادية النمط في القارورة الأخيرة من دائري. إزالة دائري من الجهاز الميكروويف، unstack سلال وتحميلها باستخدام ملاقط غرامة في أشكال البلمرة المعينة. يجب توخي الحذر دائما أن يتم تغطية العينات مع الراتنج الايبوكسي آجار 100 اثناء التحميل وunstacking بحيث لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كومة من أشكال البلمرة على رأس كل منهما الآخر. يجب توخي الحذر دائما أن يتم تغطية العينات مع الراتنج الايبوكسي آجار 100 اثناء التحميل والتراص بحيث لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قارورة كانت تستخدم في السابق من دائري من TISS ميكروويفرق المعالج، تحميله مع سلال مكدسة وإدراج دائري في الميكروويف المعالج الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء البلمرة بروتوكول المبرمجة سابقا (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين يتم تنفيذ البلمرة من تلقائيا باستخدام الميكروويف المعالج الأنسجة، دراسة شبكات الملون سلبا مع ناقل حركة المجهر الالكتروني [مثل فيليبس CM10 TEM، الاتحاد الدولي للفروسية (سابقا فيليبس)، ايندهوفن، هولندا] وإجراء تحليل الصور كما هو موضح في الباب 3 و 4 ( تلطيخ السلبية وتحليل الصور). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من إزالة أشكال البروتوكول البلمرة من غرفة أحادية النمط، unstack الأشكال وإزالة البلمرة بلمرة الكتل التي تحتوي على عينات. وهم الآن على استعداد ليكون مقطوع مع مشراح. </li></ol> 2. تقليم وتقطيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج واحد أو أكثر من كتل منفصلة في أصحاب عينة لتقطيع سامسونج مع العينة على الخلاف حول 1CM الأعلى من حامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تقليم مع كتلة الانتهازي العينة لTEM (مثل لايكا رايشرت Ultratrim؛ ايكا مايكروسيستمز) بحيث وجه كتلة من الحد الأقصى. 1MM في الطول والعرض في 200μm الذي يحتوي على أكبر قدر ممكن ورقة المواد يتحقق (حجم كتلة وجه قد تحتاج إلى تعديل لحجم السكين الماس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم كتلة مع مشراح مستدق (مثل لايكا رايشرت Ultracut S؛ ايكا مايكروسيستمز) باستخدام سكين الماس بزاوية 45 درجة بسكين من (مثل Diatome الترا 45، Gröpl، مدينة Tulln، النمسا). ينبغي تعديل سمك الباب إلى حوالي 70 إلى 90nm وسرعة القطع يجب أن يكون حول 1MM / ثانية. التقاط مقاطع متعددة مع (آجار العلمية المحدودة) formvar المغلفة النحاس أو النيكل 200 شبكة سلكية مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وصمة عار الأقسام على الشبكة مع سترات الرصاص (آجار العلمية المحدودة؛ 1.1g سترات الرصاص المذاب في الماء المقطر 42ml مزدوجة وهيدروكسيد الصوديوم 1N 8ML) لمدة 5 دقائق في طبق بتري مليئة جزئيا مع هيدروكسيد الصوديوم لإنشاء CO 2-مجانا البيئة وعن 15 ميلnutes مع خلات اليورانيل 1٪ (آجار العلمية المحدودة) الذائب في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. شبكات غسل بالماء المقطر لمدة 1 دقيقة في كل خطوة بين ما بعد تلطيخ. تجفيف الهواء في شبكات مربع الشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة المقاطع مع ناقل حركة المجهر الإلكتروني (مثل فيليبس CM10 TEM، الاتحاد الدولي للفروسية، ايندهوفن، هولندا). </li></ol> 3. تلوين سلبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد عن 100mg من TMV المصابين وإعداد المواد ورقة النسغ الخام من المواد المجانسة لمدة 2 دقيقة مع شفرة حلاقة على شريحة المجهر في 100μl من الفوسفات عازلة 60mM Søfrensen (الرقم الهيدروجيني 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20μl من الناتج جناسة على أول بئر من المجهر الشريحة تفلون المغلفة مع 4 أو أكثر الآبار (بدلا من أن من الممكن أيضا لنقل جناسة على قطعة من parafilm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شبكة formvar المغلفة على رأس جناسة مع الجانب (آجار العلمية المحدودة) formvar المغلفة يواجه نحو الانخفاض وincuخفض صوته لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشبكة 2 مرات لمدة 2 دقيقة في كل طريق وضع الشبكة على أعلى نقطتين من 60mM 200μl العازلة الفوسفات سورنسن (الرقم الهيدروجيني 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشبكة لمدة 1 دقيقة مع حمض الطازجة الفسفوتنغستيك 2٪ (آجار العلمية المحدودة) في حل الفوسفات عازلة 60mM سورنسن (الرقم الهيدروجيني 6.