من بين تقنيات المقايسة المناعية التي تهدف إلى تشخيص المرض ، ظهر فحص حبة القياس الخلوي كنهج حساس للغاية وموثوق به ، حيث قام بتحليل آلاف الجسيمات في فحص واحد. إن الدقة العالية لقياس التدفق الخلوي ، إلى جانب التكلفة المنخفضة لخرز اللاتكس ، تجعل تقنيتنا قابلة للتطبيق لتحليل أدوات المقايسات المناعية ، مثل الأجسام المضادة والمستضدات. الأجسام المضادة IgY لها تكلفة منخفضة ، والمزايا الأخلاقية في إنتاجها ، ويمكن استخدامها كأداة للكشف عن الأمراض النادرة.
ابدأ بغمر البيض الطازج أو البالغ من العمر أربعة أيام ، من سلالة جالوس جالوس ديكل البيضاء ، في محلول مخفف بنسبة 0.2٪ من هيبوكلوريت الصوديوم. شطفها بسرعة تحت الماء الجاري ، وامسح بلطف. كسر البيض بعناية ، وفصل صفار البيض عن الأبيض بمساعدة فاصل صفار البيض.
وقم بإزالة اللون الأبيض الزائد باستخدام ورق الترشيح. بيرس صفار البيض ، وجمع الداخلية في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. قم بتخزين صفار البيض في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
بعد إذابة صفار البيض المخزن ، قم بتخفيفه بنسبة واحد إلى 10 في برنامج تلفزيوني واحد مليمول. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى خمسة ، باستخدام حمض الهيدروكلوريك العادي ، واحتضان المحلول عند أربع درجات مئوية لمدة ست إلى 24 ساعة. قم بطرد المحلول عند 3000 جرام لمدة 40 دقيقة ، وقم بتصفية المادة الطافية المستردة باستخدام مرشح السليلوز 0.7 ملم ، قبل إعادة ضبط درجة الحموضة في المادة الطافية إلى خمسة.
أضف حمض الكابريليك إلى تركيز نهائي قدره 8.7٪تحت التحريك المستمر لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد طرد العينات لمدة 15 دقيقة ، افصل المادة الطافية عن المادة المترسبة. أعد ضبط الأس الهيدروجيني للمحلول إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم المولي الواحد.
وقياس الأجسام المضادة باستخدام مقايسة برادفورد ، قبل تخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف 21 ميكرولترا من EDC ، و 21 ميكرولترا من NHS ، إلى 21 ميكرولترا من حبات اللاتكس. واضبط على الحجم النهائي البالغ 2.1 ملليلتر ، مع 10 ملليمولار PBS المصفاة.
احتضان الحل عند 22 درجة مئوية ، مع اهتزاز سريع ، لمدة ثلاث ساعات. أضف الجسم المضاد المستخرج مسبقا ، IgY PfHRP2 ، إلى أنابيب صغيرة مختلفة تحتوي على 100 ميكرولتر من هذا المحلول. واحتضان مرة أخرى لمدة 16 ساعة.
بعد طرد العينات والتخلص من المواد الطافية ، اغسل حبات اللاتكس مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS المصفى 10 مليمولار ، باستخدام دورات الطرد المركزي وإعادة التعليق. لحجب الخرز ، أعد تعليق العينات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للحجب ، واتبع نفس الإجراء الموضح سابقا لاحتضانها لمدة ساعتين. بعد غسل الخرزات باستخدام PBS ، أعد تعليقها مرة أخرى في مخزن مؤقت PBS 10 مللي مولار.
أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الفلورية المضادة للدجاج ، مخففة إلى واحد إلى 2000 في خليط 10 مليمولار من PBS و BSA ، إلى كل أنبوب صغير. احتضان العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد غسل الخرزات ، أعد تعليقها مرة أخرى باستخدام 250 ميكرولتر من 10 مليمولار PBS المصفاة.
تحديد حد الكشف عن طريق توزيع 100 ميكرولتر من مستحضر الخرزة المسدود ، في أنابيب تحتوي على كميات مختلفة من البروتين المؤتلف المخفف PfHRP2 في ثلاث نسخ. احتضان محاليل الخرزة مع البروتين عند 22 درجة مئوية ، مع الاهتزاز السريع ، لمدة ساعة واحدة. اغسل الخرزات ب 500 ميكرولتر من PBS المصفى 10 مليمولار ، مع الطرد المركزي ، كما هو موضح سابقا.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف ميكروغرام من الجسم المضاد IgG للفأر ضد البروتين المؤتلف ، المخفف في 10 مللي مولار PBS و BSA لكل عينة ، واتبع نفس الإجراء للحضانة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الفلوري المخفف المضاد للفأر إلى كل عينة. بعد الحضانة ، أعد تعليق العينة في 250 ميكرولتر من 10 مليمولار PBS المصفاة.
قم بتشغيل الكمبيوتر ومقياس التدفق الخلوي ، وانتظر بضع دقائق حتى يتصل الجهاز بالكمبيوتر. انقر فوق برنامج قياس الخلايا المثبت على الكمبيوتر وقم بتسجيل الدخول إليه. من مساحة عمل البرنامج ، حدد Cytometer ، متبوعا ببدء تشغيل Fluidics ، وأوضاع التنظيف ، و SIT Flush.
