אנו רוצים להודות ברנדון הסאט וקרלוס אורטיז לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NSF IOB-0544428, IOS-0951272, ו IOS-0925561 ד&quot;ר מיכאל Kolomiets, ועל ידי משרד החקלאות המכון הלאומי המזון והחקלאות (NIFA), גידול הצמח AFRI וחינוך גרנט # 2010-85117 ל -20,539 בני הזוג. סת מוריי, תומאס Isakeit, ו Kolomiets מייקל.

1. ליבה תירס המבדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועיים לפני, תרבות של פתוגנים פטרייתיים על אגר תפוחי אדמה דקסטרוז (PDA) ב 28 מעלות ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גרעינים עם גודל צורה דומה, רצוי שטוח כך הם שכבו עם רמת התחתון של צלוחיות המבדק, ומכניסים 50 מ&quot;ל צינורות פלקון. גרעינים שנבחרו חייבים הופקו במקביל בסביבה אותו כדי להבטיח גיל הזרע דומה והרכב המטבוליט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פני השטח לעקר גרעיני על ידי ניעור צינורות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עם אתנול 70%, 1 דקה עם מים סטריליים, ו -10 דקות עם hypochlorite נתרן 6%. יש לשטוף, שלוש פעמים, במשך 5 דקות בכל פעם, עם מים סטריליים תוך רעד מתמשך. פאט גרעינים יבשים על מגבות autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על דלקת של אספרגילוס flavus, ליצור פצע קטן בצד, העובר עם מחט 18 G עד לעומק של 0.5 ס&quot;מ. עם זאת, מניסיוננו פצע גדול דרוש זיהום verticillioides Fusarium. הerefore, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך בצד העובר בעומק של 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההשעיה הבידוד על ידי גירוד צלחות בתרבית על 5 מ&quot;ל של תמיסת autoclaved tween-20 0.01% לשחרר נבגים ולהסיר תפטיר על ידי כוח המשיכה סינון דרך לפחות 4 שכבות של אריג autoclaved. חישוב ריכוז נבג עם hemocytometer ולהתאים את 10 6 נבגים למ&quot;ל של א &#39; flavus או פ verticillioides. אם אתה משתמש מינים אחרים של הפתוגן או המארח, חשוב להעריך ריכוזים של הבידוד לזיהום המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תא לחות במיכל פלסטיק (29.2 ס&quot;מ X 18.7 ס&quot;מ X 8.3 ס&quot;מ) ובו חמישה גיליונות של נייר סופג או 100 מ&quot;ל של מים סטריליים. לשכת הוא לא מים או אוויר חזק מים נוספים יש להוסיף במהלך הניסוי לשמור על מגבות נייר לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ארבעה גרעינים לתוך בקבוקון autoclaved 20 מ&quot;ל נצנץ זכוכית להקליט המסה שלהם. לחסן עם ההשעיה 200 μl נבג,כובע, ואת המערבולת באופן שווה גרעיני מעיל עם ההשעיה. שחרר כמוסות באופן חופשי ולאפשר חילופי האוויר במקום לחדר לחות. </li></ol> הערה: זרעים או פטריות אחרות מאלו המתוארות במסגרת שיטות אלו, כמות הבידוד הנדרש עשויים להיות שונים ויש נגזרת באופן ניסיוני. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה גרעיני תחת photoperiod 12-h-light/12-h-dark על 28 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים או עד הרצויה. </li></ol> 2. נבגי ספירת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופה זיהום, מוסיפים 5 מ&quot;ל של autoclaved 0.01% Tween-20 כדי בקבוקונים המכילים גרעינים נצנץ נגוע מערבולת היטב במשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש קצה פיפטה רחב משעמם, מיד לדלל על ידי העברת שני נפרדים aliquots 200 μl של השעיה נבג לתוך צינורות 2.0 מ&quot;ל Eppendorf המכילים 1.8 מ&quot;ל של 0.01% tween-20 (או לדלל לפי הצורך בהתאם זיהום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנות כל aliquot 200 μl פעמיים עם hemocytometer 4ולהשוות את הרמות של נבגי בין הטיפולים. </li></ol> 3. אפלטוקסין כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף גרעיני מדגם 1-50 מ&quot;ל בבלנדר כוס עם 20 מ&quot;ל של מתנול 80% ו - 0.05 גרם NaCl, מכסים בתערובת במהירות גבוהה במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר פילטר מחורץ על כלי