وأيد هذا العمل من قبل وكالة أبحاث السلوفينية (J2 - 9764 مشروع وبرنامج P2 - 0249). هذا الفيديو يمثل المواد التكميلية عن &quot;تقنيات Electroporation القاعدة والعلاج&quot; ورشة عمل علمية ودورة الدراسات العليا ، الذي نظمته كلية الهندسة الكهربائية في جامعة ليوبليانا ، سلوفينيا.

أولا تحميل الخلايا مع الخلايا بتتبع CMFDA وCMRA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أجريت تجارب على خلايا سرطان الجلد معدة مسبقا من الماوس خط الخلية (B16 - F1). تزرع الخلايا في اثنين من فصل القوارير 25 سم ثقافة 2 (TPP ، ZDA) لالتقاء 70-80 ٪ في المتوسط ​​الثقافة DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ ، 0.15 ملغ / مل L - الجلوتامين ، 16 ملغ / مل جنتاميسين (جميع من سيغما الدريخ ، ألمانيا) ، 200 وحدة / مل crystacillin (شركة بليفا ، كرواتيا) ، وحضنت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد two الأسهم 10 ملم حلول تعقب الخلية (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وذلك بإضافة 10.76 ميكرولتر و 9 ميكرولتر (على الأخضر والبرتقالي CMFDA CMRA ، على التوالي) من DMSO (سيغما الدريخ ، ألمانيا) إلى 50 ميكروغرام من الصبغة في النص الأصلي Invitrogen القارورة. ويمكن تخزين محلول المخزون في ثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أشهر. قبل البدء في التجارب ، والاحماء الحل حتى تذوب بلورات DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد خالية من بيكربونات كريبس - Hepes العازلة (130 مم كلوريد الصوديوم و 4.7 ملي بوكل ، 1.2 ملي MgSO 4 ، 1.2 ملم KH 2 PO 4 ، 11.7 ملي D - غلوكوز ، 1.3 ملي CaCl 2 ، 10 HEPES ملي ، ودرجة الحموضة 7.4). في اثنين من 15 مل إيبندورف أنابيب منفصل مزيج 2.1 ميكرولتر من كل حل سهم (10 ملم أو CMFDA CMRA ، على التوالي) في 3 مل من العازلة كريبس - Hepes بيكربونات خالية. هذه الغلة &quot;حل تحميل&quot; التي تحتوي على ما يقرب من 7 CMFDA ميكرومتر (أو CMRA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرتين مع العازلة كريبس - Hepes بيكربونات خالية من ثم إدراج وتحميل حلول في قوارير. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الكواشف حضانة first يمر بحرية من خلال أغشية الخلايا ، ولكن مرة واحدة داخل الخلية ، وتحولت إلى خلية الكواشف impermeant منتجات التفاعل الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة الأولى ، واحتضان شطف الخلايا مع مستنبت لمدة ساعتين في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا في كل من قوارير (محملة CMFDA وCMRA) ومزيج خلايا الدم الحمراء والخضراء معا في نسبة 1:1 في أنبوب الطرد المركزي 50 مل (TPP ، ZDA). ضبط تركيز الخلية إلى الخلايا 5 × 6 / 10 مل من قبل مع تخفيف DMEM المتوسطة أو مع تركيز أجهزة الطرد المركزي. مكان انخفاضا بنسبة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من لوحة multiwell 24 (TPP ، ZDA). احتضان خلايا في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح لهم نعلق قليلا على سطح البئر وإقامة اتصالات الخلية. </li></ol> II. الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد isoosomolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 250 ملي السكروز) وhypoosmolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 75 ملي السكروز) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع multiwell مع الخلايا على موقف المجهر ، مرحلة الأقطاب في قاع البئر وربطها مولد النبض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1 مل من isoosomolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم. إضافة 350 ميكرولتر من hypoosmolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم من أجل حمل تورم الخلية. ينبغي أن تغطي العازلة الأقطاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلايا في hypoosmolar العازلة لمدة 2 دقيقة قبل تطبيق نبضات كهربائية. خلال هذا الوقت من تدفق جزيئات الماء في الخلايا نتيجة لاختلال التوازن التناضحي بين الداخل والخارج من الخلايا يسبب زيادة حجم الخلية. ينبغي أن تطبق النبضات الكهربائية عند الخلايا هي قريبة من أحجامها القصوى ، وذلك قبل بدء انخفاض حجم التنظيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الكهربائي الأمثل والحفاظ على سلامة الخلية ، يجب استخدام المعلمات الأمثل للنبضات الكهربائية. هذه تعتمد على خط الخلية المستخدمة [1]. في هذه التجربة يتم تطبيقها قطار من 8 البقول مستطيلة (مع كل مدة من 100 ميكرو ثانية في 1 هرتز) لكل عينة ، وذلك باستخدام جهاز electroporation (Cliniporator في حالتنا ، IGEA ، إيطاليا). يتم تسليم لنبضات كهربائية متوازيين سلك حزب العمال / عير بقطر 0.8 ملم و 5 ملم المسافة بينهما ، وتهيئة المجال الكهربائي لحوالي 1200 V / سم بين الأقطاب في كل بئر ، باستثناء عنصر التحكم بشكل جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلايا دون عائق لمدة 10 دقيقة بعد الولادة النبض. تحديد العائد الانصهار عن طريق الفحص المجهري النقيض الفلورسنت والمرحلة. </li></ol> III. الحصول على الصور وتحديد العائد الانصهار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلاحظ في الخلايا باستخدام المجهر مضان (في حالة لدينا زايس AxioVert 200 ، زايس ، ألمانيا) مجهزة هدفا (X20) وكاميرا CCD تبريد (VisiCam 1280 ، Visitron ، ألمانيا). يتم الحصول على الصور في MetaMorph 7.1.1 (الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ولكن يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مشابهة يمكن اكتساب. هو متحمس CMFDA مع مستوحد اللون (فازة الرابع ، Visitron والمانيا) في 492 نانومتر و 548 نانومتر في CMRA. ويتم الحصول على ومضان من CMFDA CMRA باستخدام مرشحات الانبعاثات ، أحدهما يركز على نانومتر 535 (HQ535/30m ، لCMFDA) وتركز الأخرى على 510 نانومتر (D605/55m ، لCMRA ، سواء كروما ، الولايات المتحدة). منعت استخدام مزدوج اللون المرآة (Q515LP) الحديث عبر القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ثلاث صور (المرحلة النقيض والأحمر والأخضر ومضان) لمدة خمسة حقول اختيارها عشوائيا في كل بئر. إنشاء صور ثلاثة من كل قناة الثلاثي الصورة. ويمكن في مثل هذه الصورة أن ينظر إلى السيتوبلازم الاستشعاع مع أغشية الخلايا. وبالتالي يمكن أن تنصهر فيها خلايا تحدد بسهولة [الشكل 1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد كافة الأنواع الثلاثة من الخلايا (الأحمر والأخضر والفلورسنت مزدوج) في كل صورة القناة الثلاث. تحديد نسبة الخلايا الفلورسنت مزدوج بقسمة عدد الخلايا الفلورسنت بشكل مزدوج مع عدد من كافة الخلايا في كل صورة. يتم تعريف العائد الانصهار كنسبة مئوية من الخلايا الفلورسنت مزدوج مضروبا منذ 2 لم يتم الكشف عن نصف الخلايا تنصهر (عندما خلايا فتيل نفس اللون). </li></ol> ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 ثلاثة صورة مجهرية قناة B16F1 الخلايا بعد الكهربائي : المرحلة المقابل ، CMRA مضان (الإثارة في 548 نانومتر) وCMFDA مضان (الإثارة في 492 نانومتر) ، التكبير الهدف 20X

