وأيد هذه الدراسة الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا (مشروع منحة رقم 6288480) وسكوبي وكلير الاستئماني ماكينون.

1. Micromixing رد فعل RT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إجراء عملية تفاعل مع RT micromixing ، ويوازن micromixer إلى درجة الحرارة المطلوبة للتفاعل RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع micromixer داخل 37 درجة مئوية (أو درجة الحرارة الموصى بها من قبل المورد RT) حاضنة لللا يقل عن 1 ساعة قبل ظهور رد فعل RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج RT وفقا لتجار وعكس الناسخ (مثل MMTV - RT من Promega ، Omniscript من Qiagen) تعليمات ، باستثناء المبالغ وحيدة الخلية استخدام مدخلات مجموع الحمض النووي الريبي (مثل 0.1-1pg/μl) ، بدلا من ميكروغرام NG - المبالغ الموصى بها من قبل الموردين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فإننا نستخدم عقيمة ، nuclease خالية 200μL رقيقة الجدران أنابيب PCR. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف أنابيب RT آمن في micromixer حالما تكون جاهزة للخلط. يجب أن تبقى داخل micromixer الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة رد الفعل RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التردد والسعة المناسبة لmicromixing. في هذا المثال نستخدم 150Hz. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل micromixer على وتركه لمدة يوم كامل للتفاعل RT (60 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل micromixer قبالة واتخاذ RT أنابيب لمرة وتفاعل RT كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب RT على الجليد والمضي قدما كما هو معتاد مع تطبيقات أخرى مثل كمية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR qPCR أو في الوقت الحقيقي). </li></ol> 2. ممثل النتائج : صالح micromixing في سياق ردود الفعل RT هو زيادة في الغلة [كدنا] بالنسبة إلى عندما تستخدم أساليب خلط الأخرى (الهز على سبيل المثال ، أو vortexing سحن). ويمكن رؤية هذا ، على سبيل المثال ، بناء على تحليل لاحقة من استخدام كمية [كدنا] تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR qPCR أو في الوقت الحقيقي). ويوضح الشكل 2A آثار micromixing لأول 5 دقائق (الأزرق &quot;، micromixed5&quot;) أو في كل 60 دقيقة (أحمر &quot;، micromixed60&quot;) بالمقارنة مع سحن للتفاعل RT مباشرة قبل الحضانة RT (أسود &quot;هرس&quot; ). في هذه الحالة كان حجم رد الفعل RT 25μL السابقة والواردة من الحمض النووي الريبي 2.5pg الإجمالي. وتظهر آثار qPCR باستخدام بادئات مصممة للكشف عن [كدنا] يمثلون Nurr مرنا - 1 أعلاه ، ويتم رسم يعني ± SEMS من عدد من الدورات للوصول إلى 50 ٪ كحد أقصى في 3 مضان يكرر هذه التجربة نفسها أدناه. النجمة ترمز إلى فروق ذات دلالة إحصائية (ANOVA في اتجاه واحد مع مقارنات متعددة توكي). علما بأن micromixing عن الدقائق ال 5 الأولى من رد فعل RT السابقة تنتج تحسنا كبيرا على غير سحن حين micromixing لل60 دقيقة كاملة من رد الفعل RT السابقة تنتج تحسنا كبيرا خلال سحن ، وحجم أي ما يعادل حوالي 15 qPCR دورات في المتوسط. ويمكن أيضا الاستفادة من micromixing أن ينظر في تحليل منحنى ذوبان المنتجات qPCR اللاحقة التي حصل عليها. في التجربة أسفرت هو موضح في الشكل 2B ، micromixing لل60 دقيقة كاملة من رد الفعل RT السابقة في إشارة qPCR متسقة في عينات مكررة (2Ba الشكل (2) ، آثار الحمراء) ، في حين micromixing لأول 5 دقائق أو سحن تنتج سوى qPCR يتعارض آثار (الشكل 2Ba (2) ، آثار زرقاء وسوداء اثار 2 على التوالي). آثار سلبية الرمادية هي الضوابط (&quot;NEG.&quot;) في [كدنا] الذي استبعد من رد الفعل qPCR. عندما كانت المنتجات qPCR من هذه التجربة من خلال زيادة درجة الحرارة متمسخ الخاصة بهم (أي تحليل منحنى ذوبان) كان واضحا أن المنتجات المناسبة PCR (أي amplicon التي تم مطابقة لتلك التي حصل عليها عندما كان يتم نقلها إلى عكس تركيزات أعلى بكثير من مرنا وتضخيمها من قبل qPCR ، وكانت البيانات لا تظهر) الحالي إلا بعد ردود الفعل التي كانت RT micromixed لمدة 60 دقيقة (الشكل 2Bb (2) ، آثار الحمراء). كل الآخرين (أي micromixed5 ، سحن والضوابط السلبية) ولدت amplicon المنتجات البديلة (dimers التمهيدي مثلا). <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. مخطط تدفق بروتوكول لتطبيق معيار micromixing إلى ردود فعل RT المختبر. يتم توفير وصف أكثر تفصيلا لمبدأ المشاركة الفعلية ، micromixer وكيفية بناء micromixer في منزل في المراجع 13،14 <img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. qPCR الممثل البيانات التي توضح فوائد micromixing تطبيقها على ردود الفعل السابقة RT حيدة الخلية تضم كميات قياسية مرنا في ذلك ردود الفعل RT المختبر. qPCR مثال على اثار الكشف عن [كدنا] مرنا تمثل ترميز Nurr - 1 الجينات. تضمنت ردود الفعل السابقة RT 2.5pg من الحمض النووي الريبي في إجمالي حجم 25μL وأجريت في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. وتباينت ردود الفعل من قبل RT سحن ​​من Rمزيج T قبل الحضانة (آثار سوداء &quot;هرس&quot;) ، micromixed خلال الدقائق ال 5 الأولى من رد فعل RT (آثار زرقاء &quot;، micromixed5&quot;) أو لmicromixed 60 دقيقة كاملة من رد الفعل RT (آثار أحمر &quot;micromixed60&quot; ). يتم رسم يعني ± SEMS عدد دورات qPCR المطلوبة لتصل إلى 50 ٪ كحد أقصى مضان أدناه للحصول على ن = 3 من تكرار هذه التجربة. النجمة يشير إلى وجود اختلاف كبير (في اتجاه واحد أنوفا مع مقارنات متعددة توكي). باء آخر تجربة qPCR فحص المنتج Nurr - 1 [كدنا] ، وهذه المرة التالية التي تحتوي على ردود الفعل RT 25pg من الحمض النووي الريبي في إجمالي حجم 25μL. آثار qPCR (أ) فضلا عن تحليل منحنى ذوبان من المنتجات التي تم الحصول عليها qPCR (ب) تعرض لظروف اختلاط مختلفة. كما تتضمن الضوابط السلبية التي لم يدرج [كدنا] في التفاعل RT السابقة (آثار الرمادية &quot;NEG&quot;). وأجريت أيضا ردود فعل RT مع تركيزات أعلى بكثير من قمم مرنا وأنتجت منحنى ذوبان (لا تظهر البيانات) مماثلة لتلك التي في (ب) العينات (آثار أحمر) لmicromixed60.

