نود أن نشكر براندون هاسيت وكارلوس اورتيز لمساعدتها التقنية. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منح المعهد المصرفي، 0544428، 0951272، IOS، ودائرة الرقابة الداخلية 0925561 إلى Kolomiets الدكتور مايكل، والمعهد الوطني وزارة الزراعة الأميركية للأغذية والزراعة (NIFA)، م ع تربية النبات ومنحة التعليم # 2010-85117 -20539 إلى الدكاترة. سيث موراي، Isakeit توماس، وKolomiets مايكل.

1. نواة الذرة الأحيائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أسبوعين، والثقافة ومسببات الأمراض الفطرية على أجار البطاطس سكر العنب (PDA) في 28 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد حبات مع حجم وشكل مماثل، يفضل أن يكون بالارض حتى وضع مستوى مع الجزء السفلي من قنينة الأحيائي، والمكان في 50 مل من أنابيب صقر. يجب ان يكون قد تم تحديد إنتاج الحبوب في وقت واحد في نفس البيئة لضمان سن مماثل البذور وتكوين الأيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السطح تعقيم الحبوب عن طريق هز أنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع الايثانول 70٪، 1 دقيقة مع الماء المعقم، و 10 دقائق مع هيبوكلوريت الصوديوم 6٪. شطف، ثلاث مرات، لمدة 5 دقائق في كل مرة، مع الماء المعقم في حين يهز استمرار. حبات اتركها حتى تجف على مناشف ومشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسهيل عدوى من النكهات الرشاشيات، إنشاء جرح صغير على جانبي الجنين بإبرة G 18 إلى عمق 0.5 سم. ومع ذلك، في تجربتنا وهناك حاجة أكبر للعدوى الجرح verticillioides فيوزاريوم. الerefore، واستخدام شفرة حلاقة لقطع في جانب جنين على عمق 0.5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق اللقاح عن طريق كشط لوحات مثقف في حوالي 5 مل من محلول مشبع توين-20 0.01٪ لتحرير الجراثيم وإزالة المشيجة عن طريق الجاذبية من خلال تصفية ما لا يقل عن 4 طبقات من القماش القطني مشبع. حساب تركيز بوغ مع عدادة الكريات والتكيف مع جراثيم 6 10 / مل لأ. النكهات أو F. verticillioides. إذا كان استخدام الأنواع الأخرى من العوامل المسببة للأمراض أو المضيف، فمن المهم لتقييم تركيز اللقاح للعدوى المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء غرفة الرطوبة في وعاء من البلاستيك (29.2 سم X 18.7 سم X 8.3 سم) واصطف مع خمسة ورقة من المناشف الورقية و 100 مل من الماء المعقم. وينبغي أن الغرفة لا يمكن إضافة ماء أو الهواء وضيق والماء طوال تجربة إضافية للحفاظ على مناشف ورقية رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 حبات مكان الى مشبع قارورة 20 مل التلألؤ والزجاج، وتسجيل كتلة كل منها. تطعيم مع 200 تعليق بوغ ميكرولتر،وكأب، ودوامة لحبات معطف بالتساوي مع تعليق. ترخي مباراة دولية للسماح بحرية تبادل الهواء والمكان إلى غرفة الرطوبة. </li></ol> ملاحظة: للحصول على البذور أو الفطريات أخرى غير تلك المذكورة في هذه الأساليب، وكمية اللقاح المطلوبة قد تكون مختلفة، وينبغي أن تستمد تجريبيا. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات تحت الضوئية 12-h-light/12-h-dark عند 28 درجة مئوية لمدة 7 أيام أو حتى المطلوب. </li></ol> 2. غبيرات التعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة العدوى، وإضافة 5 مل من مشبع 0.01٪ توين-20 إلى قارورة تحتوي على حبات التلألؤ المصابة ودوامة تماما لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام طرف ماصة واسعة الجوف، تمييع فورا عن طريق تحويل منفصلين 200 aliquots ميكرولتر من تعليق بوغ في أنابيب 2.0 مل تحتوي على إيبندورف 1.8 مل من 0.01٪ توين-20 (أو تمييع حسب الحاجة تبعا لعدوى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعداد كل قسامة 200 ميكروليتر مرتين مع عدادة الكريات 4ومقارنة مستويات غبيرات بين المعالجات. </li></ol> 3. الأفلاتوكسين الكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حبات من 1 إلى 50 عينة كأس خلاط مل مع 20 مل من الميثانول من 80٪ و 0.05 جم كلوريد الصوديوم، والغطاء، ومزيج بسرعة عالية لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة مرشح مخدد أكثر من وعاء جمع نظيفة وتصب في استخراج مرشح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 مل من الراشح إلى وعاء نظيف، إضافة 20 مل المقطر H 2 O، وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح عينة