ويدعم العمل في المختبر من قبل قوات الامن الوطني (MCB0919933) ، والمعاهد الوطنية للصحة (GM088790).

1. مقايسة الجذع جزء التجدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التغذية لفيف من الديدان لمدة لا تقل عن 5 أيام قبل الفحص لضمان التجدد الحيوانات خالية من النفايات والمواد الغذائية المستهلكة (~ 30 الديدان سليمة ، كل دودة ~ 80-10 مم في مرحلة ما بعد الموت جوعا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الفحص ، وشطف مسبقا المجمدة طبق الجليد تعادل مع المياه وتغطية سطح مستو المثلج مع غلاف بلاستيكي. باستخدام الملقط ، مكان واحد ورقة تصفية على غلاف بلاستيكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلل ورقة الترشيح مع بضع قطرات من مياه الينابيع. نقل planarians على تصفية (&lt;20 الديدان لكل مرشح) باستخدام ماصة نقل. ويمكن تعديل أوضاعها الديدان على التصفية ، إذا اقتضى الأمر ، مع المزيد من المياه repipetting الربيع. إزالة السوائل الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط ، بتر رأسه مرة واحدة من قطع منتصف الطريق تقريبا بين قمة الأمامي من الحيوان ونهاية الأمامي من البلعوم (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط ، بتر منطقة الذيل من قبل مرة واحدة من قطع تقريبا في منتصف الطريق بين ذيل الحيوان ونهاية الخلفي من البلعوم (الشكل 1A). إزالة المخاط الزائد على مشرط باستخدام منشفة ورقية مبللة الايثانول 70 ٪ بعد عدة قطاعات. يمسح الايثانول الزائدة من مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عن طريق تصفية ملقط في طبق بيتري (100 × 25mm العمق) التي تحتوي على مياه الينابيع. انتظر ~ 3 دقائق (لإغلاق الجرح ، يمكن ملاحظتها من قبل معسر وسواد الجرح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شظايا الجذع من ورق الترشيح في طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​المطلوب للمقايسة التجدد ونقلها إلى الحاضنة thermostatted (24 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمط الظاهري درجة التجدد بعد أسبوع 1 ~ ، عندما هياكل المجددة يمكن تمييزها (الشكل 1A). </li></ol> 2. الدوائية التلاعب التجدد : القطبية الثنائية التي تحدثها البرازيكوانتيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البرازيكوانتيل (PZQ) الأسهم المخدرات في solubilizing DMSO (62.4mg PZQ في 1mL عن الأسهم 200MM). استخدامها في نفس اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 50mL من المخدرات التي تحتوي على حل (90 PZQ ميكرومتر) في الأملاح Montjuch مخزنة. دوامة لمدة دقيقة 1 ~ لضمان التشتت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء فحص الجذع جزء التجدد على النحو المفصل أعلاه [البروتوكول رقم 1] ، وفضح لفيف من الجذع إلى شظايا PZQ في الخطوة النهائية [1،7]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24-48 ساعة ، وتبادل PZQ التي تحتوي على وسائل الإعلام لمياه الينابيع ، وغسل الديدان عديدة (&gt; 3) مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى حاضنة الديدان. درجة الاستقطاب الثنائي (اثنان من الرؤساء ، 1B الشكل) بعد أسبوع واحد القطع. </li></ol> 3. التلاعب الجيني للتجديد : المجراة بروتوكول