وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من وزارة الخارجية الامريكية من البحيرات العظمى للطاقة مركز أبحاث الطاقة الحيوية (وزارة الطاقة مكتب العلوم BER - DE - FC02 07ER64494) ومنح DE - FG02 - 91ER200021 من وزارة الطاقة الأميركية ، ومكتب للعلوم الأساسية للطاقة ، شعبة من العلوم الكيميائية ، علوم الأرض والعلوم البيولوجية. نشكر جون كريج سكوت وBorrusch ميليسا عن وضعهم المادي والتبرعات المفاهيمي.

1. إنتاج إنزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج البروتينات في pastoris Pichia عن طريق الاستنساخ من الجينات المقابلة في pPICZ نواقل أو pPICZα والتحول إلى P. pastoris. تنمو الخلايا الموجودة في 300 مل دفعات في قوارير 500 مل حيرة مع الحث الميثانول كل ساعة 24 (بانيرجي وآخرون ، 2010a). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والتركيز على الرواشح desalt الثقافة عن طريق الترشيح تدفق عرضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الأنزيمات في aliquots صغيرة في الجلسرين 20 ٪ عند -80 درجة مئوية. في نطاق التركيز هو 10-10 ملغ / مل. </li></ol> 2. تصميم التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال عدد من الانزيمات لفحصها ، العلوي والسفلي النسب (على سبيل المثال نسبة أقل من 5 ٪ لالإنزيمات الأساسية) ، ونوع من التصميم التجريبي (على سبيل المثال ، من الدرجة الثانية أو مكعب) في Expertsoftware التصميم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المبلغ في حساب ميكروغرام لكل انزيم لتضاف إلى جعل تحميل مجموعه غلوكان مغ / ز 15 ، وثم حساب كمية الانزيم في كل ميكرولتر إضافة إلىكل رد فعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء أوراق عمل Excel تحديد مصدر ابوار ، والآبار المصدر ، ابوار الوجهة ، الوجهة الآبار ، ونقل كميات من المياه للصرف والانزيمات وفقا لتصميم التجارب واستيراده في البرنامج FXP Biomek باستخدام وظيفة النقل ، من الملف. </li></ol> 3. الأنزيمية الحلمأة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الطين الكتلة الحيوية في 50 ملي سيترات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 4.8 ، التي تحتوي على 5 ميكروغرام / مل و 5 التتراسيكلين سيكلوهيكسيميد ميكروغرام / لتر ، في الخزان مجداف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آليا الماصة 200 ميكروليتر من الطين في كل بئر 96 - جيدا لوحات تفاعل عميق جيدا باستخدام سبان - 8 نصائح الماصة 1000 - ميكرولتر مع 0.5 سم مشاركة اقتطاع. خلط الطين مرة واحدة في 100 ميكرولتر / ثانية ، ونضح ثم نفس الحجم من الخزان مجداف والاستغناء في لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن الانزيمات في نفس الطبق باستخدام برنامج دخلت FX بيكمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحات مع capmats pierceable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس والاستفادةلوحات عدة مرات للتغلب على التوتر السطحي. وضع لوحات على 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في التهجين حاضنة الدورية في 10 دورة في الدقيقة. </li></ol> 4. تحديد GLC وXyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لوحات رد فعل لمدة 3 دقائق في 1250 جهاز للطرد المركزي في XG الدلو المتأرجح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكروليتر من طاف في لوحات العادية 96 - جيدا باستخدام جراب AP96 من FX Biomek. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في 90-95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة من أجل تعطيل الإنزيمات ، ومن ثم الطرد المركزي في 1250 x ج لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياسات GLC ، ونقل 12 ميكرولتر من supernatants في لوحات 96 - جيدا العادية. إضافة 192 ميكروليتر من كاشف الجلوكوز (GOPOD) أوكسيديز / البيروكسيداز. احتضان لوحات على 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وقراءة absorbances بنحو 510 نانومتر في microplate القارئ. فارغ هو خليط التفاعل مع عدم وجود الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياسات Xyl ، ونقل 4 ميكروليتر إلى 384 جيدا لوحات. إضافة الكواشف فحص وقراءة لوحات بمبلغ 340 نانومتر. فارغةهي خليط التفاعل مع عدم وجود الانزيم. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل القيم إلى الامتصاصية GLC ٪ وعائدات Xyl استنادا إلى GLC المعروفة وXyl مضمون الكتلة الأصلي. استيراد هذه النسب المئوية وردود في برنامج التصميم الخبراء. التحقق من paramenters الإحصائية للتأكد من أن يتم استيفاء المعايير لنموذج متين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد التنبؤ أفضل نموذج تجريبي. </li></ol> 6. ممثل النتائج مع GENPLAT : (1) خلق مزيج الأمثل للبروتينات نقية الفردية. وتشير النتائج التي إنزيمات مهمة ، في ما والنسب ، وكذلك الانزيمات التي ليست ذات أهمية. بعض البروتينات التي هي وفرة في T. reesei secretome (Nagendran وآخرون ، 2009) ، ومثل Cip1 Cip2 ، ويبدو أن تلعب أي دور في اطلاق سراح GLC من حطب الذرة سابقة التجهيز عن طريق التوسع الألياف الأمونيا (AFEX) أو القلوية HYD<html> روجين بيروكسيد (برنامج مكافحة الجوع) (بانيرجي وآخرون ، 2010b). من ناحية أخرى ، وبعض البروتينات هامة بشكل غير متوقع. على سبيل المثال ، إندو - xylanases الأسر هيدرولاز غليكوزيل 10 و 11 وكلاهما مهم للافراج GLC ، واحد لا يمكن xylanase بديلا عن (ج بانيرجي وآخرون ، 2010b ،.) أخرى. Cel61A ، وهو بروتين صغير في T. reesei secretome ، مهم جدا ولكن ليس لGLC Xyl الافراج عنهم. بعض الأنزيمات الهامة لإطلاق سراح كل من GLC وXyl ، في حين أن البعض الآخر ضرورية فقط من أجل هذا أو ذاك (بانيرجي وآخرون ، 2010c). الإفراج عن خليط الاصطناعية تحتوي على مكونات 16 ، كل بتركيز 0.94 ملغم / لتر (أي خليط غير الأمثل) ، و 