وأيد هذا العمل من خلال منحة من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (المشروع BiGRUDI [بي جي ologische efahrenlagen : R isikobewertung ، ش ltraschnelle D etektion اوند أنا dentifizierung فون bioterroristisch relevanten Agenzien ، 13N9594]). نشكر باء Diemar (شاريتيه - Universitätsmedizin برلين ، ومعهد FÜR Pharmakologie) للحصول على مساعدة فنية ممتازة.

1. بروتوكول -- IGY الاستخراج عن طريق الربط بين هطول الأمطار التين. 1 يعطي الرسم التخطيطي للإجراءات استخراج IGY (انظر الجدول 2). وكان أول وصف للبروتوكول في Polson وآخرون. 1980. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام قفازات مطاطية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشققة بعناية قشر البيض وصفار نقل الى &quot;ملعقة صفار&quot; من أجل إزالة الكثير من البيض والبيض ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينقل إلى ورقة صفار تصفية وتدحرجت لإزالة ما تبقى البيض ، ثم يتم قطع الجلد مع صفار مبضع أو صك مماثل (ماصة الحافة). يتم صب صفار في أنبوب 50 مل ويتم تسجيل حجم البيضة (V1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف مرتين يختلط حجم صفار البيض من برنامج تلفزيوني مع (ΣV1 + V2) الصفار ، 6000 بعد ذلك PEG 3.5 ٪ (في غرام ، المسحوق) من حجم التداول الكلي وvortexed ، تليها 10 دقيقة يلف على خلاط المتداول. ان خطوة من هذا الإجراء استخراج يفصل التعليق على مرحلتين. مرحلة واحدة تتكون من &quot;المواد الصلبة والمواد الدهنية صفار&quot; (الاقتباس الأصلي Polson وآخرون 1980) والتي تحتوي على بروتينات المرحلة مائي IGY وغيرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطرد الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (10،000 دورة في الدقيقة وفقا ل13000 XG ، هيراوس Multifuge 3SR + ، الدوار الزاوية الثابتة). يسكب طاف (V3) من خلال مرشح مطوية ونقل إلى أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف 8.5 ٪ PEG 6000 في غرام (محسوبة وفقا لحجم جديد) إلى أنبوب ، وتدحرجت على vortexed خالط المتداول كما في الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4 مع فارق أن يتم تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوب بعناية بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل عن طريق العصا والزجاج وvortexer. إضافة إلى برنامج تلفزيوني الحجم النهائي من 10 مل (V4). خلط حل مع 6000 PEG 12 ٪ (W / V ، 1.2 غرام) ويعامل كما في الخطوة 3 (الدوامة ، خلاط المتداول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 6 و حل بيليه بعناية في 800 برنامج تلفزيوني ميكرولتر (زجاج العصا والدوامة). انتظر أن تختفي فقاعات الهواء ومن ثم نقل (ماصة) لاستخراج الكبسولات لغسيل الكلى. شطف الأنبوب مع 400 برنامج تلفزيوني ميكرولتر وإضافة الصوت إلى جهاز غسيل الكلى (V5). (للحصول على إعداد أجهزة غسيل الكلى والأغشية انظر الملحق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو dialysed استخراج المياه المالحة في أكثر من ليلة 0.1 ٪ (1600 مل) ، وأثار بلطف عن طريق مغناطيسي. في صباح اليوم التالي ، يتم استبدال المالحة بواسطة برنامج تلفزيوني وdialysed لمدة ثلاث ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك يتم سحبها IGY ، مستخرج من الكبسولة غسيل الكلى بواسطة ماصة ونقل إلى أنابيب 2ml. الحجم النهائي هو حوالي 2 مل (V6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس نسبة البروتين (ملغ / مل) من عينات photometrically في 280 نانومتر (1:50 المخفف مع PBS) وتحسب وفقا للقانون لامبرت مع معامل البيرة انقراض 1.33 لIGY (انظر الشكل رقم 2) ، والشكل . 4 يبين نوعية التحضير (النقاء والانتعاش حوالي 80 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المستحسن لتخزين العينات في aliquots في -20 درجة مئوية (لا تجميد العينات في -70 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل نوعية التحضيرات النهائية بسيطة SDS - PAGE كما هو موضح في البروتوكول إن الرب <a href="http:/www.jove.com/details.php?id=1916">http:/www.jove.com/details.php؟id=1916</a> </li></ol> 2. التذييل ، قبل استخدامه يجب أن يكون مستعدا لحقيبة غسيل الكلى بالطريقة التالية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع أكياس الغسيل الكلوي في 20 قطعة من 30 سم وبالنظر في الدورق الزجاجي 2000 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إضافة 1750 مل من EDTA - 5 مم الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع قمع زجاجي فوق الحقائب لضمان تغطية أكياس من حل EDTA. يتم تسخين المحلول والمغلي لمدة 5 دقائق (لوحة الساخنة). ويصب في الحل ، ويتم غسل أكياس ثلاث مرات بالماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى يتم إضافة 1750 مل EDTA محلول مغلي لمدة 5 دقائق ويغسل ثلاث مرات بالماء المقطر على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا مغلي أكياس الغسيل لمدة 10 دقيقة في ماء مقطر وتخزينها في 4 درجات مئوية. إخراج أكياس الغسيل الكلوي بواسطة ملاقط معقمة. </li></ol> 3. