وأيد هذا العمل من مستشفى ماساتشوستس الإدارة العامة للصناديق الطب الباطني (JMT ، MKM ، حركة تحرير الكونغو ، JMV) ، المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية ومنح الهندسة الحيوية T32EB006348 (CEC) ، ومركز مستشفى ماساتشوستس العام للالحاسوبية والتكاملية الأحياء صندوق التنمية وAI062773 ( RJH) ، ومنح AI062773 ، DK83756 وDK 043351 (RJX) ، جبهة الخلاص الوطني 0643745 (MJL) ، NIH R21CA133576 (MJL) ، والمعهد الوطني لأمراض الحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة القومية (NIH) AI057999 (JMV ). نشكر نيكولاس جيم يودر لإجراء مناقشات مفيدة ، وتشارلز لباد (RPI ، المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة التقنية.

1. شروط الثقافة مسببات الأمراض لمحاصرة البصرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ألف الدخناء (B-5233/RGD12-8) على وسائل الاعلام آغار شبه صلبة تحتوي على SBD (سابورو دكستروز) حتى 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو جيم albicans (SC5314) في YPD (الخميرة ، ببتون سكر العنب) ثقافة السائل تحتوي على 100 ​​ميكروغرام / مل الأمبيسيلين بين عشية وضحاها في حاضنة شاكر في 30 درجة مئوية. </li></ol> 2. إعداد الممرضات لوصفها الفلورسنت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد المطلوب كمية مسببات الأمراض ونقلها إلى أنبوب مل تفاعل 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مخزنة 300 ميكرولتر من الفوسفات الملحي (PBS) إلى أنبوب التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الخليط لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف ، وترك بيليه دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر (2.4) و (2.5) مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 500μL من برنامج تلفزيوني. </li></ol> 3. وسم مسببات الأمراض مع صبغة الفلورسنت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1 ملغ من صبغة من الفائدة (على سبيل المثال اليكسا فلور 488 ، اليكسا فلور 647) في 100 ثنائي ميثيل الفورماميد ميكرولتر (DMF) (تركيز 10 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من خليط لصبغ رد فعل أنابيب تحتوي على مسببات الأمراض غسلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير أو تهزه عينة بلغت 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينة مع 3X PBS بواسطة الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. </li></ol> 4. حصاد خلايا تي من الدم الكامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الدم الكامل (الطازجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدم الحار ، برنامج تلفزيوني + 2 ٪ الجنين مصل البقر (FBS) ، وhistopaque إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة CD4 + T RosetteSep الإنسان كوكتيل التخصيب في 50 ميكرولتر خلية / مل من الدم الكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير العينة واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع عينة مع حجم مساو من FBS PBS + 2 ٪ ومزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة المخفف عينة على رأس histopaque ، والتقليل من الاختلاط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1200 XG في درجة حرارة الغرفة مع فرامل إيقاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا المخصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا المخصب 2X مع + PBS حل FBS 2 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز خلايا الدم الحمراء لمدة 2 دقيقة مع خلايا الدم الحمراء العازلة lysing </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من FBS PBS 2 ٪ + وأجهزة الطرد المركزي lysed خلايا الدم الحمراء عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف ، الحرص على عدم تعكير صفو بيليه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ IMDM مصل بقري جنيني </li></ol> 5. إعداد الضامة 264.7 RAW إلى شرائح الغرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر) لاحتواء 10 ٪ FBS ، 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ، و 1 ٪ L - الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دافئ وسائل الإعلام ، التربسين ، وبرنامج تلفزيوني في حمام دافئ إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة 2X مع برنامج تلفزيوني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBS بين كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل التربسين إلى لوحة لتغطية السطح (لوحة 10 سم زراعة الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدق بلطف الجانب من لوحة لفصل الخلايا من سطح اللوحة. يجب الحرص على عدم رش التربسين خارج اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل أو ما يعادل ذلك من وسائل الإعلام إلى التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الخليط في أنبوب التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الاعلام ، الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 10 مل من وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل غرفة من الشريحة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل من المجلسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. </li></ol> 6. بالإضافة إلى عينة من الممرضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر الماصة 50-10 المسمى مسببات الأمراض ذات الاهتمام (من الخطوات 1-3) في القاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج دقيق من قبل pipeting صعودا وهبوطا ، والحرص على عدم لمس الجزء السفلي من الغرفة لزعزعة الالتزام الضامة. </li></ol> 7. تحميل العينة على القرص الغزل المجهر مبائر (في شريط فيديو ، من خلال فحص المكونات) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على كافة مكونات لصناعة الغزل المجهر مبائر القرص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة مجهر لتصوير مدينة دبي للإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة الغرفة من الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الشرائح في مرحلة الغرفة المتخصصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة الأعلى من الغرفة (التصوير اللازمة لمدينة دبي للإنترنت). </li></ol> 8. استعدادا لمحاصرة الضوئية (في شريط فيديو ، من خلال فحص مكوناتها وكيفية إدماجه في المجهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصراع الكاميرا لفخ البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على ليزر الأشعة تحت الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مصراع الكاميرا (على الليزر) لاعتراض البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق مصراع الكاميرا تأكيد أمام ليزر الأشعة تحت الحمراء عن طريق التحقق مع البطاقة الحمراء. </li></ol> 9. اختيار والتلاعب مع الممرض فخ البصرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على التقيد الضامة على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على مسببات تذبذب بحرية في حل المتاخمة للالضامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرحلة الانتقال هذه أن الممرض هو على مقربة من الفخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مصراع والانخراط في الفخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحرك لجلب عينة الضامة في اتصال مع مصيدة ثابتةPED الممرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة مع الغزل القرص مبائر المجهر ، سواء في مدينة دبي للإنترنت ، مضان ، أو مزيج من الاثنين معا. عادة ، يتم محاصرة في مدينة دبي للإنترنت ، ويتم في الوقت الحقيقي مع التصوير مضان. </li></ol> 10. ممثل النتائج : لممارسة السيطرة الكاملة المكاني والزماني للممرضات والخرز في المجراة في المختبر والبيئة ، وقمنا بتصميم جهاز محاصرة متكاملة مبنية خصيصا على القرص الغزل المجهر مبائر (التخطيطي هو مبين في الشكل 1). بكامل قوتها ، وفرت ليزر 350 ميجاوات من الكهرباء وبعد اقتران الضوء مع العناصر البصرية المختلفة في الجهاز فخ البصرية ، وكانت تستخدم ~ 80 ميجاوات من الكهرباء في TIRF الهدف ، كما يقاس مع السلطة متر ، لتشكل في فخ في الغرفة. وبغية وضع كائن في غرفة النسبي إلى كائن المحاصرين ، في حين انتقل إلى مرحلة عقد ثابت مع وجوه المحاصرين محاصرة ليزر. وانتقل إلى مرحلة بسرعات بطيئة بما فيه الكفاية ، بحيث قوة السحب على الجسيم المحاصرين