אוסף נקי לשפוך תמצית לתוך מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר 10 מ&quot;ל של תסנין לכלי נקי, מוסיפים 20 מ&quot;ל מזוקקים H 2 O, ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם סינון דרך פילטר זכוכית microfibre 1.5 מיקרומטר לתוך כוס נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1 מ&quot;ל של מיצוי מסונן לעמודה מבחן Afla, באמצעות אוויר דחוס, לאלץ את תמצית מסוננת דרך העמודה בקצב של 1-2 טיפות / שנייה עד שרוקנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור פעמיים עם 1 מ&quot;ל של H 2 O מזוקקים ולעבור טור ב 1-2 ירידה / 2 עד שהאוויר מגיע דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור Elute עם מתנול 1ml של 100% HPLC כיתה ב 1-2 ירידה / שיעור 2 אסף לתוך קובט זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף1 מ&quot;ל של מפתחים מבחן Afla כדי eluate ומערבבים היטב. מקום קובט אל fluorometer מכויל ולקרוא על 60 שניות. </li></ol> הערה: בעת שימוש בפרוטוקול Aflatest FGIS, מדידה מ fluorometer מחושב על בסיס של 50 גרם הראשונים של המדגם שחולצו ל -100 מ&quot;ל. אם לוקחים בחשבון דילול של המדגם עם מים, 1 מ&quot;ל להחיל עמודה מייצגת 0.166 גרם של המדגם. לכן, כאשר שינוי פרוטוקול, אתה צריך לקחת בחשבון את הבדלי גודל המדגם והפתרון החילוץ הראשוני. כך, למשל, 2 גרם של גרעינים מופקים ב 20 מ&quot;ל מתנול 80%. זה 0.1 גרם / מ&quot;ל. כאשר 1 מ&quot;ל של דגימה זו הוא מעורבב עם 2 מ&quot;ל מים, שיעור מדגם בנוזל עכשיו 0.033 גרם / מ&quot;ל. אם מדגם זה נותן קריאה fluorometer של ppb 100, ריכוז בפועל מבוסס על שיעור של מדגם 0.166, כלומר, ppb = (0.166 X 100 גרם ppb) / 0.1 גרם), או 166 ppb. עבור אפלטוקסין quantifi אלטרנטיביתשיטות קטיון, ראה התייחסות 7. 4. Fumonisin B1 (FB1) ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הפטרייה הוא גדל על גרעיני תירס, לחלץ דגימות לילה עם 10 מ&quot;ל של אצטוניטריל / מים (50/50, נ / V) בטמפרטורת החדר, ללא התרגשות. לאחר מכן, לערבב את תמצית (2 מ&quot;ל) עם מים deionized (6 מ&quot;ל), ולהחיל את תמהיל (8 מ&quot;ל) ישירות מיצוי שלב C-18 מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת המדגם, תנאי החילוץ C-18 מוצקים בשלב בטור על ידי שטיפה עם 2 מ&quot;ל של אצטוניטריל ואחריו 2 מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינת לדוגמה, העמודה נשטף עם 2 מ&quot;ל מים ואחריו 2 מ&quot;ל של אצטוניטריל / מים (15/85 V / V). לדוגמה עבור HPLC ניתוח (המכיל FB1) הוא eluted עם 2 מ&quot;ל של אצטוניטריל / מים (70/30 V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Derivatize FB1 עם O-phthaldehyde (OPA) על ידי העברת 0.1 מ&quot;ל של eluate עמודה בקבוקון המכיל 0.1 מ&quot;ל borate חיץ (0.05 מ &#39;בור acid/0.05 M נתרן borate [50/50, נ / v], pH 8.5) ו - 0.1 OPA מ&quot;ל (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב acetonitrile עם 0.5% - mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה לאחר 10 דקות על ידי הוספת 0.5 מ&quot;ל של acetonitrile/0.01 M בור חומצה (40/60, נ / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח FB1 על מערכת HPLC LC-20AT Shimadzu מצויד טור Zorbax ODS אנליטית (4.6 150 מ&quot;מ) אורך גל משתנה Shimatzu RF-10Axl גלאי הקרינה (עירור 335 ננומטר / פליטה 440 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיפוע ליניארית משמש (ממס: acetonitrile/0.1 M פוספט נתרן (40/60), pH 3.3, ב ממס: אצטוניטריל / M 0.1 פוספט נתרן (60/40), pH 3.3) ואת תוכנית שיפוע הוא כדלקמן: 100% ל-B של 100% ב 10 דקות, 100% עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח FB1 סטנדרטים ידי HPLC, מדידות שטח שיא משמשים ליצירת עקומת סטנדרטי. לאחר מכן, לכמת FB1 רמת במדגם על ידי השוואת שטחים שיא עם עקומת FB1 סטנדרטי. </li></ol> 5. Ergosterol ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות פטרייה על גרעיני תירס על 7-14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, להוסיף 10 מ&quot;ל של כלורופורם: ספידanol (02:01, V / V) בבקבוקון אחד. לאחר ההוספה, לנער היטב דגימות ואז דגירה צלוחיות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, צנטריפוגות מדגמים, ולאסוף supernatant ולסנן אותה דרך הממברנה 0.45 ניילון אום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק מדגם ישירות לתוך מערכת HPLC LC-20AT Shimadzu מצויד עמודה 4.6 ODS-C18 U (200 א, 250 ± 4.6 מ&quot;מ) Shimadzu SPD-20A UV / VIS גלאי להגדיר כדי לפקח על 282 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מתנול (100%) בקצב זרימה של 1.5 mL / min כשלב הנייד. לקבוע כימות ergosterol בדגימות על ידי השוואת שטחי שיא של דגימות כדי עקומת סטנדרט שנוצר HPLC כיתה ergosterol. </li></ol> 6. נציג תוצאות בעקבות חיסון ו הדגירה בתא לחות על שניים עד שלושה ימים, גידול פטרייתי צריך להתחיל להופיע על הגרעינים. שבעה ימים שלאחר הטיפול, גידול צמח על צמחים שטופלו צריך להיות בבירור, whilפקדי דואר מדומים צריך להיות נגוע (איור 1 ב, למעלה). תקופות של דגירה עוד הם תורמת לצמיחה צמח שופע יותר (איור 1 ב &#39;, למטה). בתנאים המתוארים לעיל (איור 2G), א &#39; flavus wild-type NRRL 3357 ערכים מרביים המוצגים של קולוניזציה, הצטברות אפלטוקסין, וייצור נבגים בבית 8, 6, ו 8 ימים, בהתאמה (איור 2, AC). עם זאת, כאשר זיהום mycotoxin ו conidiation הושוו ליחידת ergosterol, הרמות הגדולים ביותר נצפו ב 4 ו 6 ימים, בהתאמה (איור 2, DE). איור 2F מסכם אלה פטרייתיים ביומסה תלויי היותר בעלי ערך תצפיות. מעניין לציין, כי בין 4-6 ימים לאחר חיסון, הגרעינים עוברים השפלה חומצות גרעין, כפי שניתן לראות על ידי RNA הכולל דוגמאות על קורס בזמן (איור 2H, למטה). מספר מחקרים, כולל שלנו, יש examinאד פ verticilliodies על זיהום גרעיני תירס 2,8,9,10,11,12 ומשמש בהצלחה 7-13 ימים עם הזמן נקודות לתצפיות. שימוש בשיטות המתוארות להלן, fumonisin רמות נע בין 3,500-8,000 ng / g טווח הקרנל 4,13 ורמות ergosterol של 5,000-10,000 ng / g הקרנל 14,13. איור 3 מציג פסגות נציג עבור fumonisin (למעלה) ו ergosterol (התחתון ) מ-HPLC chromatograms. מדידת ergosterol יכול גם להיות דרך ספקטרום ספיגת 15. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים זרימה כימות של ביומסה sporogenesis פטרייתי, וייצור mycotoxin ותוצאות נציג לצמיחה צמח מ bioassays ליבה. א) תרשים זרימה מתאר את השיטה המתוארת על כימות של פרמטרים ביולוגיים בסיסיים להערכת הפתוגנזה פטרייתי על גרעיני תירס. ב) נציגהתוצאות עבור bioassays ליבה. למעלה, א flavus (NRRL3357) גידול צמח על גרעיני תירס ברקע הגנטי B73. הזרעים היו מחוסן עם 200 μl של 10 נבגים 6 / mL והתמונות נלקחו 7 ימים חיסון הודעה. בתחתית, פ verticillioides מחוסן הגרעינים ברקע B73 13 יום שלאחר זיהום. הגרעינים היו מחוסן עם 200 μl של 10 6 נבגים למ&quot;ל. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> 2. איור אספרגילוס הקרנל flavus המבדק זמן כמובן. B73 הגרעינים היו מחוסן עם μl 200 של 10 מ&quot;ל / 6 נבגים אספרגילוס ההשעיה flavus הנבגים ו מודגרת למשך 2-8 ימים (G). כל הערכים נקבעו לעומת ממוצע משקל יבש של 4 גרעיני (n = 3-4, ממוצע ± SE). א) ההתיישבות (על בסיס ergosterol), (ב) אפלטוקסין, ו (ג) conidiation היו לכמת בשיטות שתוארו לעיל. E) ו אפלטוקסין (F) conidiation מוצגיםכפונקציה של ביומסה פטרייתי, כפי שהיא נמדדת באמצעות ה ergosterol. F) ערכים מרביים עבור ergosterol, הצטברות אפלטוקסין, ו conidiation כפונקציה של ביומסה פטרייתי - ערכים מרביים עבור כל כמות ציין נקבע על 100%. (ג) 1 מיקרוגרם לכל נתיב של RNA הכולל כמובן בזמן. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> איור 3. הנציג העליון נוזלי ביצועים כרומטוגרפיה (HPLC) chromatograms עבור fumonisin B1 (למעלה) ו ergosterol (למטה) מבודד גרעינים נגועים verticillioides Fusarium (M3125).