من خلال مرشح ميكرون 1.5 مجهرية زجاج في كوب نظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبق 1 مل من المستخلص المرشح لاختبار منظمة المعونة القانونية وعمود، وذلك باستخدام الهواء المضغوط، وإجبار استخراج تصفيتها من خلال العمود بمعدل 1-2 قطرات / 2 حتى تفرغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود مرتين مع 1 مل من O 2 H المقطر وتمر عبر العمود في 1-2 قطرة / الثانية، حتى الهواء يأتي من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل عمود مع 1ml من 100٪ HPLC الميثانول في الصف 1-2 قطرة / من الدرجة الثانية التي تم جمعها في كوفيت الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة1 مل من المطور اختبار منظمة المعونة القانونية إلى شطافة وتخلط جيدا. كفيت مكان إلى معايرة مقياس التألق وقرأت في 60 ثانية. </li></ol> ملاحظة: عند استخدام بروتوكول Aflatest FGIS، يتم حساب قياس من مقياس التألق يستند الى 50 غراما الأولي للعينة المستخرجة في 100 مل. إذا كنت تنظر في التخفيف من العينة مع الماء، وتطبيق 1 مل إلى عمود يمثل 0.166 غرام من العينة. لذلك، عند تعديل البروتوكول، تحتاج إلى أن تأخذ في الاعتبار الاختلافات في حجم العينة، والحل استخراج الأولي. على سبيل المثال، يتم استخراج 2 غرام من الحبوب في الميثانول مل 20 80٪. هذا هو 0.1 غرام / مل. عندما يخلط 1 مل من هذه العينة مع مل من الماء 2، نسبة العينة في السائل هو الآن 0.033 غرام / مليلتر. إذا كان هذا النموذج يعطي قراءة مقياس التألق من 100 جزء من البليون، ويستند تركيز الفعلي على نسبة من العينة إلى 0،166، وهذا هو، جزء من البليون = (0.166 غرام X 100 جزء من البليون) / جرام 0.1)، أو جزء من البليون 166. لquantifi الأفلاتوكسين البديلالأساليب الموجبة، أنظر المرجع 7. 4. Fumonisin B1 (FB1) تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يزرع فطر على حبات الذرة، واستخراج عينات بين عشية وضحاها مع 10 مل من الأسيتونيتريل / المياه (50/50، V / V) في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. بعد ذلك، مزيج من خلاصة (2 مل) مع ماء منزوع الأيونات (6 مل)، وتطبيق هذا المزيج (8 مل) مباشرة إلى مرحلة الاستخراج C-18 الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحميل عينة، شرط مسبق استخراج مرحلة C-18 صلب عمود بواسطة الشطف مع 2 مل من الأسيتونيتريل تليها 2 مل من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحميل العينة، يتم غسلها العمود مع 2 مل من الماء تليها 2 مل من الأسيتونيتريل / المياه (15/85، V / V). ومزال عينة للتحليل HPLC (التي تحتوي على FB1) مع 2 مل من الأسيتونيتريل / المياه (70/30، V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Derivatize FB1 مع O-phthaldehyde (OPA) عن طريق تحويل 0.1 مل من شطافة عمود إلى قارورة تحتوي على 0،1 العازلة بورات مل (0.05 متر بوريك الصوديوم M acid/0.05 بورات [50/50، V / V]، ودرجة الحموضة 8.5) و 0.1 مل OPA (0.1 ملغ / مل في acetonitrile مع 0.5٪ - المركابتويثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد فعل بعد 10 دقيقة عن طريق إضافة 0.5 مل من حمض البوريك acetonitrile/0.01 M (40/60، V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FB1 على نظام شيمادزو LC-20AT HPLC مجهزة عمود التحليلية المواد المستنفدة للأوزون Zorbax (4.6 150 مم) وطول موجي متغير Shimatzu RF-10Axl كاشف مضان (إثارة 335 نيوتن متر / انبعاث 440 نيوتن متر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم استخدام الانحدار الخطي (مذيب ج: acetonitrile/0.1 فوسفات الصوديوم M (40/60)، ودرجة الحموضة 3.3؛ ب المذيب: الأسيتونيتريل / 0،1 فوسفات الصوديوم M (60/40)، ودرجة الحموضة 3.3) وبرنامج التدرج هو كما يلي: 100٪ A. إلى ب 100٪ في 10 B، دقيقة 100٪ لمدة 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل FB1 المعايير HPLC، وتستخدم القياسات منطقة ذروة لتوليد منحنى القياسية. بعد ذلك، تحديد مستوى FB1 في عينة من خلال مقارنة مع مناطق ذروة FB1 منحنى القياسية. </li></ol> 5. إرغوستيرول التحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الفطر على حبات الذرة لمدة 7-14 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة، إضافة 10 مل من الكلوروفورم: ميثأنول (2:1، V / V) في كل قارورة. وأضاف مرة واحدة، هز العينات