وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (ES07408 وEB00208).

1. ECIS / سيارات الأجرة الكهربائي التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واستقر لأول مرة سطح الذهب من الصفيف القطب ECIS / سيارات الأجرة (التي تتكون من 8 غرف لكل شريحة) من خلال ما قبل المعالجة العقيمة مع السيستين 10 مليمتر في ماء منزوع الأيونات (DH 2 O) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل السيستين من كل غرفة الكهربائي، شطف 3 مرات مع عقيم O 2 درهم، واستبدالها ب 250 ميكرو لتر من متوسط ​​كاملة (RPMI 1640، 10٪ FBS، 25 العازلة HEPES ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الكهربائي مجموعة الاتصال العلامات على صاحب مجموعة أداة لتنفيذ الاختيار الكهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسيتم تسليط الضوء الغرف التي ترتبط بشكل صحيح في أخضر على شاشة الكمبيوتر. إذا ما سلط الضوء على الغرف في الحمراء، أنت لم تقم بها وينبغي أن القطب إعادة المتمركزة في مجموعة حامل لإقامة اتصالات لجميع الدوائر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وترتبط كل الدوائر، وانقر على زر &quot;الاختيار&quot; في وحدة تحكم البرامج لردعتلغيم المقاومة المبدئية والقيم السعة لكل غرفة. وينبغي أن تكون قيم المقاومة بين 1600 و 2000 أوم، والقيم السعة يجب أن تكون بين 5 و 6 nanofarads لمجموعة غرفة 8. إذا كانت الغرفة ليست ضمن هذه المعايير المقبولة، لا ينبغي أن الدائرة الفردية يمكن استخدامها لجمع البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع القطب من صاحب مجموعة إلى إعداد الفرد غرف الاغاروز. نضح المتوسطة من الغرف وغسل كل غرفة 3 مرات مع معقم O. 2 درهم </li></ol> 2. إعداد الاغاروز الغرف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في العقيمة 15 مل أنبوب البولي بروبلين مخروطي الشكل، وقياس 0.03 غرام من Seakem GTG الاغاروز وإضافة 1 مل العقيمة في برنامج تلفزيوني. استبدال غطاء أنبوب فضفاضة، وإذابة الاغاروز في الأوتوكلاف لدورة دقيقة السائل 2 (ذوبان في الميكروويف ليست فعالة لهذا الفحص). وهذا وقت قصير لا تذوب في أنبوب مخروطي الشكل. لخلايا أقل الحساسية التي لا تحتاج إلى مصل للثقافة، (على سبيل المثال Dictyostelium discoideum) 0.5٪ويمكن إجراء الاغاروز في الوسط المناسب وذابت في الميكروويف. والأوتوكلاف ضروري للخلايا التي تتطلب المصل، كما سيتم هذا التشويه والتحريف إذا ذابت في الميكروويف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 5 مل من المتوسط ​​RPMI كاملة تحسنت في حمام مائي (55 درجة -60 درجة مئوية) مباشرة إلى الاغاروز الساخنة، وإلى تركيز النهائي من 0.5٪ الاغاروز والماصة صعودا وهبوطا إلى مزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 300 ميكرولتر من متوسط ​​الاغاروز ذاب في كل غرفة، استبدال ECIS / سيارات الأجرة تغطية مجموعة والسماح لهلام في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة المتبقية الاغاروز إلى الحد الأقصى من أنبوب 15 مل لتقييم الاغاروز التبلور. وسيتم أيضا هذه الاغاروز الزائدة يمكن استخدامها في جزء (4): قطع الآبار إلى الاغاروز. </li></ol> 3. بناء وشحذ قنية أداة قطع حسنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شحذ 2 14 حقنة عادية مقياس نهاية حادة، وذلك باستخدام 5/64 &quot;بت. تدوير غيض من قمة الحفر في كل افتتاح قنية مع تدريبات سرعة بطيئة، مما يجعل بعض لقمة الحفر يخفض حافة الداخلية بأكملها من كل مرجع قنيةening لتشكيل طليعة حاد الشكل (4A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر اثنين من الثقوب من خلال 1 &quot;× 2&quot; س &quot;شبكي (الشكل 4B-D) مع 5/64&quot; ¼ بت في الحفر الصحافة. إدراج كل شحذ قنية قياس 14 لذلك يبرز على مسافة متساوية من خلال كل ثقب شبكي. </li></ol> 4. قطع ويلز في الاغاروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم حقنة عادية قياس 14 بواسطة المشتعلة بخفة النصائح. قبل قطع الآبار في غرفة ECIS، والسماح للحقنة عادية ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة، أو تهدئة حقنة عادية عن طريق لمس الاغاروز في الحد الأقصى للأنبوب 15 مل. إذا كانت