<ol>
	<li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals.">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li><li>Gao, X., Shim, W. -. B., G&#246;bel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin.">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li><li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem.">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li><li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., G&#246;bel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp.">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li><li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi.">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li><li>Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels.">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li><li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins.">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li><li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia.">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li><li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids.">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li><li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusarium+verticillioides+GAP!,+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein,+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence.">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li><li>Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides.">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li><li>Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+(C-type)+gene,+FCC1.">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li><li>Christensen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li><li>Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PPR1+and+PPR2,+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides.">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119 (2009).</li><li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast.">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; אין לי מה לחשוף.</p

<p class="jove_content"&gt; השיטות שתוארו כאן נבדקו בהרחבה הוכיחה להיות חזקים בדור של תוצאות לכימות להתיישבות sporogenesis פטרייתי, וייצור של mycotoxins. יתר על כן, שיטות אלה צריכות לחול על זרעים של מיני צמחים אחרים, כי הם רגישים לזיהום עם פטריות mycotoxigenic (כגון בוטנים, חיטה, כותנה, פיסטוקים וכו &#39;). למפעל לפתוגן ניתוחים המוסמכות אינטראקציה, זוהי חובתו של הזרעים לשמר אותם. האתר פצע קטן בצד העובר של הקרנל מאפשר זיהום תוך שמירה על יכולת הקיום של זרע.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; מבחני ליבה הפועלות ביעילות הוכחו תוצאות מקבילות מהשדה. במחקר הקודם<sup&gt; 4</sup&gt;, Bioassays ליבה הראה כי<em&gt; Lox3-4 מוטציה</em&gt; קווי היו פגיעים יותר לזיהום אפלטוקסין מ wild-type צמחים. תוצאה זו ישירות בקנה אחד עם תוצאות ראו מארבעה ניסויי שדה עצמאיים<sup&gt; 4</sup&gt;. הדבר מצביע על כך bioassays ליבה עשוי להיות כלי יעיל לקביעת ו / או לנבא את התוצאה של הצמח לפתוגן אינטראקציות בקנה מידה גדול על הגדרות.</p