جيدا واحتضان ثم قوارير في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، منبذة العينات، وجمع طاف وتصفيتها من خلال 0،45 غشاء نايلون أم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن العينة مباشرة إلى نظام شيمادزو LC-20AT HPLC مجهزة عمود 4،6 المواد المستنفدة للأوزون C18 يو (200، 250 ± 4.6 ملم)، والحزب الديمقراطي الاشتراكي شيمادزو-20A UV / VIS للكشف عن مجموعة لمراقبة بمبلغ 282 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الميثانول (100٪) في معدل تدفق 1.5 مل / دقيقة كما في الطور المتحرك. تحديد الكمي للإرغوستيرول في عينات من خلال مقارنة عينات من مناطق الذروة إلى منحنى معيار المتولدة من HPLC الصف إرغوستيرول. </li></ol> 6. ممثل النتائج بعد التلقيح والحضانة في غرفة الرطوبة لمدة يومين أو ثلاثة أيام، وينبغي أن نمو الفطريات تبدأ في الظهور على الألباب. وينبغي أن سبعة ايام بعد العلاج، والنمو الخضري على النباتات المعالجة تكون واضحة للعيان، whilيجب أن تكون الضوابط ه وهمية غير مصاب (الشكل 1B، أعلى). فترات أطول حضانة تفضي إلى النمو الخضري أكثر غزير (الشكل 1B، أسفل). وفقا للشروط الواردة في هذا التقرير، الشكل (2G)، أ. النكهات من النوع البري اتفية 3357 الحد الأقصى للقيم المعروضة من الاستعمار، وتراكم الأفلاتوكسين، والإنتاج غبيرات في 8 و 6 و 8 أيام، على التوالي (الشكل 2، AC). ومع ذلك، عندما تمت مقارنة تلوث بالسموم الفطرية و conidiation لكل وحدة من إرغوستيرول، لاحظ أعلى مستويات في 4 و 6 أيام، على التوالي (الشكل 2، DE). الشكل 2F يلخص هذه الفطرية الكتلة الحيوية التي تعتمد على أقصى قدر من الملاحظات القيمة. ومن المثير للاهتمام، ما بين 4-6 أيام بعد التلقيح، وحبات تمر النووي تدهور حامض، كما رأينا من قبل الجيش الملكي النيبالي مجموع من عينات على المسار في الوقت (الشكل 2H، أسفل). العديد من الدراسات، بما في ذلك منطقتنا، لديها examinإد F. verticilliodies عدوى في حبات الذرة 2،8،9،10،11،12 واستخدمت بنجاح 7-13 أيام من الوقت نقاط عن الملاحظات. باستخدام الأساليب المذكورة في هذه الوثيقة، fumonisin مستويات تتراوح ما بين 3،500-8،000 نانوغرام / غرام من نواة 4،13 ومستويات إرغوستيرول مجموعة من 5،000-10،000 نانوغرام / غرام من نواة 14،13. ويبين الشكل 3 قمم ممثل عن fumonisin (أعلى) وإرغوستيرول (القاع ) من HPLC المخططات الاستشرابية. ويمكن أيضا قياس إرغوستيرول تنفذ عبر الأطياف الامتصاصية 15. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> الشكل 1. الرسم البياني لتقدير حجم الكتلة الحيوية الفطرية، تولد الأبواغ، وإنتاج السموم والنتائج ممثل عن النمو الخضري من اختبارات بيولوجية على نواة. أ) الرسم البياني تحدد طريقة وصفها لتقدير حجم العوامل البيولوجية الأساسية المستخدمة لتقييم المرضية الفطرية على حبات الذرة. ب) الممثلنتائج اختبارات بيولوجية على نواة. أعلى، أ. النكهات (NRRL3357) النمو الخضري على حبات الذرة في الخلفية B73 الوراثية. تم تلقيح البذور مع 200 ميكرولتر من 10 مل / 6 جراثيم والصور أخذت 7 تلقيح آخر أيام. أسفل، F. verticillioides تلقيح الألباب في B73 خلفية إصابة 13 يوما آخر. تم تلقيح الحبوب مع 200 ميكرولتر من الجراثيم 6 10 / مل. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> الشكل 2. نواة النكهات الرشاشيات الأحيائي وقتا بالطبع. تم تلقيح B73 حبات مع 200 ميكرولتر من الجراثيم 6 10 / مل تعليق النكهات الرشاشيات غبيري والمحتضنة ل2-8 أيام (G). تم تحديد جميع القيم من متوسط ​​الوزن الجاف من 4 حبات (ن = 3-4؛ متوسط ​​± SE). A) وتم قياس كمية الاستعمار (على أساس إرغوستيرول) والأفلاتوكسين (B)، و conidiation (ج) استخدام الأساليب المذكورة أعلاه. E) يتم عرض الافلاتوكسين و conidiation (F)بوصفها وظيفة من الكتلة الحيوية الفطرية التي تقاس من خلال إرغوستيرول ح. F) القيم القصوى لإرغوستيرول، تراكم الأفلاتوكسين، و conidiation بوصفها وظيفة من الكتلة الحيوية الفطرية - لاحظ القيم أقصى لكل كمية تم تعيين إلى 100٪. (H) 1 ميكروغرام لكل حارة من الحمض النووي الريبي من مجموع بالطبع الوقت. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> الشكل 3. الممثل السائل عالية الأداء اللوني (HPLC) المخططات الاستشرابية عن B1 fumonisin (أعلى) وإرغوستيرول (القاع) معزولة عن حبات المصابين verticillioides فيوزاريوم (M3125).