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. رسم تخطيطي لاستخراج - IGY عن طريق الترسيب البولي ايثيلين جلايكول وفقا لتوصيف الأصلي Polson وآخرون. 1980. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">لعرض صورة أكبر حجما انقر هنا.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تنمية IGY المجموع في صفار البيض والدجاج في الاعتماد تحصينهم من العمر. معين هو يعني الأسبوعية من مجموع البيض / IGY و SD (ن = 4 الدجاج البياض). من [وآخرون بولي. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. Layiنانوغرام رصد قدرة أربع دجاجات تحصين مع مستضدات مختلفة. الأسهم تشير إلى تاريخ التحصين (من [وآخرون بولي. 2009]). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">انقر لعرض صورة أكبر هنا.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. بولي أكريلاميد - Gelelectrophoresis الاستعدادات IGY الفرد من البيض تحت مختلف الظروف الحد أعدت عينات IGY مختلفة كما هو موضح في البروتوكول -- حارة 1 -- الوزن الجزيئي علامة ، لين 2 -- IGY قياسي ، لين 3-5. هذه هي التحضيرات النهائية وفقا للخطوة 10 من البروتوكول. HC -- السلاسل الثقيلة ، LC -- chaines الخفيفة ،؟ -- الشوائب البسيطة الموافق الوزن الجزيئي حوالي 35 كيلو دالتون (وربما جزء من محطة C - II vitellogenin السلائف ، [Klimentzou وآخرون ، 2006.]). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td> الدجاج 21 (أ مستضد) </td><td> الدجاج 22 (A مستضد) </td><td> الدجاج 19 (B المستضد) </td><td> الدجاج 23 (C مستضد) </td></tr><tr><td> عدد البيض (IGY الكل) 1 و 2 سنوات الفترة </td><td> 625 (38 ز) </td><td> 626 (38 ز) </td><td> 545 (33 ز) </td><td> 608 (37 ز) </td></tr><tr><td> عدد البيض (IGY الإجمالي) ، السنة الأولى </td><td> 345 (20 ز) </td><td> 304 (16 ز) </td><td> 326 (18 ز) </td><td> 308 (17 ز) </td></tr><tr><td> عدد البيض (IGY الإجمالي) ، السنة الثانية </td><td> 280 (18 ز) </td><td> 322 (21 ز) </td><td> 219 (15 ز) </td><td> 300 (20 ز) </td></tr><tr><td> ٪ من الحد الأقصى. عدد ممكن البيض (السنة الأولى) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> ٪ من الحد الأقصى. عدد ممكن البيض (السنة الثانية) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> عدد البيض المصنعة </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> ويتم احتساب مبلغ 1 IGY مجموع بضرب عدد من البيض بنسبة قيمة يعني ملغ من البروتين بنسبة 60 في البيض وفقا لبيانات الشكل 2. (2) كحد أقصى. عدد ممكن بيضة سنويا هو 325 وفقا لمعلومات من مربي. الجدول 1. عامين إحصاءات القدرة البيض من الدجاج مع تحصين مستضدات مختلفة. وضع القدرات في المئة من الحد الأقصى لأربع دجاجات بعد التحصين مع مستضدات مختلفة فضلا عن IGY نتائج خلال سنتين (انظر أيضا الشكل 3) ، [بولي آخرون 2009]). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> البيض العدد. </td><td> الدجاجة العدد. وضع تاريخ </td><td> V1 [مل] صفار </td><td> V2 [مل] PBS </td><td> 1. PEG PREC. [ز] </td><td> المجلد [مل] بعد </td><td> 2. PEG PREC. [ز] </td><td> كرية </td><td> 3. PEG PREC. [ز] </td><td> كرية </td><td> المجلد [مل] </td><td> مجموع ملغ من البروتين / مل </td><td> إجمالي البروتين تصحيح ملغ / مل </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 V2 + </td><td> 3،5 ٪ [ث / V] ΣV1 V2 + </td><td> PREC. ، centrif. والترشيح V3 </td><td> 8،5 ٪ [ث / V] V3 </td><td> الذائب في برنامج تلفزيوني مل V4 </td><td> 12 ٪ [ث / V] V4 </td><td> الذائب في برنامج تلفزيوني مل V5 </td><td> بعد غسيل الكلى ضد V6 PBS </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml : 1.33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22،10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1.58 </td><td> 31 </td><td> 2.63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35.0 </td><td> 26.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23،10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1.37 </td><td> 25 </td><td> 2.12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28.8 </td><td> 21.6 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. البروتوكول المثالي لهطول الأمطار PEG