تحديد استراتيجية البوابات بناء على الخصائص المورفومترية والفلورية لجسيمات التحكم السلبية. لتحديد مورفومترية الخلية ، اختر رسم مخطط الرسم النقطي لتحليل معلمات التشتت الأمامي A باستخدام التشتت الجانبي A.حدد الخلايا المفردة عن طريق التشتت الجانبي باستخدام رسم الرسم النقطي لتحليل التشتت الجانبي W في المحور Y ، والتشتت الجانبي H في المحور X. وأوجد الخلايا المفردة عن طريق التشتت الأمامي ، باستخدام رسم الرسم النقطي ، لتحليل التشتت الأمامي W في المحور Y ، والتشتت الأمامي H في المحور X.
لتحليل التألق ، اختر مخططات مخطط نقطة FL1 باستخدام مبعثر أمامي A.استخدم أنبوب بوليسترين سدادة يحتوي على عينات غير مسماة ، وعينات تم تصنيفها مسبقا ب Alexa Fluor 488 أحادي اللون وامزج محتويات الأنبوب بعناية. قم بتوصيل الأنبوب بمسبار مقياس التدفق الخلوي ، وانقر بزر الماوس الأيسر على اكتساب. لضبط قوة الليزر ، انقر فوق المعلمات ، وفي الخيارات أدناه ، اضبط جهد المبعثر الأمامي على 182 فولت ، وجهد التشتت الجانبي على 236 فولت.
لتعيين العتبة على مقياس الخلايا ، انقر فوق عتبة ، وفي الخيارات أدناه ، اضبط FSC على 500 فولت. اضبط بوابة التحليل لتوصيف الجسيمات حسب الحجم والتعقيد ، وكذلك لإجراء تحليل خلية واحدة. قم بإزالة التألق الذاتي عن طريق تحليل العينة الخالية من الصبغة التي تحتوي فقط على حبات اللاتكس ، وضبط جهد الكاشف FL1 FITC إلى 332 فولت.
اضبط بوابة تحليل التألق بتنسيق رباعي الزوايا ، من النقطة السالبة الموضحة في الرسم البياني النقطي. بعد ضبط التحليلات المورفومترية والفلورية ، قم بتكوين الجهاز لأحداث 50،000 ، وانقر فوق تسجيل. تظهر هنا الملامح الكهربية للجسم المضاد IgY PfHRP2 ، بسبب الفصل باستخدام حمض الكابريليك.
من هذا الشكل ، يمكن ملاحظة أن الأجسام المضادة قبل وبعد فصل حمض الكابريليك أظهرت ملامح كهربائية مماثلة ، مع نطاقات مميزة من 65 كيلو دالتون و 27 كيلو دالتون ، والتي تشير إلى السلاسل الخفيفة والثقيلة من IgY. بالإضافة إلى ذلك ، هناك نطاقات أخرى مرئية أيضا ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى سلائف بروتين صفار البيض vitellogenin II ذات الجزء الطرفي C. يعد تقييم تركيز تشبع الأجسام المضادة على حبات اللاتكس أمرا حيويا لتطوير مقايسة مناعية باستخدام الخرزات.
يظهر هنا منحنى النسبة المئوية الفلورية لتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة ، مقترنا بكل ميكرولتر من حبات اللاتكس التجارية المستخدمة. مع زيادة التركيز ، زادت قيم النسبة المئوية أيضا ، واستقرت عند ميكروغرام من تركيز الأجسام المضادة ، مما يجعلها تركيز الاقتران الأمثل للمقايسة المناعية للمستضد المستهدف. تم تحديد حد الكشف من خلال تقييم نسبة مضان تفاعل سرعة اللاتكس مقابل تركيزات بروتين rPfHRP2 المتفاوتة.
من المقايسة المناعية للشطيرة ، لوحظ أن التألق قد زاد من 0.01 ميكروغرام من بروتين PfHRP2 ، واستقر عند 0.1 ميكروغرام. لم يكن هناك فرق كبير في التألق عند صفر ميكروغرام و 0.01 ميكروغرام. ومع ذلك ، لوحظ اختلاف كبير في التألق عند 0.01 ميكروغرام و 0.1 ميكروغرام و 10 ميكروغرام.
خطوة الغسيل لهذا البروتوكول أمر بالغ الأهمية لتجنب فقدان الخرز. يجب أن يكون المقياس محددا جيدا حتى لا تكون هناك أخطاء في النتيجة التي تم الحصول عليها. تمثل الخطوات الموضحة هنا توحيدا مهما ، وهو أمر ضروري لضمان موثوقية الاختبارات التشخيصية باستخدام حبات اللاتكس التي يتم تقييمها عبر القياس الخلوي الكامل.
لذلك ، هذه المنهجية هي بديل لنماذج اختبار شطيرة الكلاسيكية. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع مختلفة من المقايسات ، وقد تكون مناسبة للتعامل مع عدة جزيئات على سطح الخرز ، وكذلك للكشف عن التحليلات المختلفة.
