نعترف بدعم من قسم الهندسة البيولوجية وS. كريستوفر بوند مركز العلوم الحياتية في جامعة ميسوري. نعترف منح الدعم من علوم الحياة ميسوري مجلس أبحاث 09-1034 والمعاهد الوطنية للصحة R21CA139186 - 0. ونحن نشكر أيضا فرص بحوث علوم الحياة الجامعية برنامج في جامعة ميسوري ، في جامعة ميسوري علم الخلايا الجزيئية الأساسية ، وجامعة ولاية ميسوري في كلية الهندسة للحصول على الدعم المالي.

1. إعداد عينة الدم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعادل حوالي 10 مليلتر من الدم الكامل من السرطان المريض في المرحلة الرابعة vacutainers two 5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي لمدة عشر دقائق في 3000 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعينة الدم منفصلة في ثلاث طبقات مختلفة : الطبقة السفلية تتألف من كريات الدم الحمراء ، وطبقة وسطى ، كما دعا الطبقة الشهباء ، ويحتوي على كريات الدم البيضاء وخلايا سرطان الجلد ، وتحتوي الطبقة العليا البلازما والصفائح الدموية. وإزالة البلازما أكبر قدر ممكن من دون إزعاج معطف الشهباء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكرولتر من 250 مكان Histopaque 1077 في اثنين من الأنابيب Wintrobe 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 استخدام ماصة باستور &quot;، استخراج البلازما المتبقية ، ومعطف الشهباء بأكملها ، وحتى الطبقة العليا من الكريات الحمراء ، مع التأكد من جمع &lt;500 ميكروليتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حل فوق طبقة Histopaque الطرد المركزي وأنابيب Wintrobe في أنابيب مخروطية 15 مل لمدة 10 دقيقة في 3000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومرة أخرى في الدممنفصلة ، ولكن هذه المرة سوف يتم فصل الكريات الحمراء التي Histopaque ، مما يسمح للاستخراج من معطف سهل الشهباء. استخدام 9 &quot;باستور الماصة للحصول على معطف الشهباء بأكملها ووضعها في أنبوب إيبندورف 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق معطف الشهباء في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني مع 2 ٪ V / V توين 20. </li></ol> 2. تدفق دائرة البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على اسطوانة الاكريليك ، 20 مم الخارجي ، وقطرها الداخلي 17 ملم و 8 ملم طول. حفر ثلاثة ثقوب قطرها 5 ملم من خلال الجانب من الاسطوانة في زوايا 90 درجة عن بعضها البعض. قطع ثلاث قطع من أنابيب البوليمر (1.6 مم الداخلية ، 5 ملم القطر الخارجي) ، ووضعها في الثقوب المحفورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm تمتد عبر الجزء السفلي من الحلقة الاكريليك لجعل المياه ختم مشددة. وparafilm أشكال وعاء الضحلة مع عصابة الأكريليك وسوف يعقد الحل الأكريلاميد التي ستشكل غرفة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق يبلغ قطرها 1.6 ملم سلك طريق قطعة من الأنابيب التي هي على الجانب الآخر منبعضها البعض ، والتأكد من أن الأسلاك وحده وضوحا من خلال منتصف الحلبة. ملء القطعة الثالثة من الأنابيب مع سلك قطره 1.6 ملم وموقف أنبوب 1 ملم بعيدا عن السلك مع وقف التنفيذ. هذه الأسلاك الأكريلاميد منع من دخول الأنبوب. بعد الأكريلاميد يتصلب ، سيتم استخراج