التغذية رني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الفحص ، وإعداد الدجاج جناسة الكبد. تجاهل والأصفر الدهنية المقاطع الملونة من foodstock ، وبوريه الكبد المتبقية. تصفية بوريه من خلال مصفاة شبكة وتعليق قسامة للتخزين (1.5mL أنابيب ، -20 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الفحص ، وإعداد البقري خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) من خلال العرض aliquoting في عينات 1mL وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الديدان لرني. وتستخدم ثلاثة أفواج : الجينات في المصالح ، والسيطرة الايجابية (الجينات مع النمط الظاهري رني المعروفة ؛ الشكل 1C ، D &amp; E) والسلبية التحكم (مع عدم وجود جينات النمط الظاهري رني ، مفيدة أيضا لتقييم مستويات ضربة قاضية مقارنة مع الأتراب التجريبية). لكل فوج ، واستخدام الديدان ~ 250 (~ 80-10 ملم بعد فترة طويلة من الجوع ما لا يقل عن 5 أيام). تخزين المياه في فصل الربيع في حوض من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل سهم الفوج رني ذوبان الجليد ، من التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة كولاي استهداف الجينات في المصالح [8] ، جنبا إلى جنب مع أنبوب جناسة كبد الدجاج [3،1] ، وأنبوب من كرات الدم الحمراء [3،2]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه البكتيريا (13،000 غرام ، 1 دقيقة). إزالة وطاف بيليه resuspend في وسائل الإعلام 2xYT (~ 700μl). Recentrifuge ، تجاهل طاف ، بيليه مكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء كبيرة تحمل الطرف ماصة P200 بقطع نهاية الحافة. resuspend بدقة بيليه البكتيرية في خليط من الدجاج جناسة الكبد (150 ميكرولتر) وكرات الدم الحمراء (50 ميكرولتر) لإنشاء رني مزيج التغذية. إزالة فقاعات الهواء عن طريق الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتغذية ، وإزالة معظم الماء من الحوض البلاستيك تحتوي على الديدان (إجازة ~ عمق 1 بوصة). الحوض دوامة التركيز الديدان في مركز هذه الحاوية ، وماصة مزيج التغذية رني في دائرة احتضان الديدان. استخدام ماصة نقل بعناية لاقناع الهاربين ليعيدوه الى مزيج التغذية رني دون تكدير بالرواد أخرى! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الرضاعة (~ 1 ساعة) ، وتحديد planarians التي تتغذى بشكل جيد. هذه الديدان تظهر تلوين أحمر عميق من كرات الدم الحمراء بلعها. تجاهل الآخرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال بعناية التغذية حل مع مياه الينابيع العذبة ، والحد من الاضطرابات لمنع ابتراز من المواد الغذائية. للقيام بذلك ، توطين بلطف الديدان إلى جانب واحد من أنبوب نقل باستخدام ماصة ، تتدفق المياه العكرة ، واستبدال بعناية مع سكب المياه العذبة باستمرار على الجدار المقابل للحوض. planarians Resubmerge بأسرع وقت التعرض لفترة طويلة في الهواء ايضا في نتائج ابتراز الغذاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضفاضة حد ذاتهابن غطاء الحاوية والعودة إلى الحاضنة (24 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر رني بروتوكول التغذية على مدى دورات متعددة (~ 2-3 أيام بعيدا) ، تتخللها دورات التجدد [بروتوكول # 1] للكشف عن الظواهر رني. ويرد بروتوكول