يسمح بروتوكولنا للباحثين بتحليل عملية تكوين الشرايين في الجسم الحي من خلال تتبع التزام الخلايا المناعية وتسربها في الشرايين الجانبية المتنامية في الوقت الفعلي. تسمح تقنية الفحص المجهري متعدد الفوتونات بتصور ديناميكيات الخلايا في الأنسجة العميقة لنماذج الفئران الحية ذات السمية الضوئية المنخفضة والدقة الزمانية المكانية العالية. سيتم عرض إجراء المجهر من قبل دومينيك فان دن هيوفيل ، وهو مساعد تقني من منصة التصوير متعدد الفوتونات من مختبر الدكتورة هيلين إيشيكاوا أنكرهولد.
سأوضح الإجراء الجراحي. للبدء ، ضع الماوس المخدر في وضع ضعيف. ثم ضع قطعتين من الطين المصبوب تحت الطرف الخلفي العلوي للفأر لضمان وضع مستوى العضلة المقربة.
ضع الماوس تحت مجهر الاستريو. بعد إزالة الشعر من كلا الساقين ، قم بتطهير الجلد وقصه في دائرة حول ندبة ربط الشريان الفخذي السابق للطرف الخلفي الأيمن. قم بإزالة الجلد وطبقة الدهون من أعلى الساق واسحب الجلد المتبقي جانبا باستخدام الغرز لإنشاء جيب حول العضلة المقربة مع الأوعية الجانبية.
بعد ذلك ، قم بإزالة الدهون تحت الجلد للحصول على رؤية واضحة للعضلة المقربة ، والشريان والوريد ، وكذلك الأوعية الجانبية. قم بإزالة طبقة العضلات السطحية الموجودة أعلى الأوعية الجانبية باستخدام ملقط دقيق. املأ الجيب المحضر بمحلول ملحي لمنع الأنسجة من الجفاف واستمر في نفس الإجراء للطرف الخلفي الأيسر الذي يتم تشغيله بشكل وهمي.
قبل التصوير ، أضف الجل بالموجات فوق الصوتية في كلا الجيبين مما يمنع الجفاف ويعمل كوسيط غمر للاقتران البصري بالهدف. قم بتشغيل مفتاح صندوق ليزر الياقوت التيتانيوم ، وصندوق الواجهات الإلكترونية ، ووحدة التسخين لغرفة الحاضنة ، ومصباح الفلورسنت ، والكمبيوتر. قم بتشغيل برنامج الاستحواذ.
اضبط الطول الموجي على 800 نانومتر وافتح مصراع المجهر. في مربع حوار معالج القياس ، اختر وضع الأداة كشعاع واحد ووضع القياس كفاصل زمني لمسح 3D. ثم انقل الماوس المخدر إلى غرفة الحضانة الدافئة مسبقا للمجهر وضع المنطقة باستخدام الجل بالموجات فوق الصوتية مباشرة على اتصال مع العدسة الأمامية الموضوعية.
افتح مصراع المجهر الفلوري. ثم اختر مرشحا مناسبا أو إعدادا ثنائي اللون لتصور FTSE. حدد منطقة الاهتمام باتباع تدفق الدم تحت إضاءة التألق.
بعد جلب منطقة الاهتمام إلى مجال الرؤية المركزي ، أغلق مصراع المجهر الفلوري. في مربع حوار الماسح الضوئي XY ، قم بتعيين المعلمات المطلوبة لحجم الصورة والبكسل والتردد ومتوسط الخط. اضبط طاقة الليزر واضبط كسب مضاعف الصورة للقنوات باللون الأخضر والأحمر والأزرق.
حدد هدفا مناسبا للتصوير داخل الجسم وإعدادات تصحيح الانجراف. قم بتعريف نطاق رصة الصور ببدء حالة اكتساب المعاينة بالضغط على الزر الأحمر في نافذة شاشة معالج القياس. للحصول على صور جيدة ، حدد المنطقة وهيكل الاهتمام من خلال التركيز.