لم تتجاوز قوة محاصرة الأقصى. وصفت مع كل من ثلاثة ألوان (AF488 ، AF568 ، وAF647 الموافق الأخضر والأزرق والأحمر في الشكل ، على التوالي) لتوضيح التصوير مع قنوات متعددة مضان -- السكان منفصلة albicans C. (~ 5 ميكرون الحجم بشكل نموذجي) بينما في نفس الوقت محاصرة بصريا الممرض. وجيم واحد كان محاصرا albicans وانتقلت في نمط مربع من خلال مجموعة من خميرة أخرى ، كما أشارت إلى ذلك السهام الرمادي ، مما يدل على القدرة على التقاط الصور ومعالجتها موقع معين من الممرض واحد يختاره من قبل المشغل حتى في بيئة مزدحمة (الشكل 2A) . لتوضيح مزيد من المرونة في هذا النظام لاعتراض morphologies شكل مختلف الكائنات المسببة للأمراض التي أظهرتها ، كان منتاش البصرية أيضا قادرا على الاستمرار وضعه حجم سي albicans الجسيمات مع الخيطان الكاذبة. وجيم ونقلت albicans المسمى مع AF647 (الحمراء) على طول مسار كما هو موضح بواسطة السهم الأبيض وضعت بجانب خلايا GFP - LC3 - RAW فلوري (الشكل 2B). جزء من الخميرة C. كان محاصرا albicans كما الخيطان الكاذبة متأخرا على طول. نحن قادرون أيضا الرشاشية الدخناء المقبل لخلية فأر بلعم الخام من أجل تحليل الإطار الزمني المطلق للالبلعمة مع هذا الخط خلية معينة والممرض (الشكل 3A). بمجرد أن الممرض يجعل الاتصال مع الخلية ، يتم تشغيل في فخ الخروج ، ويتم توظيف الوقت الفاصل بين التصوير لمراقبة الأحداث اللاحقة الخلوية (الشكل 3B). واستخدمت أيضا في فخ الضوئية لالتقاط الأولية (خلايا تي) المعزولة من الدم وإخراج المتاخمة لحبات المغلفة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3 لكي تي خلية لتشكيل المشبك المناعية مع حبة (الشكل 4) ، وتظهر إضافية براعة في فخ مباشرة والتلاعب الخلايا المناعية. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. نظرة عامة والتخطيطي في فخ البصرية مجتمعة والغزل الإعداد القرص مبائر المجهر. تخطيط صك تبين شعاع محاصرة (الأرجواني) ، إنارة الطريق للتصوير brightfield (برتقالي) ، شعاع الإثارة مضان (الحمراء) ، مضان الانبعاثات (الأخضر) ، إلى جانب المسؤول عن جهاز (CCD) الكاميرا ، والإلكترون ضرب الجهاز المسؤول يقترن (EM - CCD) الكاميرا ، المرايا مزدوج اللون (D1 و D2) ، المرايا (M1 و M2) ، وعدسات (L1 ، L2 ، L3 ، L4). وصفت جميع المكونات الأخرى للنظام المجهر فخ مبائر في الشكل. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : (أ) من المحاصرين الإسفار الصور والتلاعب بها C. albicans. والمحاصرين fluorescently المسمى (اليكسا فلور 488 (AF488) ، الزرقاء) الكائن في حقل الأخرى جيم fluorescently المسمى albicans (AF568 والأخضر وAF647 ، الحمراء). يتم نقل هذه المرحلة حول المحاصرين ، CA الجسيمات الزرقاء كما يتبين من الأسهم الرمادية. (ب) المحاصرين الزائفة خوطي شكل C. albicans بجوار GFP - LC3 الخلية RAW. وأعرب شكل psuedohyphal fluorescently المسمى من CA (أحمر ، AF647) المحاصرين بصريا وانتقلت المتاخمة لGFP - LC3 الضامة RAW. تم نقل الكائن CA على طول مسار كما هو موضح بواسطة السهم الأبيض. <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. ملائمة وتحديد المواقع أ. الدخناء المقبل لخلية RAW أكلة. (أ) من الصور Brightfield ألف المحاصرين الدخناء ، كما يدل على ذلك السهم الأبيض ، وانتقلت المتمركزة على طول الطريق كما أشار السهم الأحمر. الممرض المحاصرين قليلا من التركيز بسبب اعتراض دفع الكائن أعلى قليلا من المستوى البؤري ألف. يتم نقل الدخناء حتى يتم وضعها بجوار الخلية RAW المطلوب. (باء) انفلونزاorescence التصوير من البلعمة أ. الدخناء بخلية RAW. بعد وضع الممرض المحاصرين المقبل إلى خلية RAW ، يتم تنشيط عملية البلعمة. في 30 ثانية ، وغشاء الخلية RAW يبدأ التغيير وشكل كوب حول الجسيمات. في 60 ثانية ، ويتكون بالكامل الكأس. من 90s الى 150s ، وألف غارق الدخناء ، وبنسبة 180 ثانية ، واستيعابا كاملا للجسيمات <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. محاصرة الأولية T - الخلية إلى شكل مشبك مع المضادة للCD3 حبات مغلفة. الصور الأولية لمدينة دبي للإنترنت تي الخلية التي انتقلت في فخ الضوئية لموقف بجوار المغلفة مع حبة مضادة للأجسام المضادة CD3. وتشكل الخلية بعد ذلك المشبك المناعية ، والتي لا يمكن تمييزها بسهولة في الصور.