درجة الحرارة من قنية عالية جدا، فإن الاغاروز تذوب كما تقطع غرفة الآبار، مما يجعل الآبار مشوه ومعيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة هذا الزوج قنية فوق النقاط ذهبيتين المحيطة القطب هدف في كل غرفة (الشكل 2C و 5). إدراج قنية عموديا، من دون أي حركة أفقية، ووقف على اتصال لطيف بين قنية وعلى سطح القطب. إزالة بعناية قنية، ومرة ​​أخرى من دون أي حركة أفقية. وضع آبار إضافية للمعارضة التدرجات الممكن أيضا مع إعادة تشكيل رقصة قنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف المكونات الاغاروز التي خلفتها قنية، وذلك باستخدام معقم 9 &quot;باستور ماصة، متصلة فراغ الضغط المنخفض، مع فخ الفراغ قبض الاغاروز النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الاعلام RPMI كاملة لسطح كل غرفة على 37 درجة مئوية، لمدة 2 دقيقة لتشبع الاغاروز، ثم نضح بلطف وسائل الاعلام من على سطح الأرض والآبار من دون إزعاج الاغاروز. </li></ol> 5. تحميل ويلز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل بئر غير قادرة على عقد حجم من 7 ميكرولتر. إلى بئر واحدة في كل غرفة، إضافة 7 ميكرولتر من تعليق خلايا. لخلايا تي Jurkat، استخدام 2 X10 7 خلية / مل. وهذه الخلايا تستجيب إلى 7 ميكرولتر من 200 نانوغرام / مل SDF-1α المخفف في RPMI غير مكتملة، الذي يفتقر الى مصل. استخدام وسائل الإعلام كاملة وحده باعتباره تابع سلبيROL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يتم تحميل الآبار، وعرض كل حجرة من الصفيف مع مجهر مقلوب لضمان خفض جميع الآبار وشغلها بشكل صحيح. يجب أن تكون الخلايا في داخل حدود حدود البئر. إذا تم النظر إليها على حد سواء في الآبار، أو تنتشر خارج حدود الخلية بشكل جيد، ثم شكلت فجوة تحت الاغاروز. لاحظ وضع الآبار غير صحيح حتى، كما لا يمكن أن تفسر بيانات موثوق بها عن تلك الدوائر. </li></ol> 6. جمع البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطب كهربائي في حامل الصفيف وإعادة ربط منصات الذهب على الصفيف الكهربائي إلى دبابيس بوجو بنابض لحامل وانقر على &quot;الإعداد&quot;. وسيتم تسليط الضوء على الآبار التي ترتبط بشكل صحيح في الأخضر. إذا كانت الآبار هي الأحمر، أنت لم تقم بها ويجب أن يكون repositioned القطب في حامل الصفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;8WE1&quot; (8 جيد 1 الكهربائي) من القائمة المنسدلة في لوحة برامج للإشارة إلى تكوين مجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تحقق&quot; في مقاولات البرمجياتلوحة رأ لتحديد المقاومة المبدئية والقيم السعة لكل بئر. يجب أن تكون قيم المقاومة بين 1600 و 2000 أوم، في حين أن القيم السعة يجب أن تكون بين 5 و 6 nanofarads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الترددات متعددة لقياس المقاومة عند ترددات عدة. هناك خيار لتخصيص الترددات، أو باستخدام مجموعة من الترددات الموصى بها. المعيار اكتساب تردد عدة إعدادات التقاط البيانات على ترددات محددة مسبقا 11 (52،5، 125، 250، 500، 1000، 2000، 4000، 8000، 16000، 32000 و 64000 هرتز) بمعدل 8 آبار / دقيقة. ويمكن أيضا أن الفاصل الزمني بين القياسات تخصيصها. جمع بيانات متعددة تردد يسمح لتحليل، مقاومة المقاومة والسعة،. جمع قيم المقاومة عند 4000 هرتز يكفي عادة للدراسات الثدييات الكيميائي خلية، ولكن ترددات إضافية يمكن أن توفر المعلومات في سياقات أخرى 12،13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تعيين مجموع مدة التجربة، على اليد اليمنىيمكن وقفها لوحة، أو التجربة يدويا، بالنقر على &quot;إنهاء&quot; مرة واحدة قد أنتجت خلايا المقاومة التي تدل على وصوله الى القطب. الوقت الذي يستغرقه للخلايا للوصول الى القطب يعتمد على نوع من الخلايا المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;ابدأ&quot; لبدء عملية جمع البيانات. </li></ol> 7. إدارة البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الرغم من أن يمكن تصدير البيانات إلى Excel، برنامج 1600R ECIS، الذي يصاحب نظام ECISθ هو الأسلوب الأكثر فعالية لتحليل ECIS / بيانات سيارات الأجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات والبرمجيات شريط الأدوات