38 ٪ من GLC المتاحة من AFEX سابقة التجهيز ، نائب المدير العام. في ظل ظروف مماثلة المائي ، وهو مزيج أمثل ، والتي تراوحت تركيزات العناصر 16 من 0 ٪ إلى 32 ٪ ، أصدرت 52 ٪ من GLC (الشكل 2). هذه التجربة توضح فائدة بناء مخاليط محددة. _content &quot;&gt; (2) خلق من الكوكتيلات المعالجة الأمثل لمختلف / تركيبات الركيزة. الاستعدادات الحالية سلولاز تجارية هي&quot; ذات حجم واحد يناسب الجميع &quot;، وفي الواقع ، فإن أفضل الكوكتيل يعتمد على ركيزة كل والمعالجة و. منتج واحد مثل Accellerase 1000 يعطي غلة مختلفة من ركائز مختلفة سابقة التجهيز في الطريق نفسه ، وركيزة من تعرضوا لنفس المعالجة المسبقة مختلفة (الشكل 1) ، ونحن قد استخدمت لتحسين GENPLAT خليط من الانزيمات النقية لالمعالجة المسبقة المتعددة والمواد الأولية mutiple (بانيرجي وآخرون بن. ، 2010c). الشكل 2 يوضح كيف أن نسب انزيم الأمثل لل16 الانزيمات النقي يختلف عن حطب الذرة AFEX - سابقة التجهيز ، AHP سابقة التجهيز ، حطب الذرة ، ونائب المدير العام AFEX - سابقة التجهيز. ترد سوى 11 الانزيمات في الشكل 2 لأن الأمثل تم العثور على نسب الخمس الأخرى (Cel61B ، AbfB ، Cip1 ، Cip2 وCel12A) لتكون 0 ٪ (بانيرجي وآخرون ، 2010c). (3) رواية اكتشاف انزيم </strاونج&gt;. بناء مخاليط الأمثل من البروتينات النقي هو عملية مستمرة. كما بروتينات جديدة تصبح متاحة في شكل نقي (من مصادر تجارية ، من خلال تعبير مغايرة ، أو عن طريق تنقية) ، يمكن اختبارها بشكل منتظم عن طريق إضافتها لضبط الأمثل الحالي. رواية البروتينات التي تساهم في GLC أو الإفراج Xyl ثم تصبح جزءا من مجموعة جديدة ومحسنة. بهذه الطريقة ، يصبح منبرا GENPLAT لتحديد إنزيمات جديدة لتفكيك الكتلة الحيوية. حققنا مقتطفات من الفطريات الأخرى من T. وألف reesei النيجر نمت على ركائز مختلفة. عززت واحد استخراج سيما GLC الغلة عندما تضاف إلى مجموعة أساسية لدينا. تمت تنقية هذا البروتين المسؤول ويظهر أن يكون هيدرولاز غليكوزيل الرواية غير موجودة في أي تحضير الانزيم التجارية (بانيرجي والتون ، ونتائج غير منشورة). (4) اكتشاف أفضل الانزيمات. بعد أن أظهرت GENPLAT مع الانزيمات التي هي أهم من التدهورالكتلة الحيوية بصفة خاصة ، لدينا فهم أفضل للأنزيمات التي يجب التركيز عليها لتحسينها. يمكن العثور على أمثلة أفضل من الانزيمات الهامة التي تبحث في الطبيعة أو التي الهندسة البروتين. (وهو الانزيم قد يكون &quot;أفضل&quot; من homolog لها reesei T. بطرق عدة ، اعتمادا على الخاصية المطلوبة ، على سبيل المثال انخفضت والنشاط العالي الخاصة ، وزيادة التآزر ، وحساسية بروتين ، أو تعزيز الاستقرار الحراري). GENPLAT يوفر منبرا مفيدا للمعايرة أنزيمات أفضل يحتمل ، لأنه يستخدم مزيج معقد واقعي (وهو أمر مهم لأنه لا يوجد أنزيم الكتلة الحيوية يعمل في عزلة) وركيزة (هام واقعية لأن النتائج مع السليلوز النقي أو ركائز اصطناعية أخرى قد لا تكون ذات صلة lignocellulosic الطبيعية المواد). (5) انزيم التحسين التجاري. كميات كبيرة بما فيه الكفاية من الانزيمات نقية لا وجود لها حتى الآن في العالم الحقيقي. حتى يفعلوا ، والإيثانول المواليةducers يجب الاعتماد على المنتجات التجارية مثل 1000 Accellerase وMultifectXylanase. ومع ذلك ، خليط من الانزيمات التجارية عموما أداء أفضل من أي فرد واحد ، ويمكن استخدامها لتصميم GENPLAT الكوكتيلات الأمثل من الانزيمات التجارية متعددة. الشكل 3 يبين استخدام GENPLAT لتحسين مزيج من أربعة استعدادات الانزيم التجارية. تم العثور على نسب مثالية لإطلاق سراح من GLC AFEX سابقة التجهيز ، نائب المدير العام لتكون 47 ٪ Accellerase1000 ، 27 ٪ Multifect بكتيناز ، و 22 ٪ Novozyme 188 ، و 4 ٪ Multifect Xylanase (بانيرجي وآخرون ، 2010c). ويبين الشكل 3B الاختلافات في المحصول من AFEX GLC - DDG مع استعدادات الانزيم الأربع ؛ الخليط الأمثل التجارية يعطي أعلى عائد من GLC Accellerase1000 وحده ، SpezymeCP وحده ، أو خليط مكون من 16 الاصطناعية. هذه التجربة يشير ايضا الى ان الخليط المكون من 16 الاصطناعية مفقود واحد أو أكثر من الانزيمات اللازمة لإطلاق سراح GLC الأمثل ، والتي هي موجودة في واحد أو أكثر من الإنزيمات التجارية. يمكن أن يكون لنا GENPLATإد لتحديد هذه المكونات. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. رقم واحد تحضير الانزيم التجارية هو الأمثل لجميع ركائز والمعالجة المسبقة جميع. وتمت مقارنة خمس ركائز والمعالجة المسبقة الثلاثة تحت ظروف مماثلة لطحن (0.5 ملم حجم الجسيمات) ، انزيم التحميل (15 ملغ / غ جلوكان) ، وظروف التحلل (48 ساعة و 50 درجة مئوية). ألف الهضم من ركائز AFEX - سابقة التجهيز مختلفة مع Accellerase 1000. باء سابقة التجهيز الهضم من حطب الذرة بواسطة ثلاث طرق مختلفة مع Accellerase 1000 (انظر بانيرجي وآخرون ، 2010c). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. نسب الأمثل للأنزيمات لإطلاق سراح 11 من GLC من AFEX سابقة التجهيز ، حطب الذرة (AFEX - CS) ، بيروكسيد الهيدروجين ، القلوية سابقة التجهيز حطب الذرة (AHP - CS) ، أو سابقة التجهيز ، AFEX المجففة تقطيرERS &quot;الحبوب (AFEX - نائب المدير العام). البيانات هي من بانيرجي وآخرون. (2010c). أرقام على طول الجزء العلوي من القضبان هي غلة GLC كنسبة مئوية من مجموع GLC في العينة الكتلة الحيوية. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3 ألف. استخدام GENPLAT لانتاج أفضل مزيج من أربعة استعدادات الانزيم التجارية من أجل إطلاق سراح GLC من AFEX سابقة التجهيز ، نائب المدير العام. أدلى Multifect Xylanase أصغر مساهمة (4 ٪) ، وبالتالي حذفت من هذا المخطط الثلاثي. باء غلة GLC من AFEX - DDG مع علاجات مختلفة انزيم في ظل ظروف مماثلة المائي (15 انزيم غلوكان مغ / ز ، ح 48 ، و 50 درجة مئوية) . &quot;المكون من أربعة التجارية&quot; لديه النسب المحددة من التجربة هو مبين في الشكل. 3A.

