ويؤيد هذا العمل من قبل صندوق جماعية من NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد الخلايا المختصة الكيميائي من discoideum Dictyostelium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد الخلايا التي يتم discoideum دال الكيميائي إلى معسكر جاذب كيميائي ، وخلايا الحصاد المتزايد في D3 - T الوسائط الغنية من ثقافة الهز حتى 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين في الخلايا غير المغذيات العازلة التنموية (DB العازلة التي تحتوي على 5 مم نا 2 هبو 4 ، 5 مم KH 2 PO 4 ، 2 مم MgCl 2 و 0.1 ملم CaCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا في DB العازلة في مناطق ذات كثافة الخلايا 2x10 7 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة 10 مل الخلايا في قارورة 250 مل بسعر 100 دورة في الدقيقة عند 22 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليم 100 ميكرولتر من 7.5 ميكرومتر الأسهم المخيم إلى الخلايا 10 مل كل ست دقائق أكثر من 6 ساعات لتحقيق تركيز النهائي من مخيم نانومتر 75 ، وهي عملية تسمى العلاج cAMP في النبض. بعد 5-6 ساعات من العلاج cAMP في النبض ، D. تصبح الخلايا discoideum الكيميائي المختصة الانحدار نحو المخيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق ثم مع الخلايا resuspend العازلة DB تحتوي على مادة الكافيين 2.5 ملم ، ويهز بسرعة 200 دورة في الدقيقة في 22 دقيقة لمدة 20 درجة مئوية لbasolate الخلية إلى حالة الانجذاب الكيميائي. </li></ol> 2. تصوير الخلايا chemotaxing في الانحدار وضوحا وجاذب كيميائي manipulatable <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الردم a micropipette بمحلول الطازجة 30 ميكرولتر من مخيم ميكرومتر (1) واليكسا 594 في 0.1μg/μl العازلة في DB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق Femtotip إلى حائز micropipette وتوصيل الأنابيب لضغط جهاز العرض ، إيبندورف FemtoJet النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق التجمع micropipette إلى micromanipulator (إيبندورف TransferMan nk2 إليه) بمحركات micromanipulator لتوفير الضغط المستمر من أجل إقامة التدرج مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل LabTek غرفة واحدة مليئة جيدا 6 مل من العازلة DB عبر عدسة النفط 40X على مبائر واستخدام المجهر مشرق حقل البصريات ، مركز Femtotip في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على توريد مجموعة الضغط والضغط التعويض (PC) لمدة 70 هكتوبسكال لإنشاء التدرج من خليط 594 المخيم / اليكسا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور التدرج المخيم رصد خليط من التركيز المطلوب من المعسكر واليكسا 594 مضان به الإثارة مع خط ليزر 543 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام السيارات لتحديد المواقع وظيفة من micromanipulator لوضع micropipette إلى المواقع المطلوبة والمنصوص عليها في المركز 1 ، 2 موقف ، والموقف من 3 إلى التلاعب التدرج الخلية التي يتعرضون إليها. </li></ol> 3. نظام متحرك الخلية nonpolarized يسهل تصوير الأحداث يشير الى المشاركة في مخيم التدرج الاستشعار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج الكافيين ، وإزالة الخلايا وقسامة الطرد المركزي في 500G لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة وتمييع الخلايا إلى خلايا 5x10 5 / مل مع العازلة DB الطازجة التي تحتوي على الكافيين 2.5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل من تطبيق تعليق خلية إلى مجلس واحد بشكل جيد أو 0.4 مل لكل جانب من الغرفة أربعة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح للخلايا الالتزام لمدة 10 دقيقة ، ماصة بعناية قبالة عازلة لإزالة الخلايا غير مرتبط واستبدالها مع نفس الحجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا المطلوب تحت المجهر وبدء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن تجربة صممت لرصد ديناميات إشارات المكونات في تعريض الخلايا إلى الانحدار المستمر ، وعلاج الخلايا مع 5.0 ميكرومتر (تركيز النهائي) Latrunculin باء لمدة 10 دقيقة قبل التجارب. </li></ol> 4. في نفس الوقت رصد بروتين G heterotrimeric التنشيط والإنتاج PIP 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cAMP في تطوير خلايا النبض المشترك معربا عن GαCFP وYFPGβ (خلايا G) والخلايا معربا عن PIP مؤشر PH - 3 GFP (خلايا PH) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج هذين النوعين من الخلايا التي تحتوي على نسبة 1:1 ومنها لوحة واحدة في غرف أو 4 بشكل جيد جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء وحفظ المرجع بصمة الانبعاثات منحنى CFP ، وYFP GFP امبدا باستخدام النمط اقتناء المكدس داخل النطاق الطيفي 464-624 نانومتر مع عرض 10 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت واحد من البروتين G تنشيط الخلايا في صورة PIP 3 G والإنتاج في الخلايا باستخدام PH مع نفس النمط امدا المكدس اقتناء ضمن النطاق الطيفي 464-544 نانومتر مع زيادات 10 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الدالة الخطية Unmixing البرمجيات 510META زايس به حفظ CFPand YFP وبصمات الأصابع لحساب الانبعاثات رياضيا مساهمة كل fluorophore في المكدس لامدا لفصل CFP وكثافة YFP إلى القنوات الفردية في G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الاستراتيجية ذاتها ، وتطبيق وظيفة Unmixing الخطي باستخدام GFP والبصمات المحفوظة الانبعاثات الخلفية لحساب كثافة حسابيا GFP PH في الخلايا. </li></ol> 5. ممثل النتائج : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظام نموذجا ممتازا للدال discoideum الكيميائي للتوسط النوع من الاختزال. الاميبا والاجتماعية ، د. المعارض discoideum a الكيميائي ضرب خلال دورة الحياة. نظرا لمزاياه الوراثية والبيوكيميائية ، D. د يوفر بقوتهاystem لدراسة الكيميائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكيميائي للخلايا في إطار مجالات chemoattract المرئية وmanipulatable ، وهنا نعرض أولا منهجية بسيطة للحصول على وجود علاقة خطية بين معسكر اعتقال وكثافة من صبغة الفلورسنت اليكسا 594 سلسلة التخفيف من مخيم 2 ميكرومتر مختلطة مع 10 ميكروغرام / مل الكسا 594 (الشكل 2A). المقبل ، ونحن نقدم وسيلة سهلة لتصور التدرج ، وعلاوة على ذلك ، لإنشاء القياس الكمي للتركيز معسكر متدرجة من شدة اليكسا 594 (الشكل الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو uncoupled حركية الخلية مع خلية الاستقطاب والاستشعار عن اتجاهي. مثبط بلمرة أكتين يلغي موجودة من قبل الأقطاب المورفولوجية ويمنع أيضا حركة الخلية مع الحفاظ على قدرة الخلايا الاستشعار عن الاتجاه (الشكل 3A). توظيف cAMP في التحفيز وضوحا وmanipulatable يضمن المدخلات ، والتحفيز على سبيل المثال تطبق بشكل موحد أو التدرج ملف. هذا الأسلوب يسمح التحليل الكمي في مخيم الناجم عن إعادة توزيع المكونات الرئيسية يشير التدرج في آلية الاستشعار عن بعد. ديناميات spatiotemporal يقاس من هذه المكونات إشارة تتيح لنا أن نفهم كيف يمكن للشبكة يشير يحقق التكيف مع التحفيز موحدة في حين تولد ردود البيوكيميائية الاستقطاب إلى التدرجات (الشكل 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القياسات المنتظمة لحركية chemosensing شبكة الإشارات عند التعرض إلى الانحدار ثابتة. ومن المهم للغاية لقياس ديناميكية / حركية الاتجاه الاستشعار إشارات لفهم كيفية مكونات كل عنصر يساهم في إنشاء خلايا الاستقطاب بين الخلايا عند تجربة التدرج الأول. تطبيق التصوير الخلية الحية مع دقة عالية الإيقاع المكاني ، وتبين لنا لأول مرة ثنائي