قياسي لتغذية وتجديد فعالة لجينات كثيرة في الشكل 2 ، والتي تأخذ في الشهر ~ 1 المدة الإجمالية. </li></ol> تعديل هذا النظام لجينات مختلفة ، وبروتوكول الأمثل سوف يعتمد على عوامل مثل الاستقرار مرنا والتطويع اللغوي الأنسجة ، perdurance البروتين ، أو وضع النمط الظاهري الذي يحول دون تغذية دورات متعددة بعد التجديد. تقييم مستويات ضربة قاضية لمجرد فحص بواسطة انتفاذ من النمط الظاهري (إذا كان واضح) ، أو عن طريق نهج qPCR لمقارنة مستويات مستهدفة مرنا مع أتراب السيطرة السلبية. 4. ممثل النتائج : تجديد جزء مقايسة جذع قوي مثل الديدان وينبغي أن كل تجديد مع (&#39;الرأس الى الذيل&#39;) العادي الأمامي الخلفي قطبية. يمكن أن يكون سجل هذا في أقرب وقت بعد خمسة أيام من القطع ، التي سهلت ظهور eyespots الأمامي (asterixed ، الشكل 1A). ومع ذلك ، واستعادة كامل للهياكل شكلية فقد تحدث بعد أسبوع واحد. التلاعب الدوائية للتجديد جزء الجذع بواسطة PZQ الاستسلام برأسين الديدان (1B الشكل) هو أيضا قوية (EC 50 = 87 (+ --) 11 ٪ شظايا القطبين ، 70μM PZQ لمدة 48 ساعة 20). الثنائية القطبية يحدث أكثر من دورة واحدة على التجدد. أقل فعالية في هذه المقايسات المرجح أن يتصل مع قضايا المخدرات والذوبان / أو تخزين ، أو استخدام أنواع مختلفة حيث PZQ دودة مسطحة غير فعالة. على المخدرات مع انخفاض انتفاذ ، وغالبا ما يستخدم مؤشر anteriorization ليسجل الظواهر وسيطة من 22 جانبا القطبية الثنائية كاملة. وترد الظواهر الناتجة عن رني بنيات مراقبة إيجابية في الشكل 1 : [رني من ستة Dugesia تفرضه اليابان 1 (د ي ستة - 1) ينتج النمط الظاهري بلا عيون 23 (الشكل 1C) ، [رني من PC2 Dugesia تفرضه اليابان (DJ - PC2) ينتج عن ذلك خسارة للاستجابة النفور من الضوء 24 (1D الشكل) ورني من Dugesia تفرضه اليابان βcatenin - 1 (DJ - βcatenin - 1) النتائج في النمط الظاهري برأسين 16-19 ، و 21 شظايا من الجذع (الشكل 1E). ويمكن تحقيق هذه الظواهر باستخدام بروتوكولات رني البسيطة التالية : DJ ستة - 1 (FFxFx) ، DJ - PC2 (FFFx) ، DJ - βcatenin - 1 (FFxFx) ، حيث F = دورة التغذية و x = دورة التجدد على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 :... مقايسة جذع تجديد جزء من اليسار ، صورة من مستورقة (أعلى) والتخطيطي (وسط) لإظهار موقع يستأصل جزء الجذع إلى اليمين ، timecourse التجدد جزء الجذع تظهر مظهر جزء تجديد في بعض الأحيان وأشار (أيام) B صورة برأسين مستورقة التي تنتجها التعرض PZQ جيم &quot;بلا عيون&quot; الدودة التي تنتجها دي جي ستة - 1 [رني ملطخة D فقدان استجابة النفور في ضوء متحرك الديدان رني DJ - PC2 (الحمراء الملطخة) ، مقارنة ب دودة التحكم المحمول (. الأخضر). E القطبين مستورقة التي تنتجها DJ - βcatenin - 1 [رني. في BE ، نهاية الأصلي الأمامي من الديدان رني يتجه إلى اليسار. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : تسلسل التغذية والقطع دورات لبروتوكول نموذجي رني تضم عدة رضعات (F) ، ودورات التجدد (س) التي هي فعالة لضربة قاضية في العديد من الجينات D. تفرضه اليابان. قد تكون هناك حاجة لتعديل هذا البروتوكول عن الجينات الفردية لتحقيق نتائج أفضل ، على سبيل المثال باستخدام. أقل (قوسين) أو عدد أكبر من الدورات والتغذية التجدد