<ol>
	<li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Funct+Genomic+Proteomic.">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li><li>Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).</li><li>Ottino, J. M., Wiggins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).</li><li>Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).</li><li>Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).</li><li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).</li><li>Jiao, Z. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).</li><li>Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).</li><li>Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).</li><li>Autom, L. a. b. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 11, 399-399 (2006).</li><li>Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 47 (4), 827-827 (2009).</li><li>Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 50 (2), 116-116 (2011).</li><li>Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).</li><li>Riley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ann+Rev+Fluid+Mech.">Ann Rev Fluid Mech.</a> 33, 43-43 (2001).</li><li>Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما تكشف.

ووصف طريقة تطبيق معيار micromixing إلى ردود فعل RT مختبر هنا يمكن ، بطبيعة الحال ، ينطوي مرنا تحصد عبر أي وسيلة (مثل انحلال الخلايا الطبيعية الليزر ، microdissection). يمكن أن تشمل أيضا أية علامات أو أنواع الكواشف RT ، أي درجة الحرارة (في التسامح من المواد من micromixer) ، ولأي فترة من الزم?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> تم عزل الحمض النووي الريبي من مجموع المجمدة المفاجئة مستعدة تماما الكبار شرائح الدماغ المتوسط ​​الماوس </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> عزل الحمض النووي الريبي PicoPure كيت </td><td> النعش ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. </td><td> KIT0204 </td><td> وتتوفر الآن مجموعة من النظم البيولوجية التطبيقية </td></tr><tr><td> الحمض النووي خالية الدناز العلاج وإزالة الكواشف </td><td> Ambion </td><td> AM1906M </td><td></td></tr><tr><td> عشوائي مسدوس الاشعال </td><td> Promega </td><td> C1181 </td><td></td></tr><tr><td> AMV - RT </td><td> Promega </td><td> M5101 </td><td></td></tr><tr><td> تعيين dNTP </td><td> Promega </td><td> U1240 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin ريبونوكلياز المانع </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease خالية من المياه </td><td> Promega </td><td> P1193 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR الأخضر PCR ماجستير ميكس </td><td> تطبيق Biosystem </td><td> 4309155 </td><td></td></tr><tr><td> Hprt إلى الأمام (20mer) : CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hprt العكسي (20mer) : TAT CGT GTC CCC TGA CTG AT </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 إلى الأمام (23mer) : CAG CTC CGA TTT CTT TCC AAC AG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nurr1 العكسي (23mer) : GAG GTC GGT CAT GCT GA CTT AAA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 الطيف. </td><td> الحرارية العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> كوربيت روتور جين RG - 6000 </td><td> كوربيت علوم الحياة </td><td></td><td> وكانت الشركة كوربيت علوم الحياة التي QIAGEN في يوليو 2008 </td></tr></tbody></table>

increasing cdna yields from single-cell quantities of mrna in standard laboratory reverse transcriptase reactions using acoustic microstreaming

