فإن الكتاب وأود أن أشكر Viksø نيلسن (Novozymes) للهدية من الانزيمات cellulolytic. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل FP7 التجديد والمشاريع التي BBSRC BB/G016178 وBB/G016194.

1. تحضير عينات نحن نعمل عادة مع نابع إما من النباتات العشبية أو الخشبية. في حالة المواد العشبية التي تزرع النباتات لمرحلة النضج ، وبعد تطوير البذور الجافة التي نجمعها ينبع الشيخوخة حالما يكتمل. ومقطعة الى شرائح ينبع 4 ملم ، ووضعها في قارورة 2 مل مع كرات طحن الثلاثة. في حالة المواد الخشبية ، هي الأرض العينات الى نشارة الخشب الخشنة مع مسار ملف الخشب ومن ثم وضعها في طاحونة الكرة لمزيد من المعالجة. توضع العينات في رفوف داخل طحن / تنسيق محطة (الشكل 1). هذه المحطة يطحن بالتسلسل ، يمزج ، ويزن كل عينة. تم تأسيس عدد من التكرار المطلوبة لكل عينة عن طريق اختبار مواد الأرض في سلسلة من التجارب الأولية ، حيث يتم تحديد التباين الجوهرية لحجم الجسيمات معينة. واخترقت قارورة سعة 2 في القاع ، ويتم الاستغناء عن المواد التي اهتزاز القارورة أكثر من البئر المحدد. يتم التحكم في ذراع تهتز من ردود الفعل من رصيد يسمح لصرفها دقيقة من المسحوق. الروبوت يوزع 4 ملغ / جيد في التحليل القياسي وهناك حاجة إلى 4 التكرار في الحالات القصوى. هذا يسمح بتحليل عينات من النبات 20 / لوحة. 2. المعالجة مرة واحدة يتم تنسيق العينات ، يتم تجهيزها لوحات 96 - جيدا من قبل نظام تداول الآلي السائل (الشكل 2). هنا يتم تنفيذ المعالجة خفيفة على المواد النباتية من خلال إضافة 350 ميليلتر من حمض أو حلول القلوية والتدفئة لوحة على كتلة تكييفها. لتجنب التبخر خلال التحليل ، وأغلقت 96 لوحات جيدا مع مات السيليكون. يمكن تعديل درجة الحرارة ووقت المعالجة وفقا للمواد التي تجري دراستها. درجة الحرارة القصوى ، مع ذلك ، هي 100 درجة مئوية. إجراء بديل لاختبار أشد المعالجة المسبقة هو يمهد للمعالجة المواد خارج الخط ، والقضاء على pretreatmet من العملية. 3. تحليل بالماء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد المواد سابقة التجهيز ، والروبوت يزيل تلقائيا حل المعالجة ، ويغسل ، وجميع الآبار ، و 5 مرات مع 850 ميكرولتر 25 ملم مخزن خلات. يتم تنفيذ يشطف بها مضيفا العازلة في حل المعالجة ، وإزالة لاحقا 50 ٪ من حجم التداول الكلي بعد السماح للمواد الصلبة في العينة إلى تسوية. تم تعيين ذروة الطموح في نصف كتلة السائل لتجنب الشفط المواد الصلبة من قاع البئر ، وليس هناك خسارة ضئيلة من المواد الصلبة باستخدام هذا النهج. بعد هذه يغسل جيدا في درجة الحموضة 4.5 والمواد مستعد لالإنزيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف خليط يحتوي على انزيم حل السليلوزات وhemicellulases بواسطة الروبوت. في كل بئر ، يتم الاستغناء عن 850 ميليلتر من مزيج الأنزيم ، وانتقل إلى لوحة حاضنة 50 درجة مئوية الهز. يتم تنفيذ التحلل القياسية لمدة 8 ساعات ، ولكن يمكن تكييف هذه المرة لغرض التجربة. التحميل انزيم القياسية المستخدمة في الأعشاب هو 7 FPU / غرام من المادة. </li></ol> 4. الكشف عن السكريات المختزلة تم تنفيذ التصميم للحد من السكريات أفرج عنه بعد التحلل باستخدام تعديل 3 - 2 - الميثيل benzothiazolinone hydrozone (MTBH) الأسلوب 3. وقد تم اختيار MBTH والأسلوب الأكثر مناسبة لأنه كان أسهل لأتمتة وأقل عرضة للتداخل من المركبات مثل البروتينات. نحن تعديل هذه الطريقة شديدة الحساسية للاستخدام على منصة الروبوت بحيث يمكن قياسها كميا بدقة في تركيزات السكريات الموجودة في hydrolysates الكتلة الحيوية ، مع حجم النهائي من 250 ميكرولتر الذي هو مناسبة ل96 لوحة ضوئية قياسية أيضا. يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية تلقائيا وتم تنفيذ ثلاثة قرارات مستقلة عن الحد من السكريات لكل فعل تسكر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد التقطت 30 ميكرولتر من حلامة من لوحة البئر العميق ومختلطة مع 45 ميكرولتر من 25 ملم خلات الصوديوم العازلة في صفيحة متجنب 96 PCR جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إضافة 25 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1N و 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على 0.43 ملغم / لتر و 0.14 MBTH DTT ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خلط ، كانت ساخنة لوحة PCR عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في thermocycler أو جهاز مشابه يسلم بالضبط نفس الكمية من الحرارة إلى جميع الآبار 96. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل ردود الفعل الناتجة إلى لوحة ضوئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من كاشف المؤكسدة (0.2 ٪ FeNH4 (SO4) 2 ، حامض Sulfamic 0.2 ٪ و 0.1 ٪ حمض الهيدروكلوريك). تخلط جيدا وتترك لتطوير ما لا يقل عن 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب على كل لوحة تحتوي أيضا على مستوى ردود الفعل nmol 50 ، 100 و 150 nmol nmol الجلوكوز. قراءة في لوحات ضوئية 620 نانومتر. </li></ol> 5. ممثل النتائج : وتعرض أمثلة على أنواع مختلفة من التحليلات في الشكل 3 و 4. تم الحصول على جميع النتائج باستخدام منصة الآلي. الشكل 3 إعادةويعرض زيادة في الحد من السكريات اصدره حضانات ح 8 من الحور الأرض مع كميات متزايدة من الانزيمات cellulolytic. الشكل 4 يقدم آثار الحمضية والقلوية المعالجة على عينات الحور. هيدروكسيد الصوديوم في المعالجة هي أكثر كفاءة من أن تضعف H2SO4 المعالجة في تسهيل الافراج عن السكريات خلال التحلل. وتقاس كمية من السكريات بعد التحلل النقصان عندما يتم تنفيذ المعالجة باستخدام تركيزات أعلى من هيدروكسيد الصوديوم 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. محطة الروبوتية لطحن و 96 تنسيق جيد من الكتلة الحيوية <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. محطة مناولة السائل لتحليل الإنتاجية العالية تسكر <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تأثير أحمال مختلفة على انزيم الافراج عن تخفيض حكمه السكر من عينات الحور <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. تأثير المعالجة المسبقة المختلفة على عينات من الحور تسكر. السكريات ألف أفرج عنه بعد pretreament مع نسب مختلفة من H2SO4 عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. السكريات باء أفرج عنه بعد المعالجة المسبقة هيدروكسيد الصوديوم في نفس درجة الحرارة والوقت من حمض المعالجة .