<ol>
	<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , (2007).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction:+production+and+optimization+of+a+core+set.">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+multi-component+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+lignocellulosic+biomass.">Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass.</a> Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+optimization+of+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+diverse+pretreatment/biomass+feedstock+combinations.">Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).</li><li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis.">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li><li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion.">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li><li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+(AFEX)+pretreated+corn+stover.">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li><li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61:+Structure+and+function+of+a+large,+enigmatic+family.">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li><li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture.">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li><li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts.">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li><li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera,+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei.">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li><li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates.">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ومن المعترف به على نطاق واسع أن خفض تكلفة الانزيمات مهم لتطوير صناعة الايثانول lignocellulosic اقتصادية. المتاحة حاليا الكوكتيلات انزيم التجارية هي مزيج معقد ومحددة بشكل واضح من العديد من البروتينات (Nagendran وآخرون ، 2009) ، ويتم تكييفها أساسا للاستخدام على حمض سابقة التجهيز حطب الذرة. من أجل تسريع عملية تطوير أفضل الكوكتيلات الانزيم ، وضعت العديد من المختبرات عالية الإنتاجية منصات لاكتشاف انزيم والتوصيف. وقد أدرجت الجهود المبذولة في هذا المجال واحد أو أكثر من الخصائص التالية كما وجدت في GENPLAT : الاستغناء عن الروبوت من الانزيمات وعجائن الكتلة الحيوية ، والتصميم الإحصائي للتجربة ، و / أو تحديد الآلية لGLC وXyl (برلين وآخرون ، 2007 ؛ ديكر وآخرون. القاعدة ، 2009 ؛. كيم وآخرون ، 1998 ؛ الملك وآخرون ، 2009). GENPLAT تمتد هذه الجهود في وقت سابق ، وأهمها في تعقيد مخاليط الانزيم الذي يمكن تحليلها على الأكثر من 6 عناصر فيفي دراسات سابقة إلى أكثر من 16 في عمل آخر لدينا (بانيرجي وآخرون ، 2010c). الملامح الرئيسية إضافية من GENPLAT يتم استخدام غرفة خلط حبة (الخزان مجداف) التي يمكن أن تبقي عجائن حطب علقت خلال صرفها ؛ لطيف أثناء عملية الهضم خلط بحلول نهاية العام خلال نهاية التناوب ، وتحديد الآلية اللونية من حمض الغلوتاميك وXyl.