الطور PIP3 إنتاج الخلايا التي تتعرض لcAMP في الانحدار المستمر (الشكل 4A - C). تطبيق الخلية الحية التصوير ، فقد قمنا بقياس منهجية ديناميكية محددة الاتجاه الاستشعار عن التحفيز يشير شبكة المخيم لPIP3 الإنتاج (الشكل 4D ، E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس الوقت رصد بروتين G heterotrimeric التنشيط والإنتاج 3 PIP على تحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد. فورستر بالرنين نقل الطاقة (مختصر الحنق) على نهج فعالة لرصد heterotrimeric تنشيط بروتين G (التفكك) على تحفيز المخيم. هنا ، وصفت لدينا خبير مريحة سهلة تعتمد نظام لقياس متزامنة من heterotrimeric تنشيط بروتين G و 3 PIP الإنتاج من خلال رصد التغيير والحنق إزفاء غشاء PIP 3 التحقيق ، PH - G في GFP PH والخلايا ، على التوالي (الشكل رقم 5 ). والتحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد على بروتين يطلق G التنشيط المستمر الذي يتسبب في حين عابرة PIP 3 الإنتاج. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 : وجود نظام نموذجا ممتازا للدال discoideum الكيميائي للتوسط النوع من الاختزال. ألف مخطط يبين مسار إشارات موجزة للاستشعار عن اتجاهي. باء cAMP في الانحدار السريع يدفع الكيميائي د. discoideum الخلايا. 3 التعبير عن الخلايا PIP التحقيق ، PH - GFP (الخضراء). التدرج (الأحمر) هو تصور من قبل اليكسا 594. مقياس شريط = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : الانجذاب الكيميائي للخلايا في إطار مجالات chemoattract المرئية وmanipulatable. رسم بياني يظهر A. وجود علاقة خطية بين معسكر اعتقال وكثافة وجود صبغة الفلورسنت اليكسا 594 سلسلة التخفيف من مخيم 2 ميكرومتر مختلطة مع 10 ميكروغرام / مل اليكسا 594. باء القياس الكمي لمعسكر الاعتقال متدرجة من علاقة خطية تركيز المخيم وكثافة اليكسا صبغة الفلورسنت 594 ألف في <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الرقم 3 : uncoupled حركية الخلية مع خلية الاستقطاب والاستشعار عن اتجاهي. ألف صورة متحركة تظهر أن الخلايا من معاملة المانع أكتين البلمرة Latrunculin باء الحفاظ على القدرة على الاستشعار عن اتجاهي. 3 التعبير عن الخلايا PIP التحقيق ، PH - GFP (الخضراء). التدرج (الأحمر) هو تصور من قبل اليكسا 594. باء Manipulatable الخلية التحفيز ونظام المحتشد متحرك يسمح لمعالجة المسائل الرئيسية للاستشعار عن اتجاهي. مقياس شريط = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4 : قياسات الجهازية للحركية chemosensing شبكة الإشارات عند التعرض إلى الانحدار ثابتة. ألف المونتاج يظهر ثنائي الطور PIP 3 الإنتاج (الأخضر) من الخلايا التي تتعرض لcAMP في الانحدار المستمر (الأحمر). باء صورة تظهر مناطق المصالح (رويس) لقياس حركية الإنتاج المقدمة في 3 PIP C C. . حركية سPIP و 3 في إنتاج الخلايا المعرضة للتدرج لوني ثابت. دال مخطط يوضح شبكة الإشارات الاستشعار عن الاتجاه من المخيم إلى تحفيز إنتاج 3 PIP. ويرد حركية سفرهم عند التعرض لالانحدار المستمر في خطوط نفس اللون الصلبة في البريد. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="الشكل 5"/> الشكل 5 : رصد متعددة في وقت واحد من الأحداث يشير الى شبكات النوع من الاختزال. ألف مخطط يبين قياس المتزامن لتنشيط بروتين G heterotrimeric PIP والإنتاج 3 عن طريق رصد التغيير والحنق إزفاء غشاء التحقيق PIP3 ، PH - G في GFP PH والخلايا ، على التوالي. باء مونتاج للصور من مجموعة قوس قزح والخلايا PH معارض ان تحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد على بروتين يطلق G التنشيط المستمر على طرفي الخلية ، في حين أن الذي يتسبب في إنتاج PIP3 عابرة. النقاط وقت قبل (0s) وبعد لتحفيز 10.2s ، 4.9s و20.4s جيم حركية تنشيط بروتين G PIP3 وبناء على تحفيز الانتاج cAMP في تطبيقها بشكل موحد.