أثناء مراقبة الشاشة ، قم بتغيير التركيز عن طريق تحريك الهدف حتى تختفي الصورة وقم بتعيينه على أنه صفر. اضبط موضع الهدف كآخر موضع في الاتجاه المحوري. ثم قم بتغيير التركيز في الاتجاه المعاكس عن طريق تحريك الهدف لأسفل حتى تختفي الصورة من الشاشة مرة أخرى.
انقر فوق زر الإيقاف في الزاوية العلوية اليسرى من مربع حوار معالج القياس واضبط حجم الخطوة على ميكرومترين. اختر محور python كجهاز المحور الأول في مربع حوار معالج القياس وحدد عدم تنشيط وضع الحفظ التلقائي. ثم حدد مربع الحفظ التلقائي فقط على محور الوقت.
بعد ذلك ، اضغط على أيقونة Python في نافذة الأجهزة المتاحة لفتح نافذة حوار Python. في إعدادات محور حوار Python، أدخل القسمين من وإلى، ثم أدخل عدد الخطوات. انتقل إلى نافذة حوار المرحلة Z XYZ وقم بتكبير نطاق المسح بمقدار 200 ميكرومتر على كلا الطرفين.
للقيام بذلك ، أدخل 200 ميكرومتر في البداية وأدخل ناقص 240 ميكرومتر في النهاية وسيتم تعيين النطاق تلقائيا على أنه ناقص 440 ميكرومتر. افتح مربع حوار الواجهة الأمامية VivoFollow. ابدأ الحصول على الصورة بالضغط على رأس السهم الأخضر في الزاوية العلوية اليسرى من مربع حوار معالج القياس.
إذا تم استخدام تصحيح الانحراف المباشر، فابحث عن مربع حوار لظهور تكوين تصحيح الانجراف. ثم قم بتعيين قناة الاستحواذ المستخدمة كما هو الحال في مرجع معلم الجوال. أدخل إزاحة التصحيح القصوى بالميكرومتر المضافة إلى مواضع Z الأولى والأخيرة، وانقر موافق. راقب إزاحة الانجراف الحالية في X و Y و Z في الوقت الفعلي أثناء التقاط الصورة في نافذة حوار الواجهة الأمامية لتدفق الجسم الحي وتوقف عن الحصول على التصوير بعد 35 دقيقة عند الحاجة إلى دورة أخرى من إعادة حقن التخدير.
حقن نصف جرعة من مزيج MMF وأعد تشغيل الحصول على التصوير حتى تنتهي التجربة. تسمح هذه الأداة بالحصول على الصور على المدى الطويل ، وتمكن من جمع البيانات عالية الجودة ، وهي مناسبة لتتبع الخلايا لقياسات السرعة. كما هو موضح بدون تصحيح الانجراف ، تنجرف منطقة الاهتمام تدريجيا بعيدا عن عرض التسجيل ، مما يؤثر على القدرة على تتبع الخلايا لتحليل السرعة.
ومع ذلك ، يمكن تسجيل الأفلام المستقرة باستخدام برنامج تصحيح الانجراف ويمكن تتبع المزيد من الخلايا على مدى فترة طويلة. يمكن أن يوفر برنامج تصحيح الانجراف أيضا تصورا لإزاحات X و Y و Z بمرور الوقت الذي تم تصحيحه من قبل النظام. يوفر الفحص المجهري متعدد الفوتونات دقة زمانية مكانية عالية لتتبع كريات الدم البيضاء حيث يمكن تتبع خطوات هجرة الخلايا وسرعتها ومراقبتها.
من خلال إعداد الأوعية الجانبية للتصوير متعدد الفوتونات ، من الضروري تجنب تلف الشرايين الجانبية. قبل التصوير ، من المهم تحديد الشريان الجانبي الصحيح بأمان. مع هذا الإجراء الجديد للتصوير متعدد الفوتونات داخل الجسم للشرايين الجانبية ، من الممكن تحليل الالتصاق وتسرب جميع خلايا الدم في الجسم الحي عن طريق تغيير ملصق الأجسام المضادة.