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td></tr><tr><td> דקסטרוז אגר תפוחי אדמה </td><td> פישר Scientifc </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> פישר Scientifc </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> הדגירה מיכל פלסטיק </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> ממחה </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 ס&quot;מ מחורץ מסנן ניירות </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1.5 מיקרומטר זכוכית microfibre </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla טור מבחן </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla מפתחים מבחן </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> פישר Scientifc </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> פישר Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 בשלב מוצק החילוץ עמודה (הכנה ספטמבר טור SPE C18) </td><td> פישר Scientifc </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-phthalaldehyde (OPA) </td><td> סיגמא כימית Co </td><td> 79760-5G </td></tr><tr><td> בור חומצה </td><td> פישר Scientifc </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> נתרן borate </td><td> פישר Scientifc </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoethanol </td><td> פישר Scientifc </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (משאבה) </td><td> Shimadzu מכשירים מדעיים, Inc </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS עמודה (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl גלאי הקרינה </td><td> Shimadzu מכשירים מדעיים, Inc </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> סודיום פוספט </td><td> פישר Scientifc </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 תקני </td><td> סיגמא כימית ושות&#39; </td><td> F1147-במינון של 1 </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> מזרק 13 מ&quot;מ מסנן עם קרום 0.45 ניילון אום (HPLC) </td><td> חיים מל המדע </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45480-F-50 גרם </td></tr><tr><td> נצנץ בקבוקונים </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> סודיום כלוריד </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantification of fungal colonization, sporogenesis, and production of mycotoxins using kernel bioassays

ריקבון של דגנים על ידי הזרע, מדביק פטריות מהווה אחד האתגרים הכלכליים הגדולים ביותר ברחבי העולם ייצור דגני בוקר, שלא לדבר על סיכון רציני לבריאות האדם ובעלי חיים. בין ייצור דגנים, תירס הוא לטעון את היבול הנגוע ביותר, עקב פתוגן המושרה הפסדים שלמות תבואה זרע זיהום mycotoxin. שני mycotoxins הנפוצים ביותר ובעייתי עבור מגדלי תירס ומוצרי מזון מעבדים מזון הם אפלטוקסין ו fumonisin, המיוצר על ידי Aspergillus flavus ו verticillioides Fusarium, בהתאמה. מחקרים שנעשו לאחרונה במפעל לפתוגן אינטראקציות מולקולריות הראו הבטחה בהבנת מנגנונים ספציפיים הקשורים תגובות צמחים לזיהום פטרייתי וזיהום mycotoxin 1,2,3,4,5,6. כי מעבדות רבות משתמשות מבחני ליבה ללמוד הצמח לפתוגן אינטראקציות, יש צורך בשיטה אחידה לכימות פרמטרים ביולוגיים שונים, כךתוצאות של מעבדות שונות ניתן לחצות, לפרש. עבור אמצעי חזקים לשעתקו עבור ניתוחים כמותיים על זרעים, פיתחנו ב-Lab מבחני ליבה ושיטות הבאים לכמת הצמיחה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin. ארבעה גרעיני תירס מעוקרים הם מחוסן ב צלוחיות זכוכית עם מתלה פטרייתי (10 6) מודגרת למשך פרק זמן מוגדר מראש. צלוחיות מדגם יבחרו מכן על ידי ניתוח ביומסה hemocytometer, ergosterol מבוסס על ספירה של נבגים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC), כימות אפלטוקסין באמצעות שיטה fluorometer AflaTest, וכימות fumonisin ידי HPLC.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays at JoVE.com

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Views.  Texas A&M University. ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.

Video: Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

קולוניזציה של Euprymna scolopes קלמארי על ידי Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...