עבודה זו נתמכה על ידי מענקים DOE הימות הגדולות Bioenergy מרכז המחקר (DOE BER משרד המדע DE-FC02-07ER64494). אנו מודים לד&quot;ר Xudong זאנג חברי הקבוצה שלו לדיונים טכניים מועילות והערות שלא יסולא בפז על השלמת פרוטוקול.

1. לדוגמא הכנת והפקת חומצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קפוא או יבש לאחר איסוף דגימות קרקע בשטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטחון homogenize דגימות קרקע באמצעות טחנת הכדור, מטחנת אדמה, או מכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול דגימות קרקע (המכיל&gt; 0.3 מ&quot;ג N) לתוך הבקבוק 25 מ&quot;ל הידרוליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל 6M HCl לתוך הבקבוק כל הידרוליזה, למלא N 2 גז צלוחיות, ואת המכסה בחוזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hydrolyze ב 105 ° C באינקובטור במשך 8 שעות באמצעות מתג טיימר אוטומטי. </li></ol> 2. לדוגמא טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלוחיות של חממה, מצננים לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL פנימי רגילה מיו, אינוסיטול (1 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 במים) אל בקבוק אחד, שילוב של מתערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת משפכי פלסטיק מרוקנים לתוך צלוחיות 200 מ&quot;ל בצורת אגס עם ST / NS 24/40 פרקים, שנקבעו על כוסות פלסטיק של יציבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולד Whatman # 2 עיגולים בקוטר איכותי (11 ס&quot;מ) לארבעה להגדיר את הנתיבים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כל בקבוק הידרוליזה, ויוצקים לתוך משפך slurry לסנן (ייתכן עוד יותר לשטוף כל בקבוק עם 3 ~ מ&quot;ל מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את תסנין באמצעות המאייד רוטרי ב ~ 45 ° C, ואקום יישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שאריות יבשות מהבקבוק כל אגס עם 3 ~ 5 מ&quot;ל מים (אמבטיה קולי להשתמש במקרה הצורך), ושופכים לתוך צינורית טפלון 40 מ&quot;ל, לשטוף את הבקבוק עם aliquot 2 מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את ה-pH ל 6.6-6.8 באמצעות פתרון 1M KOH למתכת המשתמעת יונים ומולקולות אורגניות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר משקעים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant לתוך צינור 40 מ&quot;ל זכוכית, מכסים את פתיחת צינור עם parafilm, הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, אז חורים parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבוש על ידי קור supernatant קפוא כדי להסיר את כל נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את שאריות עם מתנול יבש 3 מ&quot;ל, vortexing ביסודיות (להשתמש אמבטיה קולי אם רוצים), מכסה את הצינור, ואז סרכזת ב RCF 2000 במשך 10 דקות להתיישבאת מלחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant כדי בקבוקון 3 תגובה חרוטי מ&quot;ל; להתאדות כדי יובש על ידי מכונת RapidVap ב 45 ° C (או תחת זרם עדין של גז חנקן יבש אם רוצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי בקבוקון אחד, להוסיף 100 μL התאוששות תקן N-methylglucamine (1 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 במים) ו - 1 מ&quot;ל H 2 O, לכסות את הפה הבקבוקון עם parafilm, ההקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, לנקב parafilm ולאחר מכן להקפיא יבש . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הסטנדרטים: להוסיף 100 חומצה muramic μL (0.5 מ&quot;ג למ&quot;ל ב -1 מתנול), 100 גלוקוזאמין μL (1 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 במים), 100 μL מיו, אינוסיטול (1 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 במים), 100 N-μL methylglucamine (1 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 במים), ו - 1 מ&quot;ל H 2 O, parafilm כל בקבוקון, הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, לנקב parafilm, ואז להקפיא יבש. </li></ol> 3. Derivatization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגיב derivatization המכיל 32 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 hydrochloride hydroxylamine ו 40 מ&quot;ג למ&quot;ל -1 4 dimethylamino-pyridine ב-פירידין מתנול (04:01 v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL של מגיב derivatization לכל אחד reactivials את יתר בחוזקה, מערבולת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו את צלוחיות באמבטיה 75-80 ° C מים במשך 35 דקות (חתם גם את צלוחיות כדי למנוע מתן מים כלשהו להיכנס צלוחיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלוחיות מן האמבטיה במים, ומצננים לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל אנהידריד אצטית לכל אחד כובע 3 מ&quot;ל, reactivials בחוזקה, מערבולת באופן יסודי, ולאחר מכן לחמם של 75-80 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלוחיות מן האמבטיה במים, ומצננים לטמפרטורת החדר. </li></ol> 4. ההפרדה ומדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ&quot;ל dichloromethane כדי שווי כל בקבוקון, בחוזקה, מערבולת ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל 1M HCl כדי שווי כל בקבוקון, בחוזקה מערבולת באופן יסודי על מנת לאפשר פתרונות לשבת באין מפריע עד שני משפטים נפרדים, לשאוב ולזרוק את השלב העליון (מימית) באמצעות 1000 pipettor μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפה אותהashion, לחלץ את השלב האורגני 3 פעמים אבל עם 1 מ&quot;ל H 2 O (לשלב האחרון כביסה, לנקוט משנה זהירות על מנת להבטיח כי כל שלב למעלה מימית הוסר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את הפתרון הסופי באמצעות RapidVap ב 45 ° C (או יבש באמצעות גז חנקן אם רוצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס 300 אתיל אצטט μL-הקסאן (1:1 v / v) והעברה 2 מ&quot;ל ענבר בורג יתר צלוחיות עם הוספת נפח קטן וכובע בחוזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על כימות, לנתח ידי GC-FID באמצעות סיליקה מותכת פולרי טור נימי: 30 מ &#39;אורך, 0.25 id מ&quot;מ, 0.25 עובי הסרט אממ, בשלב נייח 5% פניל-, 95% מתיל-polysiloxane (DB-5 או שווה ערך) עם מימן או כמו גז ההליום הספק, על 0.5 זרימת מ&quot;ל -1 דקות קבוע. כרומטוגרפיה עדיף על פרימיום שלבים &quot;חסר תנועה&quot; ו המוביל גז מימן, אך מקובל על הזנים הנפוצים יותר עם הליום. ההגדרות הן גלאי 300 מעלות צלזיוס, 400 מ&quot;ל דקות -1 האוויר 30 מ&quot;ל דקות -1 של חנקן והןאיפור מימן גזי. הזרקת ופרמטרים תנור הן כדלקמן: 1 הזרקת פיצול μL (30:1) עם כניסת GC נקבע על 250 ° C, טמפרטורת התנור הראשונית, 120 ° C; להחזיק 1 דקות, להגביר את טמפרטורת התנור ב -10 מעלות צלזיוס דקות. -1 עד 250 מעלות צלזיוס; להחזיק 2.5 דק &#39;,. הרמפה עד 270 מעלות צלזיוס ב 20 ° C -1 דקות, להחזיק 2 דקות, כבש את 290 ° C על 20 ° C -1 דקות, להחזיק 5 דקות. התאם את הגז המוביל קצב הזרימה כך אינוסיטול, גלוקוזאמין נגזרים muramic חומצה elute ב 250 מעלות צלזיוס, ואת N-methylglucamine elutes ב 270 מעלות ג </li></ol> 5. נגזרת אימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש יינון רך LC-ESI-TOF-MS לזהות את יון מולקולרית לקבוע את המשקל המולקולרי של נגזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש GC-EI-MS-SIM או GC-EI-MSMS להגברת הרגישות לחקור יונים ממוקד של נגזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ריאגנטים שכותרתו isotopically מרובות להכנת נגזרות את ולאחר מכן השתמש שינוי מסתמאותם נגזרים שכותרתו isotopically ב MS לחקור יון מולקולרית שברי יון. </li></ol> 6. נציג תוצאות פרוטוקול של השיטה בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC (איור 1). למשל ניתוח של גלוקוזאמין וחומצה muramic ממניות סטנדרטיים מדגם הקרקע מוצגת באיור 2. חוץ מזה גלוקוזאמין muramic חומצה, mannosamine ו galactosamine (שני איזומרים של גלוקוזאמין) ניתן גם לקבוע בו זמנית באמצעות השיטה. בהתבסס על גורמים תגובה של סטנדרטים לגבי פנימי רגילה מיו, אינוסיטול, אנו יכולים לכמת את סמנים ביולוגיים בדגימות קרקע. תקן התאוששות נעשה שימוש כדי לפקח על התהליך באופן איכותי derivatization. התבניות של היווצרות החומצה אצטט aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מוצגות באיור 3 </strong&gt;. המבנים המוצעים של נגזרים נקבעו על ידי GC-EIMS-SIM להגברת הרגישות, או יינון רך LC-ESI-TOF MS-8, המבנים המוצעים של שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים נחקרו על ידי השוואת ספקטרום של יון דגימות מוכן עם incorporations איזוטופ שונים 11. איור 4 מראה את המעבר ההמוני של יון הדומיננטי M / Z 187 של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized בשלושה תרחישים, שהוכנו עם סוכנים שאינם שכותרתו, D-גפרית אלמימית אצטית, ו -13 U-C-גלוקוזאמין. מידע מפורט אחר הסברים ניתן התייחס לפרסומים האחרונים שלנו 8, 11. אסטרטגיה זו יכולה לשמש מודל ללמוד כימיה נגזרת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> 1. איור מדידה תרשים זרימה של פרוטוקול לניתוח של גלוקוזאמין וחומצה muramic באדמהדוגמאות. פרוטוקול בעיקר מכילה 4 שלבים: עיכול חומצה, טיהור, Derivatization ונחישות GC. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> איור 2. GC-FID chromatograms של acetates aldononitrile של אינוסיטול, גלוקוזאמין, muramic חומצה, mannosamine, galactosamine ו methylglucamine עבור סטנדרטים ואדמה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> איור 3. ערכות עבור היווצרות של חומצה אצטט aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized. המספר 1 מייצג תגובה nitrile. המספר 2 מייצג acetylation. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> איור 4. ספקטרום המוני של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized קשור structur יון הדומיננטיתes תחת מצב EI מוכן עם (א) גורמים שאינם שכותרתו, (ב) D-אצטית גפרית אלמימית, (ג) U -13 C-גלוקוזאמין. כוכב מייצג כבד איזוטופ אטום או קבוצה איזוטופ.

