وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الطاقة البحيرات العظمى مركز أبحاث الطاقة الحيوية (وزارة الطاقة BER مكتب العلوم DE-FC02-07ER64494). نحن ممتنون للدكتور تشانغ شو دونغ وأعضاء جماعته لإجراء مناقشات تقنية مفيدة والتعليقات لا تقدر بثمن في وضع الصيغة النهائية للبروتوكول.

1. تحضير العينة واستخلاص حمض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد عينات من التربة الجافة بعد الجمع الميداني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن والتجانس عينات من التربة باستخدام طاحونة الكرة، طاحونة التربة، أو بمدافع الهاون ومدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن عينات من التربة (التي تحتوي على&gt; 0.3 ملغم N) في دورق 25 مل من التحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من حمض الهيدروكلوريك 6M في كل قارورة المائي، وملء N 2 الغاز في القوارير، والغطاء بإحكام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتحلل عند درجة حرارة 105 مئوية في حاضنة لمدة 8 ساعات باستخدام مفتاح الموقت السيارات. </li></ol> 2. عينة تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قوارير من الحاضنة، بارد لدرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 100 ميكروليتر الداخلية معيار ميو، اينوزيتول (1 ملغ مل -1 في الماء) على كل قارورة، مزيج من دوامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مداخل البلاستيكية التي تصب في قوارير 200 مل على شكل كمثرى مع ST / NS 24/40 المفاصل، وتعيين على الأكواب البلاستيكية للاستقرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طية Whatman # 2 دوائر النوعية (11 قطرها سم) إلى أرباع، ومجموعة في المداخن. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> عباب كل قارورة المائي، ويسكب المزيج في قمع لتصفية (قد شطف مزيد من كل قارورة مع مل 3 ~ من الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الترشيح باستخدام التبخير الدوار في ~ 45 درجة مئوية، وتطبيق فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بقايا المجففة من كل قارورة الكمثرى مع 3 ~ 5 مل ماء (استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية وإذا رغبت في ذلك)، وتصب في أنبوب 40 مل تفلون؛ شطف القارورة مع قسامة الثانية من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة إلى 6،6-6،8 باستخدام 1M KOH حل لايونات المعادن راسب والجزيئات العضوية الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي في 2000 إطار التعاون الإقليمي لمدة 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف في أنبوب 40 مل زجاج، تغطية افتتاح أنبوب مع parafilm، وتجميد في -20 درجة مئوية، ثم كزة ثقوب في parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد تجفيف طاف المجمدة لازالة كل السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بقايا مع الميثانول 3 مل جاف، vortexing تماما (استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية وإذا رغبت في ذلك)؛ غطاء الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي ثم في 2000 إطار التعاون الإقليمي لمدة 10 دقائق لتسويةمن الأملاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل وطاف على قارورة مل 3 رد فعل مخروطي الشكل؛ تتبخر إلى جفاف بواسطة آلة RapidVap على 45 درجة مئوية (أو تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين الجاف إذا رغبت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على كل قارورة، أضف 100 ميكروليتر انتعاش معيار N-methylglucamine (1 ملغ مل -1 في الماء) و 1 مل H 2 O، يكتم الافواه قارورة مع parafilm، وتجميد في -20 درجة مئوية، وخرم parafilm، ومن ثم تجميد جاف . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المعايير: إضافة 100 حامض الموراميك ميكرولتر (0.5 ملغ مل -1 في الميثانول)، و 100 الجلوكوزامين ميكروليتر (1 ملغ مل -1 في الماء)، و 100 ميكرولتر ميو، اينوزيتول (1 ملغ مل -1 في الماء)، و 100 N-ميكرولتر methylglucamine (1 ملغ مل -1 في الماء)، و 1 مل H 2 O، parafilm كل قارورة، وتجميد في -20 درجة مئوية، وخرم parafilm، ثم تجميد الجافة. </li></ol> 3. اشتقاق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير كاشف اشتقاق التي تحتوي على 32 ملغ مل هيدروكلوريد هيدروكسيل -1 و 40 مجم مل -1 4 dimethylamino-PYridine في بيريدين، الميثانول (4:1 V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميليلتر من كاشف اشتقاق إلى كل من reactivials، الغطاء بإحكام، ودوامة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة في 75-80 درجة مئوية حمام الماء لمدة 35 دقيقة (مختومة جيدا قارورة لتجنب السماح لأي المياه للدخول في قارورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قارورة من الحمام المائي، وباردا لدرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الخل أنهيدريد إلى كل من كاب مل 3، reactivials بإحكام، ودوامة جيدا، ثم يسخن في حمام ماء 75-80 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قارورة من الحمام المائي، وباردا لدرجة حرارة الغرفة. </li></ol> 4. فصل والقياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى كل كأب، وقارورة