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشبكة والسماح لها الهواء الجاف في صندوق الشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة الشبكة مع انتقال المجهر الإلكتروني (مثل فيليبس CM10 TEM؛ الاتحاد الدولي للفروسية، ايندهوفن، هولندا). يستغرق على الأقل 10 صور من اختيارها عشوائيا virions الملون سلبا (على الأقل 10 أو أكثر virions يجب أن تكون مرئية على كل صورة) مع انتقال المجهر الالكتروني في التكبير الرئيسي لل21000X أو أعلى. يجب الحرص على أن يكون كل الصور التكبير نفسه. </li></ol> 4. تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس طول وعرض لا يقل عن 100 موقع سكني بطريقة عشوائية جزيئات الفيروس واحد على micrographs مأخوذة منالعينات الملون سلبا باستخدام أي جهاز كمبيوتر تحليل البرمجيات صورة [مثل خلية D (أوليمبوس، الحياة وعلم المواد أوروبا المحدودة، هامبورغ، ألمانيا) مع أداة تحليل الجسيمات أو Optimas 6.5.1-(وسائل الإعلام علم التحكم الآلي شركة في بيثيسدا، ميريلاند، USA)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الوسائل والانحرافات المعيارية من أجل تحقيق متوسط ​​طول وعرض تصور جزيئات الفيروس بطرق سلبية وتلطيخ TEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة طول وخصائص التركيبية (التي تم الحصول عليها في 2.5) ذات أحجام من الفيروسات والتعديلات الناجمة عن الأمراض التركيبية فيروس يعرف في الأدبيات من أجل تحديد بوضوح الأمراض الفيروسية. </li></ol> 5. ممثل النتائج: يمكن بعد إعداد نموذج الميكروويف بمساعدة التعديلات التي يسببها TMV نموذجية التركيبية مثل ملاحظتها مناطق واسعة تحتوي على virions الانحياز في شكل متواز مع انتقال المجهر الالكتروني في العصارة الخلوية من Nicotian المصابةوالخلايا تبغ (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، في النسغ الخام من TMV المصابين يترك ويمكن ملاحظة الجسيمات TMV كما flexuous هياكل على شكل قضيب، وبعد تلطيخ السلبية (الشكل 1B). كشف تحليل الصور من جزيئات الفيروسات 100 حجم متوسط ​​TMV من 280nm في الطول والعرض في 17nm (الشكل 2). تم العثور على التركيب الدقيق في TMV المصابين وحجم الخلايا من virions لوحظ في هذه الدراسة أن تكون وفقا للخصائص التي يسببها TMV التركيبية في التبغ، ومجموعة من الجسيمات حجم TMV ذكرت سابقا في الأدب 9-15. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الرقم انتقال الإلكترون 1. micrographs من الخلايا المصابة ورقة TMV وvirions. A) الصورة تبين التركيب الدقيق للخلايا المصابة TMV أوراق تبغ نيكوتيانا من نسيج الورقة المتوسط ​​بعد الميكروويف بمساعدة محطة إعداد العينات. لاحظ مساحة واسعة من virions موازية الانحياز التي تراكمت في العصارة الخلوية.C = بلاستيدات الخضراء مع النشا (القديس)، M = الحبيبات الخيطية، N = النواة، V = فجوة، بار = 2μm. B) الصورة تظهر virions التي تم الكشف من قبل تلطيخ السلبية في النسغ من الأوراق المصابة. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الحجم النسبي من virions. توزيع نسبي طول وعرض TMV-الجسيمات بعد تلطيخ السلبية النسغ من الأوراق المصابة لأنها ظهرت في المجهر الإلكتروني. تم حساب قيم متوسطة (يعني طول / عرض ± الانحراف المعياري) من 100 virions.