الأسلاك ، وترك مسار تدفق اسطواني ومكانا للموقف من الألياف البصرية ويركز على مسار التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 5 مل من الأكريلاميد أعدت [الأكريلاميد ز 20 (سيغما الدريتش) ، 0.7 غرام bisacrylamide (سيغما الدريتش) ، و 100 مل من الماء المقطر] لكوب صغير. قياس من 0،02 غراما من بيرسلفات الأمونيوم (سيغما) ، وإضافته إلى الدورق. المزيج مع التحريك لمدة 3 دقائق. إضافة 20 tetramethylethylenediamene ميكرولتر (فيشر العلمية) إلى الدورق. يصب الخليط بسرعة الى الحلبة الاكريليك ، وملء إلى الأعلى. بعد ثوان قليلة ، فإن الحل هلام ، مما يجعل من العفن غرفة التدفق. سحب الأسلاك بعناية من أصل ، والتأكد من عدم تعكير صفو هلام الأكريلاميد. تدفق شامBER الآن جاهزة للاستخدام. </li></ol> 3. الضوئي flowmetry انشاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزوجان سمعيا a فلوريد البولي فينيل محول الصوتية كهرضغطية (Panametrics) إلى غرفة تدفق باستخدام الموجات فوق الصوتية هلام مباشرة فوق مسار التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الحربة نيل Concelman (BNC) الكابل ، وربط محول لإدخال النطاق العريض لاستقبال - 640A RITEC (lowpass فلتر : الخروج ، highpass التصفية : 1 ميغاهرتز ، imput المعاوقة : 50 أوم ، والتضخيم : 35 ديسيبل). ربط ناتج التصفية على الذبذبات (TDS تكترونكس 2024B). لتحريك الذبذبات ، يتم تعيين الثنائي الضوئي (Thorlabs) قرب محول وموصول الذبذبات باستخدام كبل BNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومرفق T - الموصل (أجزاء صغيرة) للذراع واحدة من الغرفة التدفق. يتم توصيل مضخات المحاقن اثنين (برينتري العلمية) إلى فروع أخرى من الموصل. حقنة واحدة تحتوي على الهواء ، في حين أن الآخر سوف تحتوي على تعليق خلية أعدت في الجزء 1. ضبط معدلات التدفق إلى100 ميكروليتر / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج أنابيب صغيرة من الغرفة حتى تدفق جيب صغير من أشكال الهواء ، وادخال وقطرها 1 مم الألياف البصرية الأساسية مع فتحة 0.37 العددية في تلك الفتحة. ملء الجيب مع الماء للحد من إشارات واجهة وزيادة كمية ضوء الليزر تطبيقها على مسار التدفق. بسبب الفتحة العددية للألياف الضوئية وبعد مسافة قصيرة إلى مسار التدفق ، وأشرق ليزر واحد فقط من عينة سبيكة في أي وقت من الأوقات ، وضمان أن العينة مباشرة أمام الليزر هو نفس العينة خلق إشارات الضوئي. ينبغي أن تكون طاقة الليزر حوالي 28 ميغا جول / سم 2 مع حجم البقعة من 7 ملم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على كل من مضخات المحاقن. وعندما تكون السوائل إمتزاج two تصل إلى تقاطع تي يمكن تقسيم أنها متجانسة في الرخويات وتدفق الماضية محول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق العينة التي تتدفق مع النانوسيكند نابض الليزر لتوليد موجات الضوئي في خلايا سرطان الجلد. والميلانين هو broadbوالبصرية امتصاص ، ويمكن استخدام أي الطول الموجي ليزر مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا إشارة تظهر على الذبذبات عندما سبيكة هو فوق محول ، ويحتوي على سبيكة سرطان الجلد ، وينبغي أن تتبع من خلال اسقاط النظام حتى إلى قارورة جمع. </li></ol> 4. كيمياء سيتولوجية مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الرخويات القبض على 4 Cytospin جهاز طرد مركزي (الحرارية العلمية) من أجل معالجتها على الشرائح الزجاجية. الشرائح الزجاجية في المكان Cytofunnels (EZ Shandon Cytofunnel واحدة مع فلتر براون العلمية الحرارية بطاقة) ، وتحميلها الى جهاز طرد مركزي 4 Cytospin. وضع 100 ميكرولتر من الزلال 1 ٪ المصل البقري (سيغما) في برنامج تلفزيوني في كل قمع ثم الطرد المركزي في 600 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق للمساعدة في القبض على الخلايا العصا على الشرائح الزجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، إضافة إلى عينات الخلايا Cytofunnels ثم الطرد المركزي في 600 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. ثم رش الشرائح مع تثبيتي الايثانول القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق مرتين. </li><lط&gt; لحظر ملزم غير محدد ، احتضان كل شريحة بمزيج من 10 ميكروليتر من المصل عنزة (سيغما) و 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة ، صب الشرائح واحتضان الضد مع الحل الأساسي لمدة 1 ساعة في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة. وينبغي أن تحتوي كل شريحة 1 ٪ مارت 1 الأضداد التي أثيرت في الأرانب ، 1 ٪ CD - 45 الأضداد التي أثيرت في الماوس ، و 10 ٪ مصل عنزة ، وبرنامج تلفزيوني 89 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة ، وتغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تحضين الشرائح في محلول الأجسام المضادة الثانوية ، والتي تلتزم fluorophore إلى الأجسام المضادة. الخليط يحتوي على 0.05 ٪ الماعز المضادة للأرنب الأضداد ، 0.05 ٪ الماعز الأضداد المضادة للماوس ، و 0.1 ٪ مصل الماعز ، وبرنامج تلفزيوني من 99 ٪. يتم تحضين الشرائح في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة ، صب الشرائح يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار للنواة ، احتضان خلايا بنسبة 0.1 ميكروغرام / مل من دابي (Invitrogen) لل1 دقيقة. ثم صب الشرائح ، ويغسل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شن ساترة على عينة الخلية باستخدام 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام للراتنجات المتصاعد لكل شريحة. ختم ساترة مع طلاء الأظافر واضحة للحفاظ على الشريحة. الآن الشرائح جاهزة للتصوير مع المجهر الفلورسنت. </li></ol> 5. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. ويبين الطول الموجي الضوئي من خلايا الدم البيضاء وخلايا سرطان الجلد هنا. خلايا الدم البيضاء ، عدم وجود تصبغ الأصيل ، لا تنتج موجات الضوئي وتظهر كخط مسطح من الضوضاء الإلكترونية (يسار). وتنتج خلايا سرطان الجلد المصطبغة موجة قوية الضوئي (يمين). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 بعد تلطيخ immunocytochemical ، خلايا سرطان الجلد مثقف تظهر اشارات دابي في BLويبرز في حين رق MART1 باللون الأخضر. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. تتراكب الصور لدابي وMART1 ، كما في الشكل 2 ، مع CD45 كمؤشر على الكريات البيض ، وهذا الرقم يدل خلايا سرطان الجلد بين عدة خلايا الدم البيضاء.

