فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور بيمان Hemmati (قسم الطب في جامعة ويسكونسن ماديسون) لتوفير بسخاء H1 اللجان الدائمة ، والدكتور تيم هاكر ، والدكتور سونغ Gouqing والسيدة جيل كوخ من جامعة ويسكونسن فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية مرفق الأساسية لأداء جراحات الماوس. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية من خلال زمالة بحوث الدراسات العليا لفريمان بريان والمعاهد الوطنية للصحة HL089679 R21.

1. خلية المانحة ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS ، والمستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية H1 التكرم تبرعت من قبل الدكتور بيمان Hematti ؛ بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أي نوع من الخلايا من أي نوع الافتراض على المزج في الجسم الحي) عند 70-80 ٪ متموجة مع التربسين 1X (Mediatech ، ماناساس VA) لمدة 5 دقائق. تعطيل التربسين مع α - MEM المتوسطة كاملة (مجانا المضادات الحيوية ، Invitrogen ، كارلسباد كاليفورنيا) 18. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية وطاف بيليه اعادة تعليق في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.5 × 10 6 خلايا لأنبوب الطرد المركزي مل 1.5. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف بعناية. Resuspend بيليه في 300 ميليلتر من الاحتياطي R (النيون نظام ترنسفكأيشن ، Invitrogen) و 6 ميكروغرام (2 ميكروغرام / 5.0 × 10 5 خلايا) من p231 - pCMVe betaAc توقف لوك (Addgene ، كامبريدج ، MA). 3 مل من مكان مؤقت E (Invitrogen) في ميناء لرسو السفن في electroporation بروتوكول الصانع (نظام ترنسفكأيشن النيون ، Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا البلازميد حل ل100 ميكرولتر نيون طرف الماصة وelectroporate مع مدة نبضة من 20 مللي وقوته من 1500 فولت. electroporated مكان الخلايا المخروطية في أنبوب 15 مل تحتوي على 9.7 مل α - MEM المتوسطة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1،5 مرتين إضافية وتجمع الخلايا transfected لانتاج وحدة تخزين ما مجموعه 10 مل. إضافة خلية 10 مل تعليق (1.5 × 10 6 خلايا) إلى قارورة تحتوي على 10 مل T175 α - MEM المتوسطة كاملة. بقاء الخلية بعد electroporation ما يقرب من 30 ٪ ، والعائد حوالي 4.5 × 10 5 خلايا قابلة للحياة في T175. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير α - MEM الكامل المتوسطة 24 ساعة التالية ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfected حصاد الخلايا عند 70-80 ٪ متموجة (~ 2 -- 3 أيام بعد electroporation). تنفيذ عدد خلايا باستخدام عدادة الكريات وresuspend الخلايا بتركيز 1.0 × 10 6cells/50 ميكرولتر من α - MEM المتوسطة كاملة. خلايا تقليل الوقت تقضيه في تعليق للحد من موت الخلايا قبل الحقن. </li></ol> 2. Intramyocardial حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريض التخدير بواسطة isoflurane (فينيكس صيدلة ، وشركة ، القديس يوسف ، MO) على الفئران المعدلة وراثيا هندسيا لجنة المساواة العرقية constitutively recombinase صريح في كل خلية (B6.C - TG (CMV - لجنة المساواة العرقية) 1Cgn / J ، مختبر جاكسون ، بار هاربور ، ME). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعر من منطقة الصدر باستخدام آلات قص الشعر أو كيميائية مزيل الشعر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intubate مع القسطرة قياس 18 (بيكتون ديكنسون وشركاه ، وفرانكلين البحيرات نيو جيرسي) ووضعت على جهاز التنفس الصناعي في الماوس 120-130 الأنفاس في الدقيقة الواحدة مع حجم المخ من 150 ميكروليتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الوحشي عبر الفضاء الوربي fourth بالتالي إنتاج بضع الصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور القلب ، وتجعل منهما 25 ميكرولتر من حقن الخلايا تعليق transfected باستخدام حقنة 1 مل (Temuro الطبية مؤسسة ، سومرست ، نيو جيرسي) و 28 إبرة قياس (Bectعلى ديكنسون وشركاه ، وفرانكلين البحيرات نيوجيرسي). لتخفيف الحقن intramyocardial ومنع الضرر المفرط للهيئة ، ينحني الرأس إبرة ~ 90 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، واستخدام الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص (مثل vicryl) لإغلاق الأضلاع وطبقات العضلات. مغلق خياطة الجلد باستخدام النايلون أو الحرير 4-0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الماوس للتعافي من التخدير وينزع الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تشمل جماعات مكافحة الفئران لجنة المساواة العرقية تلقي الحقن المتوسطة فقط ، والفئران لجنة المساواة العرقية تلقي نفس التركيز من خلايا الفئران ونوع untransfected البرية الخلايا المستقبلة transfected (بدلا من ذلك ، تلقي لجنة المساواة العرقية خلايا الفئران transfected يست عرضة للمصهر). </li></ol> 3. Biophotonic التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خمس وخمس عشرة دقيقة قبل التصوير ، intraperitoneally (IP) ضخ 10 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم الماوس من 15 ملغ / مل مد Luciferin (الفرجار العلوم الحياتية ، Hopkinton ، MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريض التخدير على الفئران عبر isoflurane عند 4 ٪ لتحريض anد 1 -- 2 ٪ للصيانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران مكان مستلق في مربع التصوير مع قناع المنفذة 1 -- 2 ٪ للتخدير isoflurane الصيانة (نظام التصوير Xenogen Biophotonic ، Hopkinton ، MA). ولا يمكن تصوير الفئران عدة بشكل متزامن. صورة الفأر السيطرة زائفة مع فئران التجارب للمقارنة سهلة للإشارة الانارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام البرمجيات الحية صورة (Xenogen) ، مجموعة مناسبة زمن التعرض (عادة 60 ثانية ، انظر النتائج). تعيين مجال الصورة لتناسب الفئران وإبقاء منطقة ثابتة طوال التصوير لمنع التغييرات في الحساسية. تعيين الموضوع في ارتفاع 4.5 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يكتسب كثافة التلألؤ إشارة إلى المقابلة الماوس أو الفئران ضمن الحقل عرض وحفظ الملفات صورة معدلة. صور عملية لإزالة إشارة الخلفية المقابلة لسيطرة أو الماوس unmanipulated. قيم الكثافة أعلاه الخلفية تتوافق مع الخلايا تنصهر داخل الحيوان. ويمكن إجراء تحليل كثافة استخدام البرمجيات الحية صورة (Xenogen) أو فتح تحليل الصور برمجيات المصدر. T<html> ypically ، وهي منطقة ذات الاهتمام (ROI) هو المحدد لمقارنة البيانات بين كثافة الحيوانات والتجارب. </li></ol> 4. ممثل النتائج لتحديد حساسية نظام تصوير Xenogen Biophotonic ، خط الخلية التي تعبر عن constitutively luciferase (231 - D3H1 لوك ​​، Xenogen) تم تسليمها إلى عضلة القلب من C57/Bl6 الفئران (مختبر جاكسون). تم حقن الخلايا بتركيزات 1 × 10 6 ، 1 × 10 3 أو 1 × 10 1 الخلايا. ست ساعات بعد الولادة الخلية ، تم حقن الفئران مع intraperitoneally luciferin وتصويرها باستخدام نظام Xenogen. ويمكن الكشف عن وجود إشارة محددة مع الخلايا 1000 (2 من 6 الفئران المصورة ، والشكل 2) ، ولكن كان الكشف عن أكثر موثوقية مع 10000 الخلايا (6 من 6 الفئران المصورة). الأهم من ذلك ، عملت هذه الدراسة أيضا إلى إقامة علاقة تقريبية بين عدد من خلايا