المعدات والبرمجيات المستخدمة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خبير تصميم البرمجيات ، الإصدار 8.0 (ستات سهولة ، وشركة ، مينيابوليس ، مينيسوتا) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biomek FXP مختبر أتمتة محطة العمل (بيكمان كولتر ، ، فولرتون ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biomek FXP البرمجيات ، الإصدار 3.3 (بيكمان كولتر ، ، فولرتون ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجداف الخزان (النموذجي VP - 756C 1P100 ، V &amp; P العلمية ، وشركة سان دييغو) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات ، 96 - العميقة (1.5 مل) جيد (Abgene ، فيشر العلمية ، إبسون ، المملكة المتحدة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pierceable capmats (الولايات المتحدة الأمريكية والعلم ، أوكالا ، فلوريدا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدورية حاضنة التهجين (النموذجي 5420 ، VWR) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدلو المتأرجح الطرد المركزي (النموذجي 5810R ، إيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات ، Costar 96 - جيدا (Abgene ، فيشر العلمية ، إبسون ، المملكة المتحدة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات ، وكذلك 384 دينار بحريني (فالكون ، العلوم البيولوجية دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) </li></ol> الكواشف المستخدمة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pastoris Pichia وناقلات : سلالة X33 وpPICZ وpPICZα (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T. reesei وناقلات : سلالة QM9414 (الولايات المتحدة وزارة الزراعة المركز الوطني للبحوث الزراعية استخدامها ، بيوريا ، ايل) ، وpCB1004 EV - (بانيرجي وآخرون ، 2010b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Accellerase 1000 (العدد الكثير 1600844643) (Genencor ، شركة ، روتشستر ، نيويورك) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ملي سترات الصوديوم العازلة ، ودرجة الحموضة 4.8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التتراسيكلين المخزون : 10 ملغ / مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيكلوهيكسيميد المخزون : 10 ملغ / مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GOPOD مقايسة عدة ، وأنواع K - الغلوكوز (Megazyme ، براي ، ايرلندا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزيلوز مقايسة عدة ، وأنواع K - الزيلوز (Megazyme ، براي ، ايرلندا) </li></ol>