<ol>
	<li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Microscopy. , (1999).</li><li>Kuo, J., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+plant+tissues+for+ultrastructural+study.">Processing plant tissues for ultrastructural study.</a> Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. 369, 47-65 (2007).</li><li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-assisted+tissue+processing+for+sameday+EM-diagnosis+of+potential+bioterrorism+and+clinical+samples.">Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples.</a> Micron. 37, 577-590 (2006).</li><li>Webster, P., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-assisted+processing+and+embedding+for+transmission+electron+microscopy.">Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. 369, 47-65 (2007).</li><li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+assisted+rapid+plant+sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy.">Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 233, 258-268 (2009).</li><li>Ler&#237;a, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation,+using+dedicated+hardware,+minimizing+heat-related+effects.">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li><li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy.">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).</li><li>Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+polymerisation+with+microwave+irradiation+for+transmission+electron+microscopy.">Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy.</a> Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).</li><li>Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectric+spectroscopy+of+tobacco+mosaic+virus.">Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).</li><li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+force+microscopy+study+for+the+assembly+structures+of+tobacco+mosaic+virus+and+their+size+evaluation.">An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation.</a> Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).</li><li>Milne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplication+of+tobacco+mosaic+virus+in+tobacco+leaf+palisade+cells.">Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells.</a> Virology. 28, 527-532 (1966).</li><li>Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tobacco+mosaic+virus+strains+on+the+ultrastructure+of+tobacco+leaf+parenchymal+cells.">Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells.</a> Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).</li><li>Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., F&#228;ndrich, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+a+fresh+look+at+tobacco+mosaic+virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus.</a> J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications.">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li><li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases.">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li><li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy:+a+four-hour+protocol.">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد ثبت الميكروويف عينة النبات بمساعدة استعدادا لTEM لتوفير بيانات التركيبية سريعة وموثوق بها في غضون ساعات قليلة 3،4،16. كان الحفاظ غرامة الهيكلية للعضيات والأغشية تحقيق مع الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة مشابهة لعينات التقليدية وcryofixed 5،15 مع الاستفادة من انخفاض كبير في تثبيت العينة وتضمينها الوقت من 3 أيام أو أكثر إلى حوالي 2 ساعة. هذا يمثل أسرع إعداد بروتوكول للعينة TEM المتاحة حاليا في الأدب. الطريقة الموضحة في هذه الدراسة جنبا إلى جنب الميكروويف عينة النبات بمساعدة استعدادا لTEM مع أساليب تلطيخ السلبية التي سمحت تحديد واضح وسريع من TMV الناجم عن التغيرات التركيبية وكيل الفيروسية نفسها. يمكن التحقيق TMV التعديلات التي يسببها التركيبية بعد التشذيب، وتقطيع آخر تلطيخ داخل حوالي 4 ساعات بعد بداية التثبيت في نقل كهربائيترون المجهر. باستخدام عينة بالكامل إعداد وضع تلقائيا الافراج عن الباحث لإجراء تلطيخ السلبية في هذه الأثناء من أجل تحديد حجم وعرض وكيل الفيروسية. وهكذا، يمكننا أن نستنتج أن هذا الأسلوب يسمح للتشخيص واضح وسريع من الأمراض الفيروسية النباتية في يوم واحد نحو نصف وهو أمر ذو أهمية كبيرة لاستخدامها في المستقبل في تجارب الزراعة والعلمية في أمراض النبات النبات. كما يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتشخيص السريع للحيوان والأمراض التي تصيب الإنسان لديها إمكانيات كبيرة لتطبيقها في المستقبل في علم الأمراض الطبية والبيطرية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / معدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> غلوتارالدهيد </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> الأزميوم رابع أكسيد </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> أجار 100 الراتنج </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> السكسينيك أنهيدريد Dodecenyl </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> الميثيل أنهيدريد نادك </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> بنزيل ثنائي ميثيل أمين </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> يؤدي سترات </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> اليورانيل خلات </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> حمض الفسفوتنغستيك </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> أجار العلمية المحدودة </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> لايكا EM AMW </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td></td><td></td></tr><tr><td> لايكا (رايشرت) Ultratrim </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td></td><td> أحدث نموذج متاح </td></tr><tr><td> لايكا (رايشرت) Ultracut S </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td></td><td> أحدث نموذج متاح </td></tr><tr><td> Diatome الترا 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> فيليبس CM10 TEM </td><td> الاتحاد الدولي للفروسية (فيليبس سابقا) </td><td> &lt;/ TD&gt; <td> أحدث نموذج متاح </td></tr><tr><td> خلية D </td><td> OLYMPUS شركة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td> وسائل الإعلام علم التحكم الآلي وشركة </td><td></td><td> أحدث إصدار متاح </td></tr></tbody></table>