luciferase التعبير عن وكثافة الإشارة. و&gt; لإثبات فائدة من وصفها في بروتوكول اكتشاف وتتبع الانصهار الخلية ، transfected اللجان الدائمة مع البلازميد LoxP الشباك LoxP - Luciferase (Addgene) وتسليمها للعضلة القلب من لجنة المساواة العرقية ، معربا عن الفئران. حوالي اسبوع واحد بعد الولادة الخلية ، تم تصوير first الفئران باستخدام نظام Xenogen دون مد luciferin الحقن. وكما هو متوقع ، من دون الركيزة الأنزيمية ، الكشف عن أية إشارة كثافة (الشكل 3). المقبل ، تم حقن D - luciferin intraperitoneally وإشارة إلى كثافة luciferase المقابلة ، وبالتالي تم الكشف عن خلية انصهار في اثنين من أربعة الفئران التي تم اختبارها. تم الكشف عن إشارة مماثلة بعد أسبوع واحد (الشكل 3) ، وامكان الحفاظ على المنتجات الانصهار MSC - يقترن في الجسم الحي ، وفي هذه الحالة ، أنهيت دراسة للسماح لتقييم القلب والأنسجة المحيطة بها ، ولكن واحدة يمكن أن نتصور على المدى الطويل التحليلات والتصوير أكثر تواترا لتتبع الصيانة ، وانتشار anد الهجرة ربما من المنتجات الانصهار في الفئران. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي للتقنية لكشف خلية الانصهار في الجسم الحي ، وإذا الانصهار بين لجنة المساواة العرقية ، معربا عن خلايا فأر والخلايا المزروعة تعبر عن البلازميد floxed luciferase حدوث ذلك ، سوف يتم التعبير عن luciferase. يمكن اكتشافه عن طريق حقن Luciferase الركيزة الأنزيمية ، D - luciferin ، في الماوس ثم التصوير الماوس باستخدام نظام التصوير Xenogen Biophotonic (بتصرف من 19) <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig2.jpg" /> الشكل 2. حساسية الكشف عن luciferase ، معربا عن الخلايا في أنسجة القلب مع التصوير biophotonic. تم تسليم خط الخلية التي تعبر عن constitutively luciferase (231 - D3H1 لوك ، Xenogen) إلى الفضاء intramyocardial C57/Bl6 من الفئران في مختلف مجموع أرقام الخلية. صور ممثل إعادة الفئرانوكان يحصلوا 1 × 10 6 ، 1 × 10 3 و 1 × 10 1 الخلايا (من اليسار إلى اليمين) وترد ، أجرى التصوير حوالي 6 ساعات بعد الحقن. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig3.jpg" /> الشكل 3. وكانت transfected الكمي للفي التلألؤ فيفو إرشادية فيوجن الخلية. اللجان الدائمة مع LoxP الشباك Luciferase - LoxP البلازميد وتسليمها للعضلة القلب من لجنة المساواة العرقية ، معربا عن الفئران. حوالي اسبوع واحد وأسبوعين بعد الولادة الخلية ، تم تصوير الفئران لجنة المساواة العرقية باستخدام نظام التصوير Xenogen Biophotonic لقياس كثافة التلألؤ الإرشادية للانصهار الخلية. (أ) من تراكب الصورة وشدة التلألؤ من الشام والفئران 1-4 (من اليسار إلى اليمين) 17 يوما بعد الولادة الخلية. (ب) من شدة التلألؤ من الشام والفئران 1-4 (من اليسار إلى اليمين) 17 يوما بعد الولادة الخلية. وتم اختيار منطقة الفائدة (الصفراء) المقابلة لموقع الحقن ، وكثافة لوتم تحديد evels باستخدام ImageJ (مصدر مجاني) برنامج 20. (C) وتطبيع كثافة التلألؤ إلى نفس المنطقة لسعر الفائدة على الماوس صورية لجميع الظروف التجريبية. في أسبوع واحد ، وأظهرت الفئران 3 و 4 إشارة إيجابية التلألؤ اقتراح الاندماج التلقائي للخلية الماوس وMSC المزروعة. استمرت في إشارة الماوس 3 في غضون اسبوعين. لتحديد الجهاز محددة توطين إشارة إلى المقابلة الماوس 3 ، تعرضت التجويف الصدري وأجهزة تصوير ورفعه الابتدائي. (د) تراكب من الصور الفوتوغرافية وشدة التلألؤ من الماوس 3. التعريب علما إشارة كثافة في الأمعاء الدقيقة. (E) شدة التلألؤ من الماوس 3. (F) تراكب من الصور الفوتوغرافية وشدة التلألؤ من الماوس صورية. (ز) من شدة التلألؤ من الماوس صورية.