<ol>
	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+Learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers.">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure.">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science.">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching.">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin's+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force.">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers.">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;&#946;+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor.">The &#945;&#946; T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li><li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers.">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li><li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions.">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+Systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li><li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay.">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا العمل الذي نقوم استخدام فخ البصرية لالتقاط الجراثيم ذات أبعاد ما بين 3 ميكرون -- 5 ميكرون. على الرغم من مسببات الأمراض التي تهم مختبرنا وعادة ما يكون لهذه الأبعاد ، ونظام منتاش البصرية الموصوفة هنا هي مرنة إلى اعتراض مجموعة واسعة من الأحجام. وقد استخدمت بالفعل ال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> ألف الدخناء </td><td></td><td></td><td> البينو السلالة ، B-5233/RGD12-8 ، هدية من KJ كوون تشونغ ، المعاهد الوطنية للصحة </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50 - B متحولة ، هدية من Mylonakis الفثيريوس ، MGH ؛ SC5314 السلالة ، هدية من جيرالد فينك ، معهد وايتهيد </td></tr><tr><td> الكسا فلور 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا فلور 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل الفورماميد </td><td> سيغما </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> الدم الطازج </td><td></td><td></td><td> هدية من هيث RJW ، MGH ، سفينتى </td></tr><tr><td> نيكون المجهر المقلوب </td><td> نيكون </td><td></td><td> نموذج TI - E </td></tr><tr><td> محاصرة ليزر ، ChromaLase </td><td> السماء الزرقاء للبحوث </td><td> CLAS - 106 - 02 - STF02 </td><td></td></tr><tr><td> مضان الإثارة الليزر </td><td> متماسك </td><td></td><td> إنوفا طراز 70C </td></tr><tr><td> الألواح لمكونات محاصرة </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224 ، MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> البصري الهواء الجدول </td><td> شركة التصنيع التقنية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مصراع الإلكترونية مع التحكم دواسة </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> تم شراؤها من المنتسبين فنسنت ، روتشستر ، نيويورك </td></tr><tr><td> Singlemode الألياف البصرية </td><td> أوقية بصريات </td><td> PMJ - 3S3S - 1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> الألياف ميضعة </td><td> Thorlabs </td><td> PAF - X - 5 - C </td><td></td></tr><tr><td> الألياف ميزاء </td><td> أوقية بصريات </td><td> HPUCO - 23-1064 - P - 25AC </td><td></td></tr><tr><td> عدسات التلسكوب </td><td> Thorlabs </td><td> AC254 - 150 - B </td><td> البعد البؤري من 150 مم </td></tr><tr><td> مراحل الترجمة (س ، ص ، ض) </td><td> نيوبورت </td><td> M - 461 - XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR مزدوج اللون المرآة </td><td> صفاء </td><td> ET750 - SP - 2p8 </td><td></td></tr><tr><td> الهدف عدسة (100X) </td><td> نيكون </td><td></td><td> NA = 1.49 الغمر ، النفط ، والهدف TIRF </td></tr><tr><td> رئيس مبائر </td><td> يوكوجاوا </td><td> CSU الحادي عشر </td><td></td></tr><tr><td> المستقطب </td><td> نيكون </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> ولاستون المنشور </td><td> نيكون </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM - CCD كاميرا </td><td> هاماماتسو </td><td> C9100 - 13 </td><td></td></tr><tr><td> اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا (ORCA ER) </td><td> هاماماتسو </td><td> C4742 - 80 - 12AG </td><td></td></tr><tr><td> مرشح عجلة </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> مرشح عجلة </td><td> سوتر </td><td> LB10 - نوي </td><td></td></tr><tr><td> غرف ساترة </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111 - 51D </td><td> المغلفة مع CD3 مكافحة </td></tr><tr><td> Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