<ol>
	<li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells.">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li><li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+approaches+to+isolation+and+characterization.">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li><li>Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+melanoma+cells+in+human+blood+using+photoacoustic+flowmetry.">Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry.</a> , 106-109 (1985).</li><li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system.">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li><li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction.">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li><li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li><li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma:+clinical+implications.">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li><li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers:+a+review.">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li><li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance.">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li></ol>

جون أ. VIATOR هو مؤسس ورئيس شركة VIATOR تكنولوجيز ، وهي شركة لتسويق التكنولوجيات شكلت الضوئي لتحسين صحة الإنسان.

كشف التدرجي لا يزال هناك مجال بحوث مكثفة مع عدد قليل جدا من التطبيقات السريرية بسبب مشكلة صعبة من عزل الخلايا السرطانية النادرة. ويجري حاليا تقييم تقنيات أخرى للكشف عن العديد من لجنة مكافحة الإرهاب ، بما في ذلك RT - PCR ، ميكروفلويديك القبض على الخلية ، والتقاط immunomagnetic ، وغيرها من الأساليب 8-12. ومع ذلك ، كشف الضوئي من المراكز المتعددة الوسائط يبين الوعد كما هي التسمية حرة وتوفر وسيلة سريعة ودقيقة لالتقاط الصور ، امتصاص الجزيئات الصغيرة الخفيفة. وصف بروتوكول لعزل خلايا الدم البيضاء ذات كفاءة عالية ، بعد انخفاض عدد خلايا الدم الحمراء موجودة في العينة. هذه الخلايا شفتين تلويث تمتص ضوء الليزر أيضا ، ولكن على المستوى انخفض بشكل كبير. لضمان خلايا الدم الحمراء لا تتداخل مع شركائنا في نظام الكشف عن سرطان الجلد ، وأدخلت خمس عينات المريض الصحية من خلال النظام وأيا أعطى إشارة ، مشيرا إلى أن خلايا الدم الحمراء موجودة بتركيزات منخفضة بما فيه الكفاية ليمكن التغاضي عنها. وقد أجريت سلسلة من الدراسات تركيز باستخدام خلايا سرطان الجلد مثقف ونظام التدفق الضوئي أثبت الحساسة وصولا الى 1 خلية / ميكروليتر (بيانات غير منشورة). هذه الدراسات مستمرة وستشمل المحاكمات قريبا باستخدام عينات المريض بالسرطان. كما أن هذه التقنية التي يجري تقييمها الضوئي لاستخدامها في غير مصطبغة التدرجي ، مثل سرطان الثدي وسرطان البروستات عن طريق ربط chromophores الخارجية. لقد أجرينا العمل الأولي باستخدام جزيئات الذهب على سرطان cells13. وقد أظهرت هذه الاختبارات أن النانوية يمكن أن توفر الاستيعاب اللازمة لتوليد الموجات الضوئية الضوئي. التحدي هو أن التقنية المتبقية نعلق على مثل هذه الجزيئات الخلايا السرطانية بشكل انتقائي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of circulating melanoma cells using photoacoustic flowmetry

تعميم الخلايا السرطانية (التدرجي) هي تلك الخلايا التي فصلت العيانية من الورم وانتشاره من خلال نظم الدم والأورام الليمفاوية الثانوية 1،2،3 البذور. التدرجي ويمكن استخدام مؤشرات المرض المنتشر والكشف عنها في عينات الدم لتشخيص السرطان ومراقبة استجابة المريض للعلاج. التدرجي منذ نادرة ، أي ما يوازي خلية الورم واحد من بين البلايين من خلايا الدم الطبيعية في مرضى السرطان المتقدمة ، والكشف عنها والتعداد هو مهمة صعبة. نستغل وجود الخلايا الصبغية في الجلد لتوليد معظم الضوئي أو الليزر التي يسببها الموجات فوق الصوتية في عداد الكريات تدفق مخصص للكشف عن خلايا سرطان الجلد المتداولة (CMCS) 4،5. هذه العملية ينطوي على فصل عينة من الدم الكامل باستخدام الطرد المركزي والحصول على خلايا الدم البيضاء طبقة. إذا كان موجودا في الدم كله ، والمراكز المتعددة الوسائط منفصلة مع خلايا الدم البيضاء بسبب كثافة مماثلة. وهذه الخلايا في معلقالفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، والتي أدخلت على مقياس الجريان. بدلا من استمرار تدفق الدم التعليق الخلية ، التي يسببها تدفق نحن اثنان المرحلة من أجل القبض على هذه الخلايا لمزيد من الدراسة. تدفق في المرحلة الثانية ، واثنين من السوائل إمتزاج في نظام ميكروفلويديك يجتمع في مفترق طرق وتشكيل بالتناوب الرخويات من 6،7 السائل. علقت PBS خلايا الدم البيضاء والرخويات الهواء ميكروليتر النموذج المشع التي يتم بالتسلسل مع ضوء الليزر. إضافة لبالسطح إلى الطور السائل يسمح موحدة تشكيل عريانة ويمكن للمستخدم إنشاء الرخويات مختلفة الحجم عن طريق تغيير معدلات تدفق من المرحلتين. الرخويات من الهواء والرخويات من برنامج تلفزيوني مع خلايا الدم البيضاء لا تحتوي على امتصاص الضوء ، وبالتالي ، لا تنتج موجات الضوئي. ومع ذلك ، الرخويات من خلايا الدم البيضاء التي تحتوي على المراكز المتعددة الوسائط واحد حتى تمتص ضوء الليزر والموجات الصوتية انتاج عالية التردد. وتحتجز هذه الرخويات التي تولد موجات الضوئي والتي تم جمعها لتلطيخ cytochemical لverificالنسبة من المراكز المتعددة الوسائط.