<ol>
	<li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Human Placenta. , (2000).</li><li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta.">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li><li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia.">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li><li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+debris,+oxidative+stress+and+pre-eclampsia.">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li><li>Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+of+cells+between+species+yields+transdifferentiation+and+retroviral+transfer+in+vivo.">Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo.</a> FASEB. J. 18, 548-550 (2004).</li><li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+hematopoietic+cells+generate+cardiomyocytes+at+a+low+frequency+through+cell+fusion,+but+not+transdifferentiation.">Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation.</a> Nat. Med. 10, 494-501 (2004).</li><li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion.">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li><li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts.">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li><li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium.">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li><li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+(Kap)-luciferase+transgenic+mice.">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li><li>Weir, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophotonic+imaging+in+HO-1.luc+transgenic+mice:+real-time+demonstration+of+gender-specific+chloroform+induced+renal+toxicity.">Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity.</a> Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).</li><li>Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+bioluminescent+Brucella+melitensis+mutants+GR019+(virB4),+GR024+(galE),+and+GR026+(BMEI1090-BMEI1091)+confer+protection+in+mice.">Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice.</a> Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li><li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice.">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li><li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model.">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li><li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice.">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li><li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation.">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li><li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+transplantation+in+rats:+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site.">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li><li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li><li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+cell+fusion.">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصف الأسلوب هنا يسمح ، للمرة الأولى ، وتحديد وتحليل منفصلة الزماني للانصهار الخلية في الكائنات الحية ، بما في ذلك الحيوانات الصغيرة. نهج يجمع بين لجنة المساواة العرقية ، مع إعادة التركيب LoxP اللاحقة biophotonic تحليل الصور. هذا النهج هو قابلة للتتبع ليس فقط الخلايا خلايا ا?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> النيون ترنسفكأيشن النظام </td><td> Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا </td><td> MPK5000 </td><td></td></tr><tr><td> نيون 100 كيت ميكرولتر </td><td> Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا </td><td> MPK10025 </td><td> ويحتوي الاحتياطي R E </td></tr><tr><td> A - MEM مسحوق </td><td> Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل البقر (FBS) </td><td> Hyclone ، لوغان UT </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> B6.C - TG (CMV - لجنة المساواة العرقية) 1Cgn / J </td><td> مختبر جاكسون ، بار هاربور ، ME </td><td> 006054 </td><td></td></tr><tr><td> 10X التربسين </td><td> فيشر العلمية والغابات في الحديقة ، ونيو جيرسي </tد&gt; <td> MT - 25 - 054 - الكلورين </td><td></td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> فيشر العلمية والغابات في الحديقة ، ونيو جيرسي </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> D - Luciferin </td><td> الفرجار العلوم الحياتية ، Hopkinton ، MA </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Xenogen نظام التصوير Biophotonic </td><td> الفرجار العلوم الحياتية ، Hopkinton ، MA </td><td> IVIS الطيف </td><td></td></tr><tr><td> الصوديوم Biocarbonate </td><td> سيغما الدريتش ، وسانت لويس ، MO </td><td> S6014 - 500G </td><td></td></tr><tr><td> غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr></tbody></table>