بإحكام، ودوامة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 1M إلى كل كأب، وقارورة بإحكام ودوامة تماما للسماح للحلول على الجلوس دون عائق حتى العبارات منفصلين، نضح وتجاهل الجزء العلوي (مائي) مرحلة استخدام 1000 pipettor ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و في نفسashion، استخراج مرحلة العضوية 3 مرات ولكن مع 1 مل O 2 H (مع الخطوة غسل الماضي، عناية خاصة للتأكد من أن تمت إزالة جميع من مرحلة أعلى مائي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف الحل النهائي باستخدام RapidVap على 45 درجة مئوية (أو الجاف باستخدام غاز النيتروجين إذا رغبت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل في 300 ميكروليتر خلات الإيثيل، الهكسين (1:1 V / V) ونقل إلى 2 مل من قنينات المسمار سقف العنبر مع ادخال وحجم صغير والغطاء بإحكام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالكمي وتحليلها بواسطة GC-FID باستخدام قطبي العمود الشعري السيليكا تنصهر فيها: 30 مترا، 0.25 ملم معرف، 0.25 سماكة الفيلم أم؛ مرحلة ثابتة 5٪ فينيل، 95٪ ميثيل polysiloxane (DB-5 أو ما يعادلها) مع الهيدروجين أو الهليوم والغاز الناقل، في 0.5 مل تدفق -1 دقيقة ثابتة. واللوني هو أفضل على قسط مراحل &quot;خاملة&quot;، وغاز الهيدروجين الناقل، ولكن غير مقبول على أصناف أكثر شيوعا ومع الهيليوم. إعدادات كاشف هي 300 درجة مئوية، 400 مل دقيقة -1 الهواء و30 مل -1 دقيقة للنيتروجين على حد سواء وغازات الهيدروجين ماكياج. الحقن والمعلمات فرن هي كما يلي: 1 حقن الانقسام ميكرولتر (30:1) مع مدخل القيادة العامة التي حددت في 250 درجة مئوية؛ الأولية حرارة الفرن، و 120 درجة مئوية، عقد 1 دقيقة، وزيادة درجة حرارة الفرن عند 10 درجة مئوية دقيقة. -1 إلى 250 درجة مئوية؛ عقد 2،5 دقيقة؛. المنحدر إلى 270 درجة مئوية عند 20 درجة مئوية دقيقة -1؛ عقد 2 دقيقة، المنحدر إلى 290 درجة مئوية عند 20 درجة مئوية دقيقة -1، عقد 5 دقائق. ضبط معدل تدفق الغاز الناقل بحيث أزل اينوزيتول، الجلوكوزامين ومشتقات حمض الموراميك على 250 درجة مئوية، وelutes N-methylglucamine عند 270 درجة مئوية. </li></ol> 5. مشتق التحقق من صحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم التأين الناعمة LC-ESI-TOF-MS لتحديد أيون الجزيئية وتحديد الوزن الجزيئي للمشتقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام GC-EI-MS-SIM أو GC-EI MSMS من أجل تعزيز حساسية للتحقيق في الأيونات المستهدفة من المشتقات المالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم العديد من الكواشف المسمى isotopically للإعداد للمشتقات، ومن ثم استخدام هذا التحول الشاملمن تلك المشتقات المسمى isotopically في MS للتحقيق أيون الجزيئية وشظايا أيون. </li></ol> 6. ممثل النتائج بروتوكول للطريقة تتكون بصورة رئيسية من أربع خطوات: حامض الهضم، وتنقية العينة، واشتقاق، وتحديد GC (الشكل 1). ويرد مثال على تحليل للحمض الجلوكوزامين والموراميك من المخزونات ومعيار من عينة من التربة في الشكل 2. ويمكن بالإضافة إلى الجلوكوزامين وحمض الموراميك، mannosamine وغالاكتوزامين (أيزومرين الجلوكوزامين) أيضا أن تحدد في وقت واحد باستخدام طريقة. استنادا إلى عوامل استجابة للمعايير فيما يتعلق الداخلية معيار ميو، اينوزيتول، ويمكننا تحديد هذه المؤشرات الحيوية في عينات من التربة. وقد استخدم معيار استرداد لمراقبة النوعية في عملية اشتقاق. وتظهر مخططات لتشكيل حامض خلات aldononitrile الجلوكوزامين والموراميك derivatized في الشكل (3) </strong&gt;. وتم تحديد الهياكل المقترحة للمشتقات بواسطة GC-EIMS-SIM لتعزيز حساسية، أو التأين الناعمة LC-ESI-TOF MS-8، وتمت دراسة الهياكل المقترحة من شظايا ايون شكلت بناء على التأين الإلكترون من خلال مقارنة الأطياف ايون لل عينات أعدت مع المدرجه النظائر المختلفة 11. ويبين الشكل 4 التحول الشامل لايون المهيمنة م / ض 187 من aldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized في ثلاثة سيناريوهات، الذي أعد مع وكلاء غير المسمى، الأنهيدريت D-الخل، ويو -13 سي الجلوكوزامين. ويمكن الإشارة إلى معلومات تفصيلية أخرى وتفسيرات لمنشوراتنا الأخيرة 8 و 11. ويمكن هذه الاستراتيجية بمثابة نموذج لدراسة الكيمياء المشتقة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> الرقم تدفق قياس 1. الرسم البياني للبروتوكول لتحليل الجلوكوزامين وحامض الموراميك في التربةعينات. ويتضمن البروتوكول أساسا 4 خطوات: حمض الهضم، تنقية، اشتقاق وتصميم GC. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> الشكل 2. GC-FID المخططات الاستشرابية من الأسيتات aldononitrile من اينوزيتول، الجلوكوزامين، وحامض الموراميك، mannosamine، غالاكتوزامين وmethylglucamine لمعايير والتربة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> الشكل 3. خطط لتشكيل حامض خلات aldononitrile الجلوكوزامين والموراميك derivatized. الرقم 1 يمثل رد فعل النتريل. الرقم 2 يمثل أستلة. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> الشكل 4. الأطياف كتلة من aldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized المرتبطة متطوره ايون مهيمنوفاق في ظل الوضع EI أعدت مع (A) وكلاء غير المسمى، (B) D-الخليك الأنهيدريت، (C) يو -13 C-الجلوكوزامين. نجم يمثل النظائر الثقيلة ذرة أو مجموعة النظير.