<ol>
	<li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals.">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li><li>Gao, X., Shim, W. -. B., G&#246;bel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin.">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li><li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem.">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li><li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., G&#246;bel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp.">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li><li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi.">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li><li>Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels.">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li><li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins.">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li><li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia.">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li><li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids.">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li><li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusarium+verticillioides+GAP!,+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein,+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence.">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li><li>Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides.">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li><li>Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+(C-type)+gene,+FCC1.">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li><li>Christensen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li><li>Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PPR1+and+PPR2,+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides.">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119 (2009).</li><li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast.">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; ليس لدي ما يكشف.</p

<p class="jove_content"&gt; لقد تم اختبار الطرق الموضحة هنا على نطاق واسع وثبت أن تكون قوية في توليد نتائج قابلة للقياس الكمي للاستعمار الفطرية، تولد الأبواغ، وإنتاج السموم الفطرية. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق هذه الأساليب على البذور من الأنواع النباتية الأخرى التي هي عرضة للتلوث مع الفطريات mycotoxig...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج # </td></tr><tr><td> البطاطس سكر العنب آجار </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> توين-20 </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> البلاستيك حضانة حاوية </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> خلاط </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 سم مزمر تصفية ورقات </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1.5 ميكرون مجهرية زجاج </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> منظمة المعونة القانونية اختبار عمود </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla اختبار المطور </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> الأسيتونيتريل </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> فيشر Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 استخلاص الطور الصلب العمود (الإعدادية عمود SPE سبتمبر C18) </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-phthalaldehyde (OPA) </td><td> سيغما كميكال </td><td> 79760-5G </td></tr><tr><td> حمض البوريك </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> بورات الصوديوم </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> المركابتويثانول </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> شيمادزو HPLC LC-20AT (مضخة) </td><td> شيمادزو أجهزة علمية، وشركة </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax المواد المستنفدة للأوزون العمود (4.6x150mm) </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl كاشف مضان </td><td> شيمادزو أجهزة علمية، وشركة </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم </td><td> فيشر العلمية دورة </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 المعايير </td><td> سيغما شركة الكيميائية </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> الكلوروفورم </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 13 مرشح حقنة ملم مع 0.45 غشاء نايلون أم (HPLC) </td><td> بظلالها علوم الحياة </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> إرغوستيرول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> التلألؤ قوارير </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantification of fungal colonization, sporogenesis, and production of mycotoxins using kernel bioassays