a cre-lox p recombination approach for the detection of cell fusion in vivo

وقد استخدمت هذه القدرة من اثنين أو أكثر من الخلايا من نفس النوع على المزج بين التطور في جميع أنحاء metazoans لتشكيل أجهزة معقدة كثيرة ، بما في ذلك الهيكل العظمي والعضلات والعظام والمشيمة. الدراسات المعاصرة تثبت انصهار خلايا من نفس النوع تمنح وظيفة المحسنة. على سبيل المثال ، عندما خلايا الأرومة الغاذية من الصمامات المشيمة لتشكيل الأرومة الغاذية المخلوية ، والأرومة الغاذية المخلوية أقدر على نقل المواد الغذائية والهرمونات عبر حاجز الأم والجنين من غير مدمجة trophoblasts 1-4. المزيد من الدراسات الحديثة تظهر مزيجا من أنواع مختلفة من الخلايا يمكن أن يوجه مصير الخلية. وكان يعتقد مرة واحدة &quot;الارتداد&quot; أو تعديل مصير الخلية التي الانصهار إلى أن تقتصر على أنظمة الثقافة الخلية. بل أدى ظهور زرع الخلايا الجذعية لاكتشاف من قبلنا وغيرها من الجهات التي يمكن أن الخلايا الجذعية تندمج مع الخلايا الجسدية في الجسم الحي والتي تسهل الاندماج تمايز الخلايا الجذعية 5-7. وهكذا ، والانصهار الخلية هو تنظيم عملية جيمكن apable تعزيز بقاء الخلايا والتمايز ، وبالتالي يكون من الأهمية المركزية لإصلاح وتطوير الأنسجة وحتى التسبب في المرض. الحد من الانصهار دراسة الخلية ، هو الافتقار إلى التكنولوجيا المناسبة ل1) تحديد المنتجات بدقة والانصهار 2) تتبع المنتجات الانصهار مع مرور الوقت. هنا نقدم منهجا جديدا لمعالجة كل القيود عن طريق تحريض تلألؤ بيولوجي على الانصهار (الشكل 1) ؛ ويمكن الكشف عن تلألؤ بيولوجي مع حساسية عالية في الجسم الحي 15/08 ونحن الاستفادة من بناء ترميز luciferase يراعة (Photinus البرالس) وضعت بالقرب من الجين a كودون وقف يحيط بها سلاسل LoxP عند التعبير عن هذه الخلايا بخلايا فتيل الجين التعبير عن بروتين recombinase لجنة المساواة العرقية ، والمشقوق المواقع LoxP ورفعه إشارة تكف عن السماح النسخ من luciferase. لأن الإشارة induciبلي ، من حدوث إشارات إيجابية كاذبة منخفض جدا. على عكس الطرق الحالية التي تستخدم نظام لجنة المساواة العرقية / LoxP 16 ، 17 ، أدخلنا إشارة &quot;حية&quot; الكشف وبالتالي تحمل للمرة الأولى الفرصة لتتبع حركية الانصهار خلية في الجسم الحي. للتدليل على النهج ، معربا عن الفئران بتواجد مطلق لجنة المساواة العرقية recombinase بمثابة المستفيدين من الخلايا الجذعية transfected مع بناء للتعبير عن المصب luciferase من كودون وقف floxed. تم زرع الخلايا الجذعية عن طريق الحقن intramyocardial وبعد إجراء زرع تحليل الصور intravital لتتبع وجود المنتجات الانصهار في القلب والأنسجة المحيطة بها على مر الزمن. ويمكن تكييف هذا النهج لتحليل خلايا الانصهار في أي نوع النسيج في أي مرحلة من مراحل المرض ، وتطوير أو إصلاح الأنسجة الكبار.