<ol>
	<li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil:+a+review.">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li><li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+studying+soil+microbial+diversity.">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li><li>Joergensen, R. G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity,+biomass,+and+diversity+in+agricultural+soils.">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li><li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems.">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li><li>Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).</li><li>Guerrant, G. O., Moss, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+monosaccharides+as+aldononitrile,+O-methyloxime,+alditol,+and+cyclitol+acetate+derivatives+by+gas-chromatography.">Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography.</a> Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).</li><li>Zhang, X., Amelung, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic+determination+of+muramic+acid,+glucosamine,+mannosamine,+and+galactosamine+in+soils.">Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils.</a> Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).</li><li>Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+molecular+ion+structure+for+aldononitrile+acetate+derivatized+muramic+acid.">Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid.</a> Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).</li><li>He, H., Xie, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+GC/MS+technique+to+assess+15N+and+13C+incorporation+into+soil+amino+sugars.">A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars.</a> Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).</li><li>Glaser, B., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound-specific+delta+13C+analysis+of+individual+amino+sugars+-+a+tool+to+quantify+timing+and+amount+of+soil+microbial+residue+stabilization.">Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).</li><li>Liang, C., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues.">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li><li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis.">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وقدمت القيادة العامة المستندة إلى طريقة لتحليل الحمض aldononitrile خلات الجلوكوزامين والموراميك derivatized يوفر طريقة سريعة نسبيا لتحديد هذه السكريات الأمينية، والمستخرجة من التربة. والمشتقات هي مستقرة كيميائيا، ويمكن تحديدها في واحدة تحليل. لا يقتصر هذا الأسلوب على عينات م...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> حمض الموراميك </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M2503-25MG </td></tr><tr><td> D-(+)-الجلوكوزامين هيدروكلوريد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> ن ميثيل مد glucamine </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> ميو، اينوزيتول </td><td> فيشر العلمية </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> الميثانول (الجاف) </td><td> العضوية Acros </td><td> AC326950010 </td></tr><tr><td> 4-dimethylamino-بيريدين </td><td> العضوية Acros </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> خلات الإيثيل </td><td> VWR الدولية </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine هيدروكلوريد </td><td> فيشر العلمية </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> بيريدين </td><td> فيشر العلمية </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> أنهيدريد الأسيتيك </td> &lt;TD&gt; فيشر العلمية </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> ثنائي كلورو ميثان (كلوريد الميثيلين) </td><td> فيشر العلمية </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> الهكسين </td><td> فيشر العلمية </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> حمض الهيدروكلوريك (6M) </td><td> فيشر العلمية </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> هيدروكسيل هيدروكلوريد -15 N </td><td> أيقونة الخدمات </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> أنهيدريد الأسيتيك -2 H (C D 6 4 O 3) </td><td> العضوية Acros </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-جلوكوز يو -13 سي </td><td> كامبردج معمل النظائر المشعة </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> الأمونيوم sufate -15 N </td><td> كامبردج معمل النظائر المشعة </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> اسم المعدات </td><td> شركة </td><td> نوع </td></tr><tr><td> سريع برنامج عمل فيينتيان </td&gt; <td> LabConco </td><td> 790002 </td></tr><tr><td> Vacum مضخة </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> التحلل قارورة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 06 423A </td></tr><tr><td> اشتقاق microvial </td><td> فيشر العلمية </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> هيوليت باكارد </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> هيوليت باكارد </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> اجيلنت </td><td> في 1200 اجيلنت نظام HPLC سلسلة بالإضافة إلى LC اجيلنت / MSD-TOF </td></tr></tbody></table>