microwave assisted rapid diagnosis of plant virus diseases by transmission electron microscopy

التحقيقات من التغييرات التي تحدثها الفيروسات التركيبية وغالبا ما تكون ضرورية لتحديد بشكل واضح الأمراض الفيروسية في النباتات. مع إعداد العينات للفحص المجهري الإلكترون التقليدي انتقال (TEM) مثل هذه التحقيقات يمكن أن يستغرق عدة أيام 1،2 و بالتالي فهي غير مناسبة لتشخيص السريع للأمراض النباتية الفيروس. ويمكن استخدام الميكروويف لتثبيت خفض كبير مثال لوقت التحضير للتحقيقات TEM مع نتائج مماثلة التركيبية كما لوحظ بعد إعداد العينات تقليديا 3-5. العديد من مختلف الأجهزة المخصصة الميكروويف التي تتوفر حاليا والتي يمكن استخدامها لتثبيت ناجحة وتضمينها من العينات البيولوجية للتحقيقات TEM 5-8. في هذه الدراسة أن نبرهن على فيروس موزاييك التبغ (TMV) إصابة النباتات تبغ نيكوتيانا أنه من الممكن لتشخيص التغيرات التركيبية في الأوراق في يوم واحد نحو نصف الميكروويف باستخدام إعداد نموذج لمساعدة TEM. لقد اخترنا لتنفيذ هذه الدراسة مع جهاز الميكروويف المتاحة تجاريا لأنه يؤدي إعداد العينات تقريبا بالكامل تلقائيا 5 في عكس الأجهزة الأخرى المتاحة حيث لا يزال العديد من الخطوات التي يتعين القيام بها يدويا هي 6-8 وبالتالي مزيد من الوقت والمستهلكة العمل. كما يمكن إعداد العينات يتم تنفيذ كامل تلطيخ السلبية تلقائيا من الجسيمات الفيروسية في العصارة من الأوراق المتبقية TMV المصابين وفحص التركيب الدقيق ليلي وحجم إجراء التثبيت وخلال التضمين.

Watch this Scientific Journal Video about Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

هذه الدراسة توضح الأسلوب الذي يسمح للتشخيص السريع والواضح من الأمراض الفيروسية النباتية في يوم واحد نحو نصف باستخدام مزيج من الميكروويف بمساعدة محطة إعداد العينات للفحص المجهري الإلكتروني النافذ والأساليب تلطيخ السلبية.

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

microwave-assisted-rapid-diagnosis-plant-virus-diseases-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  University of Graz. هذه الدراسة توضح الأسلوب الذي يسمح للتشخيص السريع والواضح من الأمراض الفيروسية النباتية في يوم واحد نحو نصف باستخدام مزيج من الميكروويف بمساعدة محطة إعداد العينات للفحص المجهري الإلكتروني النافذ والأساليب تلطيخ السلبية.

Video: Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

التشخيص السريع لفيروس انفلونزا الطيور في الطيور البرية : استخدام لPCR - RRT المحمولة والكواشف تجميد المجفف في الميدان

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

تحليل إمكانية الوصول المذيبات من بقايا السيستين على<em&gt; الذرة rayado فينو فيروس</em&gt; الفيروسات مثل الجزيئات التي تنتج في<em&gt; نيكوتيانا benthamiana</em&gt; النباتات والصليب ربط-من الببتيدات لVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

عالية الدقة المجهر الإلكتروني ل<em&gt; هيليكوباكتر بيلوري</em&gt; CAG النوع الرابع إفراز نظام بيلي المنتجة في ظروف مختلفة من توافر الحديد

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

منهجيات لدراسة<em&gt; B. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

بروتوكولات للتحقيق في توزيع الأنسجة المضيف، نقل واسطة، وتأثير ذلك على الرشاقة المضيف من Densovirus في دودة اللوز القطن

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

مضادات الميكروبات التآزر التجارب التي تدعمها الطابعة النافثة للحبر الصفيف الشطرنج الآلي وقتل الوقت الأسلوب اليدوي

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...