ويتم الربط بشكل مثالي مع سلوك التعبير الجيني على مستوى الخلايا وحيدة الخلية. ومع ذلك ، لم يتم تحقيق ذلك بسهولة لأن كمية صغيرة من مرنا عطوب موجودة في خلية واحدة (1-5 ٪ من الحمض النووي الريبي 1 - 50pg الكلي ، أو مرنا 0.01 - 2.5pg ، لكل خلية 1) قبل أن يحط في معظمها يمكن عكس كتب [كدنا] في نسخة مستقرة. على سبيل المثال ، باستخدام الكواشف المخبرية والأجهزة القياسية ، ويمكن أن يكون سوى عدد صغير من الجينات المقررة نوعيا في الخلية 2. وإحدى الطرق لزيادة كفاءة مستوى ردود الفعل العكسي المختبرات (RT) الناسخ (أي معيار الكواشف بكميات ميكروليتر) وحيدة الخلية تتألف من مبالغ ليكون مرنا بسرعة أكبر مزج الكواشف بحيث يمكن تحويلها إلى مرنا [كدنا] قبل أن يتحلل. لكن هذه ليست تافهة لأن في موازين ميكروليتر تدفق السائل الصفحي ، أي الطرق المتاحة حاليا من الاختلاط (أي الهز ، وسحن vortexing) تفشل لانتاج الحركة الفوضوية بفعالية كافية لخلط الكواشف. لحل هذه المشكلة ، الصغيرة الحجم تقنيات الخلط يجب أن تستخدم 3،4. وقد تم تطوير عدد من التكنولوجيات المستندة ميكروفلويديك الاختلاط الذي زيادة غلة رد فعل بنجاح RT 5-8. ومع ذلك ، والتكنولوجيات على microfluidics تتطلب أجهزة متخصصة مكلفة نسبيا والتي لا تتوافر حتى الآن على نطاق واسع. حل أرخص وأكثر ملاءمة هو مرغوب فيه. الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو لشرح كيفية تطبيق تقنية رواية &quot;micromixing&quot; لردود الفعل القياسية RT مختبر وحيد الخلية تضم كميات مرنا بشكل ملحوظ زيادة عائداتها [كدنا]. نجد زيادة غلة [كدنا] من قبل ما يقرب من 10 أضعاف - 100 ، التي تمكن : (1) عدد أكبر من الجينات لتحليلها في كل خلية ، (2) التحليل الكمي لمزيد من التعبير الجيني ، و (3) تحسين كشف منخفضة وفرة الجينات في الخلايا واحد. يستند على micromixing الصوتية microstreaming 9-12 ، حيث ظاهرة الموجات الصوتية نشر حول عقبة صغيرة خلق تدفق يعني قرب العقبة. طورنا الصوتية microstreaming المستندة إلى الجهاز (&quot;micromixer&quot;) مع تبسيط المفتاح ، ويمكن تحقيقه microstreaming الصوتية على ترددات الصوت من خلال ضمان نظام يحتوي على واجهة الهواء السائل مع قليل من دائرة نصف قطرها 13 انحناء. في الغضروف المفصلي لحجم ميكروليتر من محلول في أنبوب يوفر نصف قطرها صغير مناسب للانحناء. استخدام الترددات السمعية يعني أن الأجهزة غير مكلفة ويمكن تنوعا 13 ، وليست معطوبة الأحماض النووية والكواشف الكيميائية الحيوية الأخرى مثل أنها يمكن أن تكون مع sonicators المختبر القياسية.

Watch this Scientific Journal Video about Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming at JoVE.com

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

نحن تصف طريقة جديدة لزيادة الغلة من [كدنا] وحيدة الخلية كميات مرنا في مستوى ردود الفعل على خلاف ذلك المختبر النسخ العكسي. الجدة تكمن في استخدام micromixer ، الذي يستخدم لظاهرة microstreaming الصوتية ، لخلط السوائل في جداول ميكروليتر أكثر فعالية من الهز ، أو vortexing سحن.