<ol>
	<li>&#268;emazar, M., Jarm, T., Miklav&#269;i&#269;, D., Ma&#269;ek-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Ser&#353;a, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro.">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li><li>Trontelj, K., Reber&#353;ek, M., Kandu&#353;er, M., &#269;urin &#353;erbec, V., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells.">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li><li>Rols, M. -. P., Teissi&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure.">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li><li>Neil, G., Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrofusion.">Electrofusion.</a> Methods in Enzymology. 220, 174-196 .</li><li>Abidor, I. G., Li, L. -. H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+cell+pellets:+II.+Osmotic+properties,+electroporation,+and+related+phenomena:+Membrane+interactions.">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li><li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion.">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li><li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissi&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters.">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li><li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip.">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li><li>U&#353;aj, M., Trontelj, M., Kandu&#353;er, M., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization.">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li><li>Teissi&#233;, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes.">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدرة على المزج بين أغشية الخلايا غير محدد ، على سبيل المثال ، من خلال الحقول الكهربائية الخارجية ، والمهم في الطب ، والتكنولوجيا الحيوية والبحوث في علم الأحياء. الانصهار غير محدد من هذا القبيل تتيح انتاج الخلايا الهجينة ذات قيمة عالية ومنتجاتها ، مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، ويوفر معلومات حول الآليات الأساسية [2] الانصهار. الكهربائي هو طريقة فعالة للغاية نظرا لاحتمال أنه يمكن تعديلها بشكل صحيح إلى أنواع مختلفة من الخلايا. ويتحقق الكهربائي عندما يتم إحضارها الخلايا في اتصال جسدي وثيق في دولتهم fusogenic (عرضة للانصهار) عن طريق الضغط العالي نبضات كهربائية. كفاءة الكهربائي يعتمد على مختلف المعايير التي تؤثر على جزأين من عملية الكهربائي. الجزء الأول من عملية الكهربائي هو تحقيق الاتصال الجسدي الوثيق بين الخلايا ، ويمكن الحصول عليها بطرق مختلفة [3-8]. ويمكن استخدام أسلوب الالتزام (الخلايا المتنامية لالتقاء) نظرا لكفاءة الاتصالات الخلية أنشئت عفويا في مناطق واسعة بين الخلايا ، إلا أنها تنتج خلايا كبيرة جدا تنصهر مع العديد من النوى. نحن نستخدم طريقة التقيد تعديل ، حيث يتم الحصول على الخلايا الصغيرة (مع النوى 2-5) ، والتي هي أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة وتتكاثر ، (الشكل 1). الاتصال بين الخلايا تستفيد أيضا من تورم التناضحي من الخلايا ، وذلك بسبب المعاملة التناضحي التي استخدمت في التجربة [9]. الجزء الثاني من عملية الكهربائي هو تحقيق الدولة fusogenic للأغشية الخلية. الدولة Fusogenic يرتبط بشكل جيد مع دولة electropermeabilized الغشاء (خلايا غير قابلة للتحديدا permeabilized إلى الجزيئات التي عادة لا يمكن ان تمر من خلال الغشاء سليمة) ، وتحكمها نفس المعلمات من نبضات كهربائية (السعة ، وطولها ، وعدد وتردد) [10] . قيم المعلمات الكهربائية اللازمة لelectroporation الأمثل [1] ، وتختلف الكهربائي بين الخلايا المختلفة ، وتعتمد على حجم الخلايا وخصائصها البيولوجية. معلمات الكهربائية وبالتالي الحاجة إلى أن يكون الأمثل لخطوط مختلفة من الخلايا ، والتي تستخدم كشركاء الانصهار ، للحصول على الانصهار.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CMRA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34551</td>
<td>Cytosolic fluorescent dye</td>
</tr>
<tr>
<td>CMFDA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C7025</td>
<td>Cytosolic fluorescent dye</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>D5671</td>
<td>Dulbecco's modified Eagle's medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal calf serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>crystacillin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pliva</td>
<td>625110</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G1397</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H0887</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Merck </td>
<td>A124873 927</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>4248</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M-8266</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>71382</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Merck</td>
<td>A154336 908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M2643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C4901</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>sucrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>16104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electric pulse generator</td>
<td>Tool</td>
<td>Igea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cliniporator VITAE</td>
</tr>
<tr>
<td>Multiwell plate</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>92424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tube</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>91050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tube</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 cm2 culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>90026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pt/Ir</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cell electrofusion visualized with fluorescence microscopy