يحتوي على أزرار الراديو Z، R، وجيم هذه تحديد ما إذا كان رسم مقاومة، مقاومة، أو السعة، على التوالي، على المحور الرأسي ضد محور س (الوقت المنقضي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبأكبر قدر من الكفاءة عرض ECIS / سيارات الأجرة البيانات والمقاومة على مر الزمن في 4000 هرتز. التقلبات السريعة في المقاومة، أو microtransients (الشكل 1)، هي دليل على حركة الخلوية على قطب كهربائي. تجميع، سص binning نقاط البيانات بحيث يتم رسوم بيانية ليست كل النقاط، لا ينصح لECIS / سيارات الأجرة، لأنه سوف microtransients المتوسط ​​للخروج من البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة أحرز الرسم البياني مع برنامج ECIS1600R، ويمكن تصديره عن طريق اختيار &quot;رسم بياني للتصدير&quot; من القائمة ملف، وحفظ TIF. او. ملف JPG. </li></ol> 8. ممثل النتائج يشار الخلوية الكيميائي زيادة في المقاومة عند 4000 هرتز. وأشار أيضا إلى وصول الخلايا على القطب الهدف من ظهور التقلبات السريعة في المقاومة ودعا microtransients، أو micromotion كما هو موضح في وآخرون مقابل. آل.، 2009 (الشكل 1) 14. يشار إلى نتيجة سلبية من قبل متسقة، أو انخفاضا طفيفا، في المقاومة عند 4000 هرتز، كما رأينا في الحمراء في الشكل 1. غياب microtransients هو أيضا علامة على عدم وجود خلية لحركة القطب. الزيادة في المقاومة الموالية مباشرةportional إلى عدد الخلايا التي تعبر القطب 10. ويمكن إضافة ريتوكسيماب محددة لجاذب كيميائي أو السموم تتداخل مع مستقبلات بروتين G الديناميكي منع الكيميائي 11. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> الشكل 1. تعرضت الكيميائي من الإنسان خلايا تي Jurkat ردا على SDF1α. الإنسان خلايا تي Jurkat (2.0x10 6 خلية / مل) إلى الانحدار من 1α، قوات الدفاع الذاتى (ابتداء من تركيز 100 نانوغرام / مل) أو RPMI 1640 كوسيلة لمراقبة سلبية. ورسوم بيانية للمقاومة التطبيع في 4000 هرتز. انتقل الإنسان Jurkat الخلايا التائية ردا على 1α، قوات الدفاع الذاتى، كما يدل على ذلك زيادة في المقاومة وmicrotransients، في حين كان ينظر أي تحرك مع التعرض لRPMI 1640. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> الشكل 2. رأي كبار من ECIS / سيارات الأجرة الكهربائي withouتي الاغاروز. وتتألف كل قطب كهربائي ECIS / سيارات الأجرة من 8 غرف فردية. كل غرفة تشترك في قطب كهربائي كبير (أ)، وتحتوي على قطب كهربائي هدف فردي (ب). كل غرفة لديها أيضا الدوائر الذهب 2 (ج)، والتي تستخدم كمرشد عندما قطع الآبار في الاغاروز مع حقنة عادية. المربعات الذهب (د) هي منصات الاتصال التي تتصل دبابيس بوجو من أجل تطبيق الحالي ميلان إلى القطب. الأقطاب الهدف الفردية في كل الدوائر مع قطب كهربائي أكبر عداد (ه). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> الشكل 3. يتم قطع بئرين في كل غرفة الاغاروز مملوءة. عند إضافة جاذب كيميائي واحد إضافة إلى أنه ينشر لإنشاء التدرج في الاغاروز، وفقا لأعلى تركيز من chemoattract الأقرب إلى جاذب كيميائي جيد. الخلايا السفر تحت الاغاروز نحو تركيزات أعلى من جاذب كيميائي ويمكن أن تمر عبر القطب الهدف. كماالخلايا عبر القطب الهدف، وسجلت زيادة في المقاومة من خلال برنامج ECIS 1600R. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> الشكل 4. إدراج اثنين من حقنة عادية قياس 14 في شبكي. أ) B 5/64 &quot;مثقاب يستخدم لزيادة رأس قنية.) يجب أن يتم حفر اثنين من الثقوب في شبكي لاستيعاب حقنة عادية عيار 14 وفقا للتخطيط لقطة. ج) استخدام الصحافة الحفر للتأكد من الثقوب متعامدة إلى السطح pleixglass. D) يتم إدراج اثنين من حقنة عادية من خلال شحذ شبكي &quot;¼، 2 مم وبصرف النظر (تقاس من الحواف الداخلية). تندس بعناية هذه حقنة عادية شحذ إلى الاغاروز لقطع الآبار. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> الشكل 5. التوفيق بين حقنة عادية مع نقاط الذهب في ECIS / سيارات الأجرة غرفة. لخفض الآبار، ويجب أن حقنة عادية شحذأن تكون متمشية مع نقاط الذهب المرافقة القطب الهدف على الجزء السفلي من الغرفة ECIS / سيارات الأجرة. ينبغي أن تدرج في حقنة عادية عموديا، من دون أي حركة أفقية، وإزالتها في نفس الطريقة.