<ol>
	<li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain.">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li><li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins:+a+review.">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li><li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h., Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly,+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li><li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+laying+capacity,+immunoglobulin+Y+concentration,+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period.">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li><li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens.">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li><li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , (2001).</li><li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li><li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies.">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li></ol>

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها الفراء Landesamt Gesundheit برلين Soziales اوند (0069/03 ه).

ويتأثر اختيار الطريقة المناسبة التي IGY تنقية نطاق تنقية (المختبرية أو الصناعية) ، وفعالية التكاليف ، والتكنولوجيا (معدات المختبرات) ، وتأثيرها على البيئة (إدارة النفايات). وتم استعراض مختلف أساليب الاستخراج IGY بالتفصيل Meulenaer دي &amp; هيوغيبارت (2001 ، للمراجعة وانظر أيضا شايد وآخرون 2005). بصفة عامة ، يمكن تقسيم هذه الطرق إلى ثلاث مجموعات رئيسية هي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أساليب الأمطار : تشمل الأمونيوم كبريتات الصوديوم أو ، polyethyleneglycol (PEG) ، وحمض الكابريليك وcaragenean. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكروماتوغرافي : طرق التقارب اللوني ، ايون اللوني الصرف ، مسعور اللوني التفاعل اللوني thiophylic التفاعل ، وهلام اللوني الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفائق. </li></ol> ويمكن زيادة نقاء استعدادا IGY عن طريق مزيج من الأساليب ، على سبيل المثال ، يمكن الجمع بين الربط مع هطول الأمطار اللوني تقارب. في بعض الحالات ، اعتمادا على التطبيق النهائي ، واستخراج المياه من IGY غير كافية لتحقيق نتائج جيدة (اكيتا وناكاي 1993). ووفقا لخبرتنا ، عملت IGY عينة نحصل بواسطة الربط بين هطول الأمطار بشكل جيد جدا في الكثير من المقايسات المناعية المختلفة. عن طريق توحيد أسلوب الربط بين هطول الأمطار ومساعد تقني قادر على معالجة ما يقرب من 84 بيضة في الأسبوع ، وهو ما يعادل مبلغ IGY الإجمالي بين 4 و 7 غ في الأسبوع. عملية حسابية بسيطة : هو تحصين وضع الدجاجة مع المستضد. بعد زيادة التحصينات القليلة الدجاجة تنتج الأجسام المضادة المحددة (آب) مع من عيار 1:50،000 خلال فترة 30 يوما. 30 بيضة × 2 مل IGY استخراج (انظر البروتوكول والشكل 3) يناظر مجموع IGY 60 مل ، والذي بدوره يتوافق مع AB - تمييع 3000 لتر (قدرة دلو هو 10 لتر) ، وهذا يعني مع 3000 لتر يمكن حل آب تملأ 300 الدلاء. بذلك ، في ضوء مثل هذه الكمية الضخمة ، أب أنه لا توجد مشكلة لتخزين AB - تجمع ثابت من الجودة والنوعية. هذا الأسلوب يقلل من التباين تهمة / الكثير لاحظ ذلك في آب polyspecific. على الرغم من الجانب الكمي ، IGY أب لها مزايا إضافية بالمقارنة مع مفتش الثدييات : لا تكمل تفعيل نظام الثدييات ، وليس عبر التفاعل