زيادة غلال [كدنا] من خلية واحدة كميات مرنا في مختبر قياسي ردود الفعل الناسخ العكسي باستخدام Microstreaming الصوتية

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

increasing-cdna-yields-from-single-cell-quantities-mrna-standard

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  University of Melbourne. نحن تصف طريقة جديدة لزيادة الغلة من [كدنا] وحيدة الخلية كميات مرنا في مستوى ردود الفعل على خلاف ذلك المختبر النسخ العكسي. الجدة تكمن في استخدام micromixer ، الذي يستخدم لظاهرة microstreaming الصوتية ، لخلط السوائل في جداول ميكروليتر أكثر فعالية من الهز ، أو vortexing سحن.

Video: Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

خلق عابر المسامات غشاء الخلية باستخدام طابعة نافثة للحبر القياسية

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or genome sequencing projects, are often difficult to provide for further studies or third parties due to the consumptive nature of the samples. Although now widely distributed over the Pacific coasts of Asia, Australia and North America, individual Pacific oyster specimens are genetically quite diverse and are therefore not directly suitable as the starting material for gene libraries. In this article, we demonstrate the use of unreferenced Pacific oyster specimens obtained from regional seafood markets to generate cDNA libraries. These libraries were then compared to the publicly available oyster genome, and the closest related library was selected using the mitochondrial reference genes Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) and NADH Dehydrogenase (ND). The suitability of the generated cDNA library is also demonstrated by cloning and expression of two genes encoding the enzymes UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) and UDP-xylose synthase (UXS), which are responsible for the biosynthesis of UDP-xylose from UDP-glucose.

We describe a strategy for how to use RNA samples from unreferenced Pacific oyster specimens, and evaluate the genetic material by comparison with publicly available genome data to generate a virtually sequenced cDNA library.

استراتيجية متقاربة لتوليد مكتبة cDNA التسلسل تقريبا من المحار المحيط الهادئ غير المشار إليها

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

زيادة متانة مزارع الخلايا العصبية المنفصلة باستخدام مصفوفة المرجان النشطة بيولوجيا

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the adhesive cure, and the effect of adhesive penetration on the wood interphase; thus, normal testing of a neat adhesive film is generally not useful. Most tests of wood adhesive bond strength are slow, laborious, can be strongly influenced by the wood and do not provide information on the kinetics of cure. Test method ASTM D 7998-19, however, can be used for fast evaluation of the strength of wood bonds. The use of a smooth, uniform, and strong wood surface, like maple face-veneer, and sufficient bonding pressure reduces the adhesion and wood strength effects on bond strength. This method has three main applications. The first is to provide consistent data on bond strength development. The second is to measure the dry and wet strengths of bonded lap shear samples. The third is to better understand the adhesive heat resistance by quickly evaluating thermal sensitivity and distinguishing between thermal softening and thermal degradation.

We present a procedure, ASTM D7998-19, for a rapid and more consistent evaluation of both dry and wet strength of adhesive bonds on wood. The method can also be used to provide information on strength development as a function of temperature and time or strength retention up to 250 &#176;C.

طريقة الاختبار القياسية ASTM D 7998-19 لتطوير قوة التماسك للمواد اللاصقة الخشبية

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has been challenged. Here, we fabricate iron oxide nanoparticle shelled microbubbles (NSMs) through self-assembly, synergizing magnetic, acoustic, and optical responsiveness in one nanotherapeutic platform. Iron oxide nanoparticles serve as both magnetic and photothermal agents. Once intravenously injected, NSMs can be magnetically guided to the tumor site. Ultrasound triggers the release of iron oxide nanoparticles, facilitating the penetration of nanoparticles deep into the tumor due to the cavitation effect of microbubbles. Thereafter, magnetic hyperthermia and photothermal therapy can be performed on the tumor for combinational cancer therapy, a solution for cancer resistance due to the tumor heterogeneity. In this protocol, the synthesis and characterization of NSMs including structural, chemical, magnetic and acoustic properties were performed. In addition, the anti-cancer efficacy by thermal therapy was investigated using in vitro cell cultures. The proposed delivery strategy and combination therapy holds great promise in cancer treatment to improve both delivery and anticancer efficacies.

Presented here is a protocol for the fabrication of iron oxide nanoparticle-shelled microbubbles (NSMs) through self-assembly, synergizing magnetic, acoustic, and optical responsiveness in one nanotherapeutic platform for magnetic hyperthermia and photothermal combination cancer therapy.

المغناطيسي والصوتي والبصري الثلاثي استجابة الفقاعات الصغيرة لارتفاع الحرارة المغناطيسي والعلاج ببوتوذرمال الجمع بين السرطان

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

تحليل مبسط وعالي الإنتاجية لانقباض الخلية الواحدة باستخدام اللدائن المطاطية ذات الأنماط الدقيقة

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...