<ol>
	<li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis.">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li><li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors.">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li><li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium.">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+chemokine+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li><li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method.">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li><li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing.">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li><li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis.">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li><li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells.">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li><li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phosphatidylinositol+3'+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium.">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction.">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li><li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt/PKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium.">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 .</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells.">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis.">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients.">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li><li>Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

العمليات للوصول إلى مرحلة من الخلايا المختصة الكيميائي لنوع البرية D. discoideum الخلايا ، فإنه يأخذ حوالي 5 ~ 6 ساعات ينبض التنمية في درجة حرارة الغرفة لدفعهم الى مرحلة جيدة الكيميائي المختصة خلال الخلايا التي تعرض التشكل جيدا الخل...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> وسائط النمو D3 - T </td><td> دك الطبية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> كافيين </td><td> سيغما </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> المسابر الجزيئية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكسا 594 </td><td> المسابر الجزيئية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP في </td><td> سيغما </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT الموقت للبرمجة </td><td> ChronTrol كورب </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus مضخة تمعجية 3 </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> شاكر منصة دوارة </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet إمدادات الضغط microcapillary </td><td> إيبندورف </td><td></td><td></td></tr><tr><td> واحد وأربعة جيدا مختبر تيك الثاني ساترة الغرف </td><td> Nalge نونك الدولية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META المجهر الفلورسنت أو ما يعادلها </td><td> زايس </td><td></td><td> a 40X 60X أو 1.3 NA NA النفط 1.4 خطة مدينة دبي للإنترنت ، Neofluar الهدف العدسة </td></tr><tr><td> اوليمبوس X81 أو ما يعادلها </td><td> اوليمبوس </td><td></td><td> يتطلب 100X 1.47 NA عدسة الهدف TIRF </td></tr></tbody></table>