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry at JoVE.com

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

وضعنا عداد الكريات تدفق باستخدام الموجات فوق الصوتية الليزر التي يسببها للكشف عن تعميم خلايا سرطان الجلد كمؤشر مبكر من المرض المنتشر.

كشف وعزل خلايا الميلانوما تعميم استخدام Flowmetry الضوئي

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K Views.  University of Missouri. وضعنا عداد الكريات تدفق باستخدام الموجات فوق الصوتية الليزر التي يسببها للكشف عن تعميم خلايا سرطان الجلد كمؤشر مبكر من المرض المنتشر.

Video: Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary tumors at distant sites. CTC count can be used to follow disease progression based on the correlation between CTC concentration in blood and disease severity1. As a treatment tool, CTC could be studied in the laboratory to develop personalized therapies. To this end, CTC isolation must cause no cellular damage, and contamination by other cell types, particularly leukocytes, must be avoided as much as possible2. Many of the current techniques, including the sole FDA-approved device for CTC enumeration, destroy CTC as part of the isolation process (for more information see Ref. 2). A microfluidic device to capture viable CTC is described, consisting of a surface functionalized with E-selectin glycoprotein in addition to antibodies against epithelial markers3. To enhance device performance a nanoparticle coating was applied consisting of halloysite nanotubes, an aluminosilicate nanoparticle harvested from clay4. The E-selectin molecules provide a means to capture fast moving CTC that are pumped through the device, lending an advantage over alternative microfluidic devices wherein longer processing times are necessary to provide target cells with sufficient time to interact with a surface. The antibodies to epithelial targets provide CTC-specificity to the device, as well as provide a readily adjustable parameter to tune isolation. Finally, the halloysite nanotube coating allows significantly enhanced isolation compared to other techniques by helping to capture fast moving cells, providing increased surface area for protein adsorption, and repelling contaminating leukocytes3,4. This device is produced by a straightforward technique using off-the-shelf materials, and has been successfully used to capture cancer cells from the blood of metastatic cancer patients. Captured cells are maintained for up to 15 days in culture following isolation, and these samples typically consist of &gt;50% viable primary cancer cells from each patient. This device has been used to capture viable CTC from both diluted whole blood and buffy coat samples. Ultimately, we present a technique with functionality in a clinical setting to develop personalized cancer therapies.

Circulating tumor cells are isolated from the blood of cancer patients without inflicting cellular damage. Isolation of tumor cells is accomplished using a bimolecular surface of E-selectin in addition to antibodies against epithelial markers. A nanotube coating specifically promotes cancer cell adhesion resulting in high capture purities.

سريع عزل الخلايا السرطانية قابلة للحياة اعارة من عينات الدم من المريض

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

تنظير العين الضوئي متكاملة والطيفي المجال بالاتساق التصوير المقطعي البصري

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

تصوير المثانة الضوئي

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

إعداد وتحليل الضوئي المركبات الخلوية تحتوي على الذهب نانواعواد

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the optical mean free path (~1 mm in skin) with high resolution. By combining optical absorption contrast with the high spatial resolution of ultrasound in a single modality, this technique can penetrate deep tissues. Photoacoustic microscopy systems can have either a low acoustic resolution and probe deeply or a high optical resolution and probe shallowly. It is challenging to achieve high spatial resolution and large depth penetration with a single system. This work presents an AR-OR-PAM system capable of both high-resolution imaging at shallow depths and low-resolution deep-tissue imaging of the same sample in vivo. A lateral resolution of 4 &#181;m with 1.4 mm imaging depth using optical focusing and a lateral resolution of 45 &#181;m with 7.8 mm imaging depth using acoustic focusing were successfully demonstrated using the combined system. Here,&#160;in vivo&#160;small-animal blood vasculature imaging is performed to demonstrate its biological imaging capability.

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Here a switchable acoustic resolution (AR) and optical resolution (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM) system capable of both high resolution imaging at shallow depth and low resolution deep tissue imaging on the same sample in vivo is demonstrated.

للتحويل الصوتية والبصرية القرار المجهر الضوئي ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الحيوانات الصغيرة الدم الأوعية الدموية التصوير

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...