الكهربائي الخلية هو طريقة آمنة وغير الفيروسية وغير الكيميائية التي يمكن استخدامها لتحضير الخلايا الهجينة لعلاج البشر. الكهربائي ينطوي على تطبيق نبضات قصيرة عالية الجهد الكهربائي للخلايا التي هي على اتصال وثيق. تطبيق قصيرة ، والبقول الكهربائية ذات الجهد العالي يسبب زعزعة الاستقرار في أغشية الخلايا البلازمية. الأغشية زعزعة الاستقرار أكثر نفاذا لجزيئات مختلفة ، وعرضة أيضا للاندماج مع أي الأغشية المجاورة زعزعة الاستقرار. الكهربائي وبالتالي وسيلة مريحة لتحقيق الانصهار غير محددة من خلايا مختلفة جدا<em&gt; في المختبر</em&gt;. من أجل الحصول على أغشية الخلية الانصهار ، تزعزع الحقل الكهربائي ، يجب أن تكون في اتصال وثيق للسماح بدمج طبقات ثنائية الدهون ، وبالتالي السيتوبلازم بهم. في هذا الفيديو ، ونظهر الكهربائي كفاءة الخلايا<em&gt; في المختبر</em&gt; عن طريق تعديل طريقة الانضمام. في هذا الأسلوب ، ويسمح للخلايا لنعلق قليلا فقط على سطح البئر ، بحيث يمكن أن يتم تبادل والمتوسطة والحفاظ على الخلايا لا يزال شكلها الكروي. ويتم تقييم التصور الانصهار بواسطة وضع العلامات السابقة للسيتوبلازم الخلايا مع مختلف الأصباغ الفلورية تعقب الخلية ؛ وصفت من نصف الخلايا مع CMRA البرتقال والنصف الآخر مع CMFDA الخضراء. يتم تحديد العائد الانصهار حيث بلغ عدد خلايا تنقسم الفلورسنت مزدوج مع عدد من الخلايا كل ضرب من قبل اثنين.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

في هذا الفيديو نظهر الكهربائي كفاءة الخلايا<em&gt; في المختبر</em&gt; من خلال طريقة الانضمام تعديلها باستخدام electroporation والكشف اللاحق للخلايا التصور تنصهر مع المجهري مضان.

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  University of Ljubljana. في هذا الفيديو نظهر الكهربائي كفاءة الخلايا في المختبر من خلال طريقة الانضمام تعديلها باستخدام electroporation والكشف اللاحق للخلايا التصور تنصهر مع المجهري مضان.

Video: Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

متصور النسخة الدوبامين في محطات قبل المشبكي فردية مع FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...