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays.">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li><li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay.">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li><li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions.">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li><li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments.">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li><li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis:+an+evaluation+of+the+cortical+expansion.">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li><li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis.">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li><li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells:+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury.">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li><li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers.">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li><li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity.">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li><li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation.">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li></ol>

ديفيد KNECHT ومايكل وينز لديها براءات الاختراع الصادرة للتكنولوجيا ECIS / سيارات الأجرة، والتي كما تم الترخيص من جامعة كونيكتيكت في شركة التطبيقية، الفيزياء الحيوية

خصائص رواية للفحص ECIS / سيارات الأجرة وتشمل قدرتها على أتمتة عملية جمع البيانات في الوقت الحقيقي وخلايا الاستجابة للجاذب كيميائي. في حين أن تطبيق معظم شائعا لهذه التكنولوجيا هو قياس الاستجابات الخلوية لالتدرجات الكيميائي الفردية، أو إلى التدرجات تتكون من خليط من ناه...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> التطبيقية الفيزياء الحيوية </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS الكهربائي صفيف </td><td> التطبيقية الفيزياء الحيوية </td><td> 8W الانجذاب الكيميائي </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG الاغاروز </td><td> تطبيقات BioWhittaker الجزيئية </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone مصل بقري جنيني </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> PEnicillin / الستربتوميسين </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> بنسلين 5000 وحدة دولية / مل؛ الستربتوميسين 5 ملغ / مل </td></tr><tr><td> HEPES الواق </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> حل 1M ثقافة الخلية، الصف </td></tr><tr><td> 14 المقياس الفولاذ المقاوم للصدأ قنية (2) 4 بوصة </td><td> عام مختبر التموين </td><td> 5-8365-1 </td><td> كليل نقطة </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