imaging g-protein coupled receptor (gpcr)-mediated signaling events that control chemotaxis of dictyostelium discoideum

ويمكن الكشف عن العديد من الخلايا حقيقية النواة التدرجات الاشارات الكيميائية في بيئاتهم ، وترحيل 1 تبعا لذلك. ويشار إلى هذه الهجرة كما قاد الخلية الكيميائي ، وهو أمر ضروري للخلايا مختلفة لتنفيذ وظائفها مثل الاتجار الخلايا المناعية والخلايا العصبية الزخرفة 2 ، 3. عائلة كبيرة من البروتين G - مستقبلات مقترنة (GPCRs) بالكشف عن الببتيدات الصغيرة متغير ، والمعروفة باسم chemokines ، لتوجيه الهجرة خلية في الجسم الحي 4. الهدف النهائي للبحث الكيميائي هو أن نفهم كيف يمكن لchemokine التدرجات GPCR آلات الحواس وإشارات التحكم الأحداث التي أدت إلى الكيميائي. GPCR بوساطة لتحقيق هذه الغاية ، ونحن نستخدم تقنيات التصوير للمراقبة ، في الوقت الحقيقي ، وتركيزات spatiotemporal الحركة chemoattractants الخلية ، في التدرج من جاذب كيميائي ، وتفعيل heterotrimeric البروتين G ، وإشارات بين الخلايا المشاركة في الأحداث الكيميائي للخلايا حقيقية النواة 5-8 . الكائن بسيطة حقيقية النواة ، Dictyostelium discoideum ، يعرض chemotaxic السلوكيات التي هي مماثلة لتلك الكريات البيض ، ودال. discoideum هو نظام نموذجي لدراسة مفتاح الكيميائي حقيقية النواة. كما حرر المعيشة الأميبات ، D. الخلايا في الانقسام discoideum المتوسط ​​الغنية. عند الجوع ، والخلايا إدخال برنامج التنموي الذي والتجميعية من خلال cAMP في بوساطة الكيميائي لتشكيل هياكل multicullular. وقد تم تحديد العديد من العناصر المشتركة في الكيميائي إلى مخيم في دال discoideum. الربط من المخيم إلى GPCR (cAR1) يدفع تفكك heterotrimeric G - البروتينات إلى وحدات فرعية Gγ Gβγ 7 و 9 و 10. Gβγ مفارز تنشيط رأس ، والذي ينشط في PI3K بدوره تحويل PIP 2 إلى 3 PIP على غشاء الخلية 11-13. 3 PIP بمثابة مواقع ملزم للبروتينات مع التماثل pleckstrin (PH) المجالات ، وبالتالي توظيف هذه البروتينات إلى غشاء 14 و 15. تفعيل مستقبلات cAR1 يتحكم أيضا في الجمعيات غشاء PTEN ، التي dephosphorylates PIP PIP 2 3 إلى 16 و 17. يتم الحفاظ تطويريا الآليات الجزيئية في الكيميائي GPCR chemokine بوساطة الخلايا البشرية مثل العدلات 18. نقدم الطرق التالية لدراسة الكيميائي د. discoideum الخلايا. 1. إعداد الخلايا المكون الكيميائي. 2. التصوير الكيميائي للخلايا في الانحدار المخيم. 3. تراقب تفعيل GPCR الناجم عن heterotrimeric G - البروتين في الخلايا الحية واحد. 4. تصوير جاذب كيميائي عن العوامل الدينامية PIP 3 الردود في الخلايا الحية واحد في الوقت الحقيقي. ويمكن تطبيق أساليب التصوير المتقدمة لدينا لدراسة الكيميائي من الكريات البيض البشرية.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum at JoVE.com

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

هنا ، نحن تصف تفصيلا التصوير الخلية الحية أساليب التحقيق الكيميائي. نقدم أساليب مضان المجهري لرصد ديناميات spatiotemporal من الأحداث يشير في الخلايا المهاجرة. قياس الأحداث يشير يسمح لنا أن نفهم كذلك كيف شبكة النوع من الاختزال ، يشير يحقق التدرج الاستشعار من chemoattractants وضوابط الهجرة الاتجاه من الخلايا حقيقية النواة.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

imaging-g-protein-coupled-receptor-gpcr-mediated-signaling-events

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

17.9K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. هنا ، نحن تصف تفصيلا التصوير الخلية الحية أساليب التحقيق الكيميائي. نقدم أساليب مضان المجهري لرصد ديناميات spatiotemporal من الأحداث يشير في الخلايا المهاجرة. قياس الأحداث يشير يسمح لنا أن نفهم كذلك كيف شبكة النوع من الاختزال ، يشير يحقق التدرج الاستشعار من chemoattractants و...

Video: Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

تصور الإلتقام بالكلاذرين بوساطة من G مستقبلات البروتين يقترن قرار واحد في الحدث عبر الميكروسكوب TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; من جانب تجميع فحوصات

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين<em&gt; D. discoideum</em&gt; عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...