ديناميكية التصوير الخلية الحية تسمح برؤية مباشرة في الوقت الحقيقي التفاعلات بين خلايا الجهاز المناعي 1 ، 2 ، إلا أن عدم السيطرة المكانية والزمانية بين الخلية البلعمية وميكروب جعلت ركزت الملاحظات في التفاعلات الأولية للاستجابة المضيف لمسببات الأمراض صعبة. تاريخيا ، تم تصوير أحداث الاتصال بين الخلايا مثل البلعمة 3 عن طريق خلط أنواع الخلايا اثنين ، ثم المسح الميداني مستمر من رأي لايجاد اتصالات بين الخلايا الصدفة في المرحلة المناسبة للتفاعل. الطبيعة العشوائية لهذه الأحداث يجعل هذه عملية شاقة ، وأنه من الصعب مراقبة الأحداث في وقت مبكر أو عابرة في الخلية خلية الاتصال عن طريق هذا النهج. هذا الأسلوب يتطلب العثور على أزواج الخلية التي هي على وشك الاتصال ، والمراقبة لهم حتى الاتصال بهم من الطراز الأول ، أو لا. لمعالجة هذه القيود ، ونحن نستخدم محاصرة الضوئية كوسيلة من وسائل ، غير الغازية غير مدمرة ، ولكن سريعة وفعالة لوضع الخلايا في الثقافة. ويتزايد استخدام المصائد الضوئية ، أو ملاقط بصرية ، في مجال البحوث البيولوجية لالتقاط والتلاعب جسديا الخلايا والجزيئات الأخرى ميكرون الحجم في ثلاثة أبعاد 4. ولوحظ تكثيف الضغط الإشعاع وتطبيقها لنظم منتاش البصرية في عام 1970 5 ، 6 ، وكان أول استخدام للسيطرة على العينات البيولوجية في عام 1987 7. منذ ذلك الحين ، قد نضجت ملاقط بصرية في التكنولوجيا لتحقيق مجموعة متنوعة من الظواهر البيولوجية 8-13. نحن تصف طريقة السلف ال 14 التي يعيش التصوير من خلال دمج الخلايا الضوئية مع اعتراض الغزل المجهري القرص مبائر مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة لتوفير مجموعة رائعة والسيطرة المكانية والزمانية من الكائنات الممرضة في البيئة الفسيولوجية لتسهيل التفاعل مع الخلايا المضيفة ، على النحو الذي يحدده المشغل. العيش ، وحوصر بصريا الكائنات المسببة للأمراض مثل المبيضات البيض والرشاشية الدخناء ، الذي يمكن أن يسبب يمكن أن تكون مميتة ، والتهابات الغازية في الأفراد المناعة 15 و 16 (مثل الإيدز ، والعلاج الكيميائي ، ومرضى زرع الأعضاء) ، وذلك باستخدام الليزر كثافات غير المدمرة وانتقل بجوار الضامة ، والتي يمكن يبلعم الممرض. وارتفاع القرار ، أحالت الأفلام الخفيفة ومضان القائم على أسس القدرة على مراقبة الأحداث في وقت مبكر من البلعمة في الخلايا الحية. للتدليل على تطبيق واسعة في علم المناعة ، كما حوصر الأولية (خلايا تي) والتلاعب في شكل نقاط الاشتباك العصبي المضادة للCD3 المجهرية المغلفة في الجسم الحي ، وكما تم الحصول على الوقت الفاصل بين التصوير تشكيل المشبك. من خلال توفير وسيلة لبسط السيطرة المكانية غرامة مسببات العيش فيما يتعلق الخلايا المناعية ، ويمكن التقاط التفاعلات الخلوية بواسطة المجهر مضان مع الحد الأدنى من اضطراب الخلايا ويمكن أن تسفر عن بصيرة قوية في وقت مبكر من ردود الحصانة الفطرية والتكيفية.

Watch this Scientific Journal Video about Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging at JoVE.com

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

ووصف طريقة لتحديد فردي ، والتعامل معها ، ومسببات الأمراض الصورة الحية باستخدام فخ البصرية بالإضافة إلى المجهر القرص الغزل. فخ البصرية يوفر سيطرة المكاني والزماني للكائنات الحية والأماكن المجاورة لها إلى الخلايا المضيفة. مضان المجهري التفاعلات بين الخلايا الحيوية يلتقط مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. ووصف طريقة لتحديد فردي ، والتعامل معها ، ومسببات الأمراض الصورة الحية باستخدام فخ البصرية بالإضافة إلى المجهر القرص الغزل. فخ البصرية يوفر سيطرة المكاني والزماني للكائنات الحية والأماكن المجاورة لها إلى الخلايا المضيفة. مضان المجهري التفاعلات بين الخلايا الح?...

Video: Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

اختﻻق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية لدراسة الانصهار بلعم

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

عدوى يرقات حمار وحشي مع جراثيم أسبيرغيلوس لتحليل التفاعلات المضيفة الممرضة

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...