gc-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil

نهج كمي إلى الكائنات الحية الدقيقة التي تميز حاسمة لفهم أوسع لوضع الميكروبية وظيفة في إطار النظم الإيكولوجية. الاستراتيجيات الحالية لتحليل الجراثيم تشمل كلا من مختبر الثقافة التقليدية التي تعتمد على التقنيات وتلك القائمة على استخراج مباشرة وتحديد المؤشرات الحيوية معينة 1 و 2. يمكن زرعها قليل بين تنوع الأنواع الجرثومية التي تعيش في التربة، وبالتالي الثقافة التي تعتمد على أساليب إدخال تحيزات كبيرة، وتحديد غائبة في تحليل العلامات البيولوجية. وقد الحامض الجلوكوزامين، mannosamine، غالاكتوزامين والموراميك خدم كذلك اتخاذ تدابير لائق على حد سواء والأموات الشامل الجرثومية، من هذه الأحماض في الجلوكوزامين (الأكثر وفرة) والموراميك (فريد من الخلية البكتيرية) هي المكونات الأكثر أهمية في نظم التربة 3 (4). ومع ذلك، فإن الافتقار إلى المعرفة على تحليل يحد من تعميم واسع بين أقرانه العلمية. بين جميع EXIلسعة الطرق التحليلية، إلى اشتقاق aldononitrile الأسيتات تليها GC التحليل القائم على برزت كخيار جيد بالنسبة للتوازن على النحو الأمثل الدقة والحساسية، والبساطة، والفصل الكروماتوغرافي جيد، والاستقرار على تخزين عينة 5. هنا، نقدم لبروتوكول مفصلة لإجراء تحليل موثوق وبسيطة نسبيا من الجلوكوزامين وحامض الموراميك من التربة بعد تحويلها إلى الأسيتات aldononitrile. ويتضمن البروتوكول أساسا أربع خطوات: حامض الهضم، وتنقية العينة، واشتقاق، وتقرير مجلس الإدارة. يتم تعديل هذا الإجراء خطوة بخطوة وفقا لمنشورات السابق 6، 7. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم استراتيجية للتحقق من صحة هيكليا أيون الجزيئية المشتقة وشظايا ايون لها شكلت بناء على التأين الإلكترون. طبقنا GC-EI-MS-SIM، LC-ESI-MS-TOF والكواشف المسمى isotopically لتحديد الوزن الجزيئي للaldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized وMURحامض AMIC؛ استخدمنا تحول كتلة من النظائر المسمى المشتقات في الطيف ايون للتحقيق في شظايا ايون من كل المشتقات 8. بالإضافة إلى توضيح النظرية، فإن التحقق من أيون الجزيئية المشتقة وشظايا ايون لها أن تكون مفيدة للباحثين باستخدام δ 13 جيم أو شظايا أيون من هذه المؤشرات الحيوية في الدراسات البيولوجية الكيميائية 9 و 10.