<ol>
	<li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses.">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li><li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass:+the+writing's+on+the+walls.">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li><li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li><li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials.">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> طحن ويزن الروبوت </td><td> Labman أتمتة </td><td></td></tr><tr><td> 2 مل الأنبوب الصغير مع قبعات </td><td> Sarstedt المحدودة </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 ملم حبات الفولاذ المقاوم للصدأ </td><td> Qiagen المحدودة </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene مربع لوحات تخزين جيد </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> طولكرم - 050 - 050C </td></tr><tr><td> Whatman حصيرة سقف لوحات جيدا مربع 96 </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> السائل hanling الروبوت </td><td> Tecan المجموعة المحدودة </td><td> الحرية ايفو 200 </td></tr><tr><td> حمض الكبريتيك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> BPE359 - 500 </td></tr><tr><td> خلات الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S8750 - 500G </td></tr><tr><td> حامض الخليك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 كذلك لوحات PCR تنورة كامل </td><td> Sarstedt المحدودة </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3 - 2 - الميثيل benzothiazolinone هيدرات هيدرازون هيدروكلوريد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 129739 - 25G </td></tr><tr><td> DL - dithiothreitol </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D9163 - 1G </td></tr><tr><td> كورنينج microplate 96 مسطحة القاع جيدا </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> TKT - 521 - 050H </td></tr><tr><td> dodecahydrate الامونيوم سلفات الحديد (III) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F1668 - 250G </td></tr><tr><td> Sulfamic حمض </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 242772 - 500G </td></tr><tr><td> حامض الهيدروكلوريك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials

ويمكن تقسيم السكريات التي تشكل الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic وصولا الى انتاج مجموعة من السكريات التي يمكن استخدامها لاحقا في إنشاء معامل تكرير أحيائية. وهذه الخامات تشكل منصة الصناعية الجديدة ، وهما أمران غير المستدامة ومحايدة الكربون ، لتحل محل الاعتماد الحالي على الوقود الأحفوري. تنتج تمردات لتفكيك المواد التي لوحظت في الخصائص الذاتية التي lignocellulosic العديد من جدران الخلايا النباتية. السليلوز البلورية مضمن في مصفوفة مثل السكريات وxylans arabinoxylans ، والهيكل كله المغطى من قبل الفينولية البوليمر اللجنين ، وهذا هو أيضا صعبة الهضم 1. من أجل تحسين هضم المواد النباتية نحن بحاجة لاكتشاف الاختناقات الرئيسية لتسكر من جدران الخلايا ومتحولة أيضا شاشة تربية والسكان لتقييم التغير في تسكر 2. هذه المهام تتطلب نهجا إنتاجية عالية ، وهنا نقدم منصة التحليلية التي يمكن القيام بتحليل التسكير في شكل لوحة 96 - جيدا. وقد تم تطوير هذا النظام الأساسي للسماح للفحص هضم lignocellulose أعداد كبيرة من السكان من الأنواع النباتية المختلفة. وقلصت نحن باستمرار حجم رد فعل لمعالجة مسبقة لطيف ، الإنزيمية جزئية والتصميم والسكر ، والسماح لأعداد كبيرة بسرعة المقررة في النظام الآلي. هذا البرنامج يعمل آليا مع كميات مليغرام من الكتلة الحيوية ، وأداء طحن الكرة في ظل ظروف خاضعة للرقابة للحد من المواد النباتية إلى حجم الجسيمات بطريقة موحدة استنساخه. مرة واحدة على عينات من الأرض ، والروبوت الآلي التنسيق يوزع كميات محددة من المواد وسجلت في المقابل من الآبار بئر عميقة لوحة 96 (الشكل 1). عادة ، ونحن الاستغناء عن نفس المادة الى 4 آبار لدينا 4 يعيد للتحليل. مرة واحدة تملأ اللوحات مع المواد النباتية في التخطيط المطلوب ، يتم نقل يدويا لأنها محطة معالجة السائل (الشكل 2). في هذه المحطة التي يتعرض لها عينات إلى المعالجة إما خفيفة مع حمض مخفف أو القلوية وحضنت في درجة حرارة تصل إلى 90 درجة مئوية. بعد ذلك تتم إزالة الحل المعالجة وتشطف العينات مع عازلة لإعادتهم إلى درجة الحموضة مناسبة للالمائي. ثم يتم تحضين العينات مع مزيج الانزيم لفترة من الزمن المتغير عند 50 درجة مئوية. يؤخذ على قسامة من حلامة تلقائيا ، ونحن مصممون على خفض السكريات الأسلوب MBTH اللونية.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

يوصف بسيطة ، طريقة سريعة لتحديد إمكانية تسكر أعداد كبيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. النظام الأساسي لهذا التحليل الآلي ينطوي على إعداد الكتلة الحيوية النباتية للتحليل في 96 لوحات جيدة وأداء لاحقة من التحلل ، المعالجة وتقدير من السكريات الافراج عنهم.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

high-throughput-saccharification-assay-for-lignocellulosic-materials

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Views.  University of York. يوصف بسيطة ، طريقة سريعة لتحديد إمكانية تسكر أعداد كبيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. النظام الأساسي لهذا التحليل الآلي ينطوي على إعداد الكتلة الحيوية النباتية للتحليل في 96 لوحات جيدة وأداء لاحقة من التحلل ، المعالجة وتقدير من السكريات الافراج عنهم.

Video: High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

الكشف عن أهداف ميرنا في إنتاجية عالية باستخدام الفحص 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...