Watch this Scientific Journal Video about A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo at JoVE.com

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

ووصف طريقة لتعقب الخلية الانصهار في الكائنات الحية على مر الزمن. ويستخدم نهج لجنة المساواة العرقية.<em&gt; LoxP</em&gt; التوحد للحث على التعبير luciferase الانصهار الخلية. ويمكن الكشف عن إشارة الانارة ولدت في الكائنات الحية باستخدام نظم التصوير biophotonic مع حساسية الكشف عن الخلايا 1000 ~ في الأنسجة الطرفية.

أ ف التوحد لجنة المساواة العرقية ، السلمون المدخن النهج للكشف عن خلية الانصهار في فيفو</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

a-cre-lox-p-recombination-approach-for-detection-cell-fusion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

18.7K Views.  University of Wisconsin-Madison. ووصف طريقة لتعقب الخلية الانصهار في الكائنات الحية على مر الزمن. ويستخدم نهج لجنة المساواة العرقية. LoxP التوحد للحث على التعبير luciferase الانصهار الخلية. ويمكن الكشف عن إشارة الانارة ولدت في الكائنات الحية باستخدام نظم التصوير biophotonic مع حساسية الكشف عن الخل...

Video: A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, environmental/agricultural/biodefense monitoring, nanobiotechnology, and more. For diagnostic applications, monitoring (detecting) the presence, absence, or abnormal expression of targeted proteomic or genomic biomarkers found in patient samples can be used to determine treatment approaches or therapy efficacy. In the research arena, information on molecular affinities and specificities are useful for fully characterizing the systems under investigation.
Many of the current systems employed to determine molecular concentrations or affinities rely on the use of labels. Examples of these systems include immunoassays such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR) techniques, gel electrophoresis assays, and mass spectrometry (MS). Generally, these labels are fluorescent, radiological, or colorimetric in nature and are directly or indirectly attached to the molecular target of interest. Though the use of labels is widely accepted and has some benefits, there are drawbacks which are stimulating the development of new label-free methods for measuring these interactions. These drawbacks include practical facets such as increased assay cost, reagent lifespan and usability, storage and safety concerns, wasted time and effort in labelling, and variability among the different reagents due to the labelling processes or labels themselves. On a scientific research basis, the use of these labels can also introduce difficulties such as concerns with effects on protein functionality/structure due to the presence of the attached labels and the inability to directly measure the interactions in real time.
Presented here is the use of a new label-free optical biosensor that is amenable to microarray studies, termed the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS), for detecting proteins, DNA, antigenic material, whole pathogens (virions) and other biological material. The IRIS system has been demonstrated to have high sensitivity, precision, and reproducibility for different biomolecular interactions [1-3]. Benefits include multiplex imaging capacity, real time and endpoint measurement capabilities, and other high-throughput attributes such as reduced reagent consumption and a reduction in assay times. Additionally, the IRIS platform is simple to use, requires inexpensive equipment, and utilizes silicon-based solid phase assay components making it compatible with many contemporary surface chemistry approaches.
Here, we present the use of the IRIS system from preparation of probe arrays to incubation and measurement of target binding to analysis of the results in an endpoint format. The model system will be the capture of target antibodies which are specific for human serum albumin (HSA) on HSA-spotted substrates.

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Quantitative, high-throughput, real-time, and label-free biomolecular detection (DNA, protein, etc.) on SiO2 surfaces can be achieved using a simple interferometric technique which relies on LED illumination, minimal optical components, and a camera. The Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS) is inexpensive, simple to use, and amenable to microarray formats.

اكتشاف الجزيئية البيولوجية توظيف الانعكاس التداخل التصوير الاستشعار (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;،<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; واسماك الزرد

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

حقن مكروي الجرح الفحص و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

جلد كامل عيب نموذج في تقييم الأوعية الدموية من الحيوية<em&gt; في فيفو</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

المفاعلات الحيوية الألياف المجوفة ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تشبه الثدييات زراعة الأنسجة

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...