حركة الخلوية في استجابة للمؤثرات الخارجية أمر أساسي لكثير من العمليات الخلوية بما في ذلك التئام الجروح، والالتهابات، واستجابة للعدوى. وهناك طريقة شائعة لقياس الكيميائي هو فحص غرفة بويدن، حيث يتم فصل الخلايا وجاذب كيميائي بواسطة غشاء مسامي. كما تهاجر الخلايا من خلال غشاء نحو جاذب كيميائي، كانوا متمسكين السفلي من الغشاء، أو الوقوع في وسائل الإعلام الأساسية، وملطخة في وقت لاحق وعدها بصريا 1. في هذه الطريقة، تتعرض الخلايا لالانحدار 1 جاذب كيميائي حاد وعابر، والتي يعتقد أن يكون تمثيل الفقراء من التدرجات وجدت في الأنسجة 2. آخر نظام الفحص، وكيل الاغاروز الكيميائي فحص، 3، 4 حركة الخلية عبر تدابير ركيزة صلبة في الفيلم المائية التي تشكل رقيقة تحت طبقة الاغاروز. الانحدار الذي يتطور في الاغاروز ضحلة، ويعتقد أن يكون التطبيقropriate تمثيل طبيعيا التدرجات. ويمكن تقييم الكيميائي عن طريق التصوير المجهري للالمسافة المقطوعة. وعادة ما يتم تكوين كلا من الدائرة بويدن الفحص وفحص تحت الاغاروز كما المقايسات نقطة النهاية. الآلي ECIS / سيارات الأجرة نظام يجمع بين نهج وكيل الاغاروز مع الكهربائية الاستشعار عن الممانعة الخلوي الركيزة (ECIS) 5 و 6. في هذا الاختبار، وتقع الأقطاب هدف في كل من 8 غرف. وقال كبير لمكافحة قطب كهربائي يعمل من خلال كل دائرة من الدوائر 8 (الشكل 2). يتم تعبئة كل غرفة مع الاغاروز واثنين من الآبار الصغيرة هي قطع في الاغاروز على جانبي القطب الهدف. واحد جيد مليء اختبار سكان الخلية، في حين أن الآخر يحمل مصادر جاذب كيميائي نشرها (الشكل 3). ويمكن استخدام الحالي مرت من خلال نظام لتحديد التغير في المقاومة التي تحدث باسم خلايا تمر فوق القطب الهدف. electrod الخلايا على الهدفه زيادة المقاومة للنظام 6. وبالإضافة إلى ذلك، والتقلبات السريعة في المقاومة تمثل تغيرات في تفاعلات الخلايا التي تحتوي على سطح القطب وتدل على التغيرات الجارية شكل الخلوية. لا يمكن للنظام ECIS / سيارات الأجرة قياس حركة السكان الخلية في الوقت الحقيقي على مدى فترات طويلة من الزمن، ولكن أيضا حساسة بما يكفي للكشف عن وصول خلية واحدة في القطب الهدف. ومن المعروف Dictyostelium discoidium للهجرة في وجود حمض الفوليك التدرج 7 و 8، ويمكن ردها الكيميائي تقاس بدقة بواسطة ECIS / سيارات الأجرة 9. الكيميائي الكريات البيض، واستجابة لSDF1α والخصوم الكيميائي كما تم قياسه مع ECIS / سيارات الأجرة 10 و 11. ويرد مثال على استجابة الكريات البيض إلى SDF1α في الشكل 1.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis at JoVE.com

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

نظام ECIS / سيارات الأجرة هو الآلي، في الوقت الحقيقي فحص الكيميائي الذي يقيس الخلوية. في هذا الاختبار، وخلايا تتحرك تحت طبقة من الاغاروز للوصول إلى القطب الهدف. ويتم قياس حركة الخليوي عن ظهور المقاومة إلى 0 ميلان الحالي.

قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  University of Connecticut. نظام ECIS / سيارات الأجرة هو الآلي، في الوقت الحقيقي فحص الكيميائي الذي يقيس الخلوية. في هذا الاختبار، وخلايا تتحرك تحت طبقة من الاغاروز للوصول إلى القطب الهدف. ويتم قياس حركة الخليوي عن ظهور المقاومة إلى 0 ميلان الحالي.

Video: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

دراسات لاستخدام الانجذاب الكيميائي الجرثومي على microfluidics -- مقابلة

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

جعل التصحيح ، وماصات أقطاب شارب مع بولير برمجة

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

إيماس التصوير في خلايا الشبكية مع القطبين الميكروسكوب TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...