مع حماة (الأجسام المضادة البشرية المضادة الماوس) ، والعوامل البشرية المفاصل أو مستضدات فئة الدم (نقص heteroagglutinins). ميزة المعلقة IGY ، أب هي المسافة النشوء والتطور ما يسمى. المسافة النشوء والتطور هو السبب وراء الاختلافات ووصف كثير من الأحيان بين الخصوصيات آب من الثدييات والطيور ، حتى عندما تحصين مماثل. بالإضافة إلى الاختلافات بين الثدييات والطيور النظام المناعي أنفسهم ، والاختلافات في التنمية النشوء والتطور في هذه الفئات الحيوانية two يساهم في آب خصوصيات مختلفة. وذكرت العديد من الكتاب أن الدجاج غالبا ما تنتج عبس ضد بروتينات عالية phylogenetically الثدييات الحفظ أو الببتيدات أكثر كفاءة من القيام الأرانب (انظر شايد للمراجعة وآخرون (أ) 2005). ونتيجة لذلك ، يمكن للمستضد الحفظ تظل &quot;ملثمون&quot; للنظام المناعي الأرنب ، وتتسبب بالتالي سوى ضعف أو &quot;صامتة&quot; الاستجابة. وعلاوة على ذلك ، إذا تم تلقيح الدجاج والأرانب والثدييات مع المستضد نفسه ، كثيرا ما تستجيب الدجاج مع خصوصية - آب نادرا ما يمكن أن يتحقق في الأرانب. أيضا جانب من جوانب رفاه الحيوان مهمة منذ آب جراحية غير قابلة للاستخراج من صفار البيض. بالاشتراك مع التحصين (البلازميد) الجينات بندقية IGY الإنتاج تماما غير الغازية (Witkowski آخرون 2009). في الختام ، وإنتاج الدجاج في آب وIGY الاستخراج عن طريق الربط بين التساقط جدا فعالة من حيث التكلفة والنتائج في آب محددة للغاية مع عيارات مستقرة تصل إلى 1:1،000،000. نظرا لبعد المسافة بين النشوء والتطور وأفيس Mammalia والدجاج هي قادرة على انتاج آب محددة ضد مستضدات الثدييات حفظا للغاية على عكس الأرانب على سبيل المثال. وكمية غير عادية من أب حصلت عليها IGY التكنولوجيا يفتح الباب أيضا لاستخدام IGY ، بكالوريوس في الطب البشري والطب البيطري لأغراض علاجية / وقائية.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyse Visking حقيبة ، نوع 27/32 ، قطع -14 دينار كويتي ، كارل روث محدودة ، كارلسروه ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصقر الأزرق أنابيب ماكس ، 50 مل أنبوب مخروطية مادة البولي بروبيلين ، بيكتون ديكنسون لابوار ، فرانكلين البحيرات نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطوية تصفية MN 615 ¼ ، ∅ 150 مم ، كارل روث محدودة ، كارلسروه ، ألمانيا هيراوس </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمام المغناطيسي ، Variomag مونو ، H + P LABORTECHNIK AG ، Oberschleißheim ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجزئي Dialyse - كبسولة 5،0 لتر ، كارل روث محدودة ، كارلسروه ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Multifuge 3SR + ، الحرارية العلمية ، Langenselbold ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضواء 160A للأشعة فوق البنفسجية ، شيمادزو دويتشلاند ، دويسبورغ ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البولي ايثيلين جلايكول 6000 ، دكتوراه Rotipuran يورو. كارل روث محدودة ، كارلسروه ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS - 10X الاحتياطي الممزوجة مسبقا ، روش تشخيص محدودة ، مانهايم ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأسطوانة SRT2 خلاط ، ستيوارت ، ستافوردشاير ، المملكة المتحدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vibrofix VF2 ، وJanke كونكيل ، IKA - LABORTECHNIK ، Staufen i.Br. ، ألمانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صفار ملعقة ، Fackelmann (تأثيرات أجهزة منزلية) ، وألمانيا </li></ol>