genplat: an automated platform for biomass enzyme discovery and cocktail optimization

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.
GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of &tilde;10 pure enzymes requires less than 100 &mu;g of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).
Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are "mixture" experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.
All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For "core" enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as "accessory" are set to 0%. "Core" and "accessory" are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (&beta;-glucosidase), EX3 (endo-&beta;1,4-xylanase, GH10), and BX (&beta;-xylosidase).
<div id="myEventWatcherDiv">
	 </div>

Watch this Scientific Journal Video about GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization at JoVE.com

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT (GLBRC منهاج أنزيم) هو منصة الآلي لاكتشاف والاستفادة المثلى من الكوكتيلات انزيم لتدهور الكتلة الحيوية. ويمكن تكييفه مع المواد الأولية متعددة وخليط من الانزيمات التي تحتوي على مكونات متعددة.

GENPLAT : منبرا الآلي لاكتشاف انزيم الكتلة الحيوية والتحسين كوكتيل

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.3K Views.  Michigan State University. GENPLAT (GLBRC منهاج أنزيم) هو منصة الآلي لاكتشاف والاستفادة المثلى من الكوكتيلات انزيم لتدهور الكتلة الحيوية. ويمكن تكييفه مع المواد الأولية متعددة وخليط من الانزيمات التي تحتوي على مكونات متعددة.

Video: GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel cells.1-3 In most bioelectrochemical applications, enzymes or organelles are immobilized onto an electrode surface with the use of some type of polymer matrix. This polymer scaffold should keep the enzymes stable and allow for the facile diffusion of molecules and ions in and out of the matrix. Most polymers used for this type of immobilization are based on polyamines or polyalcohols - polymers that mimic the natural environment of the enzymes that they encapsulate and stabilize the enzyme through hydrogen or ionic bonding. Another method for stabilizing enzymes involves the use of micelles, which contain hydrophobic regions that can encapsulate and stabilize enzymes.4,5 In particular, the Minteer group has developed a micellar polymer based on commercially available Nafion.6,7 Nafion itself is a micellar polymer that allows for the channel-assisted diffusion of protons and other small cations, but the micelles and channels are extremely small and the polymer is very acidic due to sulfonic acid side chains, which is unfavorable for enzyme immobilization. However, when Nafion is mixed with an excess of hydrophobic alkyl ammonium salts such as tetrabutylammonium bromide (TBAB), the quaternary ammonium cations replace the protons and become the counter ions to the sulfonate groups on the polymer side chains (Figure 1). This results in larger micelles and channels within the polymer that allow for the diffusion of large substrates and ions that are necessary for enzymatic function such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). This modified Nafion polymer has been used to immobilize many different types of enzymes as well as mitochondria for use in biosensors and biofuel cells.8-12 This paper describes a novel procedure for making this micellar polymer enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The synthesis of the micellar enzyme immobilization membrane, the procedure for immobilizing enzymes within the membrane, and the assays for studying enzymatic specific activity of the immobilized enzyme are detailed below.

This article will describe the procedure for synthesizing a hydrophobically modified Nafion enzyme immobilization membrane and how to immobilize proteins and/or enzymes within the membrane and test their specific activity.

مسعور الملح تعديل Nafion لإنزيم الشلل وتحقيق الاستقرار

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; بصري منصة لاختبار العدسات اللاصقة

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is fabricated. It is used to investigate the influence of chamber dimensions on the performance of a conduction micropump and to determine the reliability of the conduction pump when acetone is used as the working fluid. A testing platform is set up to evaluate conduction micropump performance under different conditions. When the chamber height is 0.2 mm, the pump pressure reaches its peak value.

This paper presents a protocol for the fabrication of a conduction micropump using symmetric planar electrodes on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) to test the influence of chamber dimensions on the performance of a conduction micropump.

أداء اختبار منهاج ميكروبومب توصيل مع صفيحة قطب يرتدون النحاس FR-4

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

رواية تقنية جراحية كأساس في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...