<ol>
	<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata.">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch Entwm Org. 7, 364-397 .</li><li>Robb, S. M., Ross, E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmedGD:+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database.">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).</li><li>Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+in+planarian+regeneration.">Emerging patterns in planarian regeneration.</a> Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).</li><li>Adell, T., Cebri&#224;, F., Sal&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+in+Planarian+Regeneration+and+Homeostasis.">Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Agata, K., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+aspects+of+planarian+regeneration.">Molecular and cellular aspects of planarian regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).</li><li>Newmark, P. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+needed+for+regeneration,+stem+cell+function,+and+tissue+homeostasis+by+systematic+gene+perturbation+in+planaria.">Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria.</a> Dev Cell. 8, 635-649 (2005).</li><li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians.">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).</li><li>Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+Reveal+a+Role+for+Peptide+Hormones+in+Planarian+Germline+Development.">Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development.</a> PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+the+central+nervous+system:+how+easy+for+planarians!.">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!.</a> Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).</li><li>Mineta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs.">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).</li><li>Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Model+Organisms.">Emerging Model Organisms.</a> A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).</li><li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians:+translations+to+mammals.">Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals.</a> Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).</li><li>S&#225;nchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+specifically+disrupts+gene+expression+during+planarian+regeneration.">Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).</li><li>Gurley, K. A., Rink, J. C., S&#225;nchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+defines+head+versus+tail+identity+during+planarian+regeneration+and+homeostasis.">Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis.</a> Science. 319, 323-327 (2008).</li><li>Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Hedgehog/Patched+establishes+anterior-posterior+polarity+by+regulating+Wnt+signaling.">Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).</li><li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration.">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li><li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Sal&#243;, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians.">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li><li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2++channel+beta+subunits:+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity.">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li><li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration.">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li><li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration.">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li><li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Djeyes+absent+(Djeya)+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1.">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li><li>Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+planarian+central+nervous+system+(CNS)+revealed+by+neuronal+cell+markers.">Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers.</a> Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصف البروتوكولات هنا المقايسات لدراسة التفاصيل والتلاعب تجديد Dugesia مستورقة تفرضه اليابان. فهي بسيطة ولا تتطلب مثل هذه المعدات المتخصصة التي يمكن أن أدوا بسهولة في المختبر أو في الفصول الدراسية. يمكن إجراء فحوصات بشكل فردي أو مجتمعة (للصناعات الكيماوية الفحص الجيني للefficacies المخدرات في الجسم الحي) ، ويمكن أداؤها على مستوى الجينات المرشحة ، أو هي قابلة للتكيف مع غير منحازة ، وفحص أعلى إنتاجية 8. سواء لدراسة علم الأحياء للفضول من planarians في حد ذاتها ، أو لتقييم وظيفة في الجسم الحي من المتماثلات الثدييات في نموذج بديل لدراسة تجديد الأنسجة ، ويجب أن تحفز هذه النهج الفائدة من مجموعة متنوعة من الباحثين.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> بائع </th><th> رقم كتالوج </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> مياه الينابيع </td><td> Kandiyohi. قسط شركة مياه مينيابوليس ، مينيسوتا </td><td> ن / أ </td><td> أشكال أخرى من مياه الينابيع تعمل بشكل جيد أيضا. الأول في المقايسات صلاحية المحاكمة. </td></tr><tr><td> 1 × مخزنة أملاح Montjuïch : كلوريد الصوديوم (1.6mM) ، CaCl2 (1MM) ، MgSO4 (1MM) ، MgCl2 (0.1mM) ، بوكل (0.1mM) ، NaHCO3 (1.2mM) ، HEPES (1.5mM). 7.4 درجة الحموضة في 24 درجة مئوية. </td><td> متعددة البائعين </td><td> ن / أ </td><td> الاصطناعي للمياه لعلاج المخدرات خلال فحوصات التجدد لضمان التخزين المؤقت الحموضة. حل 08/05 Holtfreter هو بديل. </td></tr><tr><td> 2xYT مرق </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP2467 - 500 </td><td> وسائل الإعلام = 31 غ / ل. تعقيمها. </td></tr><tr><td> طبق بتري (100x25mm) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 08-757-11 </td><td> الديدان المساكن خلال دورات تجديد </td></tr><tr><td> صحن مربع (100x100x15mm) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 08-757 - 11A </td><td> ملء مع الماء ، علبة الجليد لتجميد تستخدم دودة سطح القطع </td></tr><tr><td> الحوض البلاستيك : Ziploc تويست &#39;ن لوك (16oz). </td><td> مختلف تجار التجزئة </td><td> ن / أ </td><td> صهاريج المياه مريحة ضيق لأفواج رني </td></tr><tr><td> الدجاج الكبد </td><td> بقالة تجارية </td><td> ن / أ </td><td> وانحياز واشنطن لوازم العضوية ، نظرا لتجنب المضادات الحيوية. </td></tr><tr><td> ومن ناحية خلاط </td><td> أي مطبخ المورد </td><td> ن / أ </td><td> استخدامه لصنع معجون كبد الدجاج </td></tr><tr><td> شبكة الأسلاك 1MM مصفاة </td><td> أي مطبخ المورد </td><td> ن / أ </td><td> استخدامها لتوتير هريس الدجاج الكبد </td></tr><tr><td> البقري خلايا الدم الحمراء </td><td> Lampire المختبرات البيولوجية </td><td> 7240807 </td><td> 100 ٪ وغسلها المجمعة RBC تعليق </td></tr><tr><td> تصفية أوراق دائرية </td><td> Whatman # 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> نقل الماصة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> العقيمة ، شفرات جراحية </td><td> متعددة الباعة </td><td> ن / أ </td><td></td></tr><tr><td> ± الدواء </td><td> سيغما الدريتش </td><td> P4668 </td><td> aliquots مسحوق مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية. يجفف. </td></tr><tr><td> DJ ستة - 1 </td><td></td><td> بنك الجينات AJ557022.1 </td><td> رني إيجابية للسيطرة النمط الظاهري &quot;العين أقل&quot; (23) </td></tr><tr><td> DJ - βcatenin - 1 </td><td></td><td> بنك الجينات AB181913.1 </td><td> رني السيطرة الإيجابية التي ترأسها لمدة 17 النمط الظاهري </td></tr><tr><td> DJ - PC2 </td><td></td><td></td><td> رني مراقبة إيجابية عن خسارة النمط الظاهري ضوء النفور 24 </td></tr></tbody></table>

pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian dugesia japonica

الديدان المفلطحة مستورقة حرة المعيشة لديهم تاريخ طويل من الاستخدام التجريبي نظرا لقدراتهم على التجدد ملحوظة 1. شظايا صغيرة استئصاله من هذه الحيوانات خطة إصلاح الجسم الأصلي بعد تجديد هياكل الجسم في عداد المفقودين. على سبيل المثال إذا تم قطع جزء أ &quot;الجذع&quot; من دودة سليمة ، &#39;رئيس&#39; جديد وتجديد الأمامية و&quot;الذيل&quot; سيتم تجديد خلفي استعادة الأصلي الاقطاب &quot;من الرأس إلى الذيل&quot; لهياكل الجسم قبل بتر (الشكل 1A). والدافع التجدد بواسطة الخلايا الجذعية مستورقة ، والمعروفة باسم &#39;neoblasts&quot; التي تفرق في ~ 30 أنواع مختلفة من الخلايا خلال توازن الجسم الطبيعي والقسري تجديد الأنسجة. هذه العملية هي التجدد قوية وسهلة في التظاهر. وقد تم الآن نظرا لتفاني مختبرات رائدة عدة ، العديد من الأدوات والأساليب الوراثية وظيفية الأمثل لهذا النظام النموذجي. وبالتالي ، فقد تم إحراز تقدم كبير في الآونة الأخيرة الفهم والتلاعب في الأحداث الجزيئية التي تقوم عليها اللدونة التنموية مستورقة 2-9. سيقوم النظام نموذج مستورقة تكون ذات فائدة لمجموعة واسعة من العلماء. للعلماء الأعصاب ، والنموذج يتيح الفرصة لدراسة تجديد نظام العصبي بأكمله ، بدلا من مجرد. إعادة نمو / إصلاح عملية الخلايا العصبية واحد التي عادة ما تكون محور الدراسة في العديد من النماذج القائمة Planarians أعرب عدد كبير من الناقلات العصبية 10 ، تمثل نظاما هاما لدراسة تطور الجهاز العصبي المركزي 11 و 12 و السلوكية المحتملة والفرز 13 و 14. التجدد نتائج قابلة للتلاعب من جانب apparoaches والدوائية الجينية. على سبيل المثال ، يمكن فحص المخدرات للآثار على التجدد ببساطة عن طريق وضع أجزاء الجسم التي تحتوي على المخدرات في حلول في نقاط زمنية مختلفة بعد البتر. ويمكن دراسة دور الجينات الفردية باستخدام أساليب ضربة قاضية ([رني في الجسم الحي) ، والتي لا يمكن أن يتحقق إما من خلال دورات microinjection أو عن طريق تغذية البكتريا ، وأعرب يبني الرنا المزدوج الجديلة 8 ، 9 ، 15. يمكن أن تنتج كلا النهجين الظواهر ضرب بصريا في انتفاذ عالية من أجل التجديد ، ومثال على الحيوانات القطبية الثنائية 16-21. لتسهيل اعتماد هذا النموذج وتنفيذ مثل هذه الأساليب ، عرض علينا في هذه المقالة بروتوكولات الفيديو لفحوصات والدوائية الجينية (في الجسم الحي عن طريق تغذية رني) باستخدام Dugesia مستورقة تفرضه اليابان.

Watch this Scientific Journal Video about Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica at JoVE.com

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

نموذج لدراسة جاذبية تمايز الخلايا الجذعية داخل الحيوانات الحية هي دودة مسطحة مستورقة. هو درس تجارب التجديد التي بتر بسيطة التي يتم تنفيذها بسهولة في المختبر الأساسية وقابلة لل(والدوائية الجينية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رني) التلاعب على النحو الذي فصله البروتوكولات في هذه المقالة.

فحوصات الوراثية الدوائية وظيفية للتلاعب تجديد مستورقة Dugesia تفرضه اليابان</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

pharmacological-functional-genetic-assays-to-manipulate-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

36.7K Views.  University of Minnesota Medical School. نموذج لدراسة جاذبية تمايز الخلايا الجذعية داخل الحيوانات الحية هي دودة مسطحة مستورقة. هو درس تجارب التجديد التي بتر بسيطة التي يتم تنفيذها بسهولة في المختبر الأساسية وقابلة لل(والدوائية الجينية في الجسم الحي رني) التلاعب على النحو الذي فصله البروتوكول?...

Video: Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

الضوء / الظلام لاختبار الانتقال الفئران

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

قشري الخلايا العصبية : الانتقال من التقدم في مختبر لخلية القاعدة العلاجات

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

زائد المتاهة مرتفعة على الفئران

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

تجميد مستورقة، التشعيع جزئي، والنسج

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...