igy technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (peg) precipitation

يمكن تحصين الدجاج عن طريق التلقيح ايم (العضلة الصدرية ، اليسار واليمين ، وحجم الحقن 0،5-1،0 مل) أو عن طريق التحصين البلازميد الجينات بندقية. تعتمد على استمناع للمستضد ، وارتفاع عيارات الأضداد (إلى 1:100،000 -- 1:1،000،000) لا يمكن أن يتحقق إلا بعد واحد أو 3 -- تعزيز التحصينات 4. عادة ، دجاجة تبيض باستمرار لحوالي 72 أسابيع ، بعد ذلك يقلل القدرة على زرع. يصف هذا البروتوكول استخراج IGY من مجموع صفار البيض عن طريق إجراء هطول الأمطار (PEG. Polson آخرون 1980). الأسلوب ينطوي على خطوتين مهمتين. أول واحد هو إزالة الدهون ، والثاني هو ترسب IGY الكامل من طاف من خطوة واحدة. ويمكن بعد غسيل الكلى ضد العازلة (PBS عادة) يتم تخزين IGY ، في استخراج -20 درجة مئوية لمدة أكثر من عام. نقاء من استخراج ما يقارب 80 ٪ ، ومجموع IGY في البيض يختلف 40-80 ملغ ، تعتمد على عمر الدجاجة زرع. محتوى IGY مجموع الزيادات مع عمر الدجاجة من حوالي 40 ملغ / البيض يصل إلى 80 مغ / البيض (PEG بشأن الأمطار). القدرة زرع دجاجة سنويا حوالي 325 بيضة. هذا يعني الحصاد الكلي المحتمل للIGY 20 غ من الكل / السنة على أساس المحتوى IGY يعني من 60 ملغ مجموع البيض IGY / (أنظر الجدول 1).

Watch this Scientific Journal Video about IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation at JoVE.com

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

يصف هذا البروتوكول في مجال استخراج وبخاصة من مجموع IGY من صفار البيض عن طريق الترسيب البولي ايثيلين جلايكول ، ويعطي معلومات عامة حول التكنولوجيا IGY.

IGY التكنولوجيا : استخراج الأجسام المضادة من صفار البيض الدجاج بواسطة البولي ايثيلين جلايكول (PEG) الأمطار

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

igy-technology-extraction-chicken-antibodies-from-egg-yolk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

64.1K Views.  Robert Koch-Institute. يصف هذا البروتوكول في مجال استخراج وبخاصة من مجموع IGY من صفار البيض عن طريق الترسيب البولي ايثيلين جلايكول ، ويعطي معلومات عامة حول التكنولوجيا IGY.

Video: IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

الاعتراف ناقلة الغلوتامين البشرة بواسطة الأجسام المضادة IgA و 2 ناقلة الغلوتامين الأنسجة في حالة نادرة من القرد الجلد

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

الكشف عن الرشاشيات الرئوي الغازية في الخباثة المرضى باستخدام مكونات دم الاطراف تدفق التكنولوجيا

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

جيل من الفئران وحيدة النسيلة الأجسام المضادة بواسطة تقنية هجين

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

أسلوب لتقييم وظائف المستجيب Fc بوساطة الناجم عن الإنفلونزا هيماغلوتينين أجسام مضادة محددة

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

استخراج هيموسيتيس من اليرقات melanogaster المورفولوجية للعدوى الميكروبية والتحليل

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...