Watch this Scientific Journal Video about GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil at JoVE.com

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

وصفنا بروتوكول طريقة لتحليل GC القائم على المشتقات خلات aldonitrile من الجلوكوزامين وحامض الموراميك المستخرجة من التربة. لتوضيح الآلية الكيميائية، ونقدم أيضا استراتيجية لتأكيد بنية المشتقة وشظايا ايون شكلت بناء على التأين الإلكترون.

GC القائم على الكشف عن حمض Aldononitrile خلات الجلوكوزامين والموراميك Derivatized لتحديد بقايا الميكروبي في التربة

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  University of Wisconsin, Madison. وصفنا بروتوكول طريقة لتحليل GC القائم على المشتقات خلات aldonitrile من الجلوكوزامين وحامض الموراميك المستخرجة من التربة. لتوضيح الآلية الكيميائية، ونقدم أيضا استراتيجية لتأكيد بنية المشتقة وشظايا ايون شكلت بناء على التأين الإلكترون.

Video: GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

المجتمعات الميكروبية في الطبيعة ومختبر -- مقابلة

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to degrade plastics. Typically, when formulations of plastics are known and a source of the feedstock is available, powdered plastic can be suspended in agar-based media and degradation determined by visualization of clearing zones. However, this approach poorly mimics in situ degradation of BDMs. First, BDMs are not dispersed as small particles throughout the soil matrix. Secondly, BDMs are not sold commercially as pure polymers, but rather as films containing additives (e.g. fillers, plasticizers and dyes) that may affect microbial growth. The procedures described herein were used for isolates acquired from soil-buried mulch films. Fungal isolates acquired from excavated BDMs were tested individually for growth on pieces of new, disinfested BDMs laid atop defined medium containing no carbon source except agar. Isolates that grew on BDMs were further tested in liquid medium where BDMs were the sole added carbon source. After approximately ten weeks, fungal colonization and BDM degradation were assessed by scanning electron microscopy. Isolates were identified via analysis of ribosomal RNA gene sequences. This report describes methods for fungal isolation, but bacteria also were isolated using these methods by substituting media appropriate for bacteria. Our methodology should prove useful for studies investigating breakdown of intact plastic films or products for which plastic feedstocks are either unknown or not available. However our approach does not provide a quantitative method for comparing rates of BDM degradation.

Plastic films labeled "biodegradable" are commercially available for agricultural use as mulches. Tillage represents an attractive disposal method, but degradation under field conditions is poorly understood. The purpose of this study was to develop methods for isolating native soil fungi and bacteria that colonize plastic mulch films after field burial.

عزل الكائنات الدقيقة في التربة الأصلية مع المحتملة لتحطيم القابلة للتحلل أفلام الجرثومة البلاستيكية المستخدمة في الزراعة

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing لتحديد وتوصيف الميكروبية

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

تقرير من أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون في خلايا الكبد الفأر الابتدائية

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

طرق تقدير من معدلات الجلوكوز والأحماض الدهنية الأكسدة في عزل قلب الجرذ العمل

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

لوح منافسة مقايسة كتقييم أولى سريع لقمع المرض

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.