وتعفن الحبوب بواسطة البذور تصيب الفطريات يشكل واحدا من أكبر التحديات الاقتصادية في جميع أنحاء العالم لإنتاج الحبوب، ناهيك عن مخاطر جسيمة على صحة الإنسان والحيوان. بين إنتاج الحبوب، الذرة يمكن القول إن أكثر المحاصيل تضررا، وذلك بسبب العوامل المسببة للأمراض التي يسببها خسائر في سلامة الحبوب والبذور تلوث بالسموم الفطرية. والسموم الفطرية وهما الأكثر انتشارا ومشكلة لمزارعي الذرة والأغذية والأعلاف والمعالجات الأفلاتوكسين و fumonisin، التي تنتجها النكهات الرشاشيات وverticillioides فيوزاريوم، على التوالي. وقد أثبتت الدراسات التي أجريت مؤخرا في التفاعلات الجزيئية النباتية الممرض وعد في فهم آليات محددة مرتبطة ردود مصنع للعدوى الفطرية وتلوث بالسموم الفطرية 1،2،3،4،5،6. لأن العديد من المعامل تستخدم المقايسات نواة لدراسة النباتات والممرض التفاعلات، وهناك حاجة لطريقة موحدة لقياس العوامل البيولوجية المختلفة، لذلكويمكن النتائج من المختبرات المختلفة العابرة للتفسير. عن وسيلة قوية وقابلة للتكرار لتحاليل الكمية على البذور، وضعنا نواة المقايسات في المختبر، وطرق لاحق لتحديد نمو الفطريات، والكتلة الحيوية، وتلوث بالسموم الفطرية. يتم تلقيح أربع حبات الذرة معقمة في قوارير الزجاج مع تعليق الفطرية (10 6)، وحضنت لمدة محددة سلفا. ثم يتم اختيار عينة قوارير للتعداد من غبيرات بواسطة تحليل الكتلة الحيوية عدادة الكريات، إرغوستيرول المستندة إلى الأداء العالي اللوني السائل (HPLC)، تقدير الأفلاتوكسين باستخدام أسلوب AflaTest مقياس التألق، وتقدير fumonisin بواسطة HPLC.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays at JoVE.com

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

ودفع الدمار الذي محاصيل الحبوب من قبل الفطريات بذرة اصابة العديد من الجهود البحثية من أجل فهم أفضل النباتات الممرض التفاعلات. لدراسة بذور للفطريات التفاعلات في إعداد مختبر، طورنا طريقة قوية لالكمي للاستنساخ الفطرية، والكتلة الحيوية، وتلوث بالسموم الفطرية باستخدام اختبارات بيولوجية على نواة.

الكمي للاستعمار الفطرية، تولد الأبواغ، وإنتاج السموم الفطرية عن طريق اختبارات بيولوجية على النواة

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Views.  Texas A&M University. ودفع الدمار الذي محاصيل الحبوب من قبل الفطريات بذرة اصابة العديد من الجهود البحثية من أجل فهم أفضل النباتات الممرض التفاعلات. لدراسة بذور للفطريات التفاعلات في إعداد مختبر، طورنا طريقة قوية لالكمي للاستنساخ الفطرية، والكتلة الحيوية، وتلوث بالسموم الفطرية باس...

Video: Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

استعمار Euprymna scolopes الحبار بواسطة الضمة fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

القياس الكمي نسيجية لتحديد عبء الرئة الفطرية في أسبيرجيلوسيس التجريبية

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

التصوير في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للتنمية بيوفيلم الفطرية باستخدام نظام تدفق دائرية ذات مرحلتين

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...