<ol>
	<li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil:+a+review.">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li><li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+studying+soil+microbial+diversity.">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li><li>Joergensen, R. G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity,+biomass,+and+diversity+in+agricultural+soils.">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li><li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems.">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li><li>Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).</li><li>Guerrant, G. O., Moss, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+monosaccharides+as+aldononitrile,+O-methyloxime,+alditol,+and+cyclitol+acetate+derivatives+by+gas-chromatography.">Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography.</a> Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).</li><li>Zhang, X., Amelung, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic+determination+of+muramic+acid,+glucosamine,+mannosamine,+and+galactosamine+in+soils.">Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils.</a> Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).</li><li>Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+molecular+ion+structure+for+aldononitrile+acetate+derivatized+muramic+acid.">Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid.</a> Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).</li><li>He, H., Xie, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+GC/MS+technique+to+assess+15N+and+13C+incorporation+into+soil+amino+sugars.">A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars.</a> Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).</li><li>Glaser, B., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound-specific+delta+13C+analysis+of+individual+amino+sugars+-+a+tool+to+quantify+timing+and+amount+of+soil+microbial+residue+stabilization.">Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).</li><li>Liang, C., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues.">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li><li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis.">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

הציג GC מבוססת השיטה לניתוח אצטט חומצה aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מספק שיטה מהירה יחסית לכמת אלה אמינו, סוכרים המופקים אדמה. הנגזרים הם יציבים מבחינה כימית, וכן ניתן לקבוע בניתוח אחד. השיטה אינה מצטמצמת אך דגימות קרקע, והוא יכול להיות פשוט יותר עבור דגימות של מטריקס...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Muramic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2503-25mg </td></tr><tr><td> D-(+), גלוקוזאמין הידרוכלוריד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1514-100 גרם </td></tr><tr><td> N-methyl-D-glucamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2004-500 גרם </td></tr><tr><td> מיו, אינוסיטול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> מתנול (יבש) </td><td> Acros אורגניים </td><td> AC326950010 </td></tr><tr><td> 4-dimethylamino-פירידין </td><td> Acros אורגניים </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> אתיל אצטט </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine hydrochloride </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> פירידין </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> אצטית אנהידריד </td> &lt;td&gt; פישר סיינטיפיק </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Dichloromethane (מתילן כלוריד) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> הקסאן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית (6M) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> Hydroxylamine hydrochloride -15 N </td><td> הסמל שירותי </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> אצטית -2 אנהידריד H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros אורגניים </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-glucose-U -13 C </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ במעבדה </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> אמוניום sufate -15 N </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ במעבדה </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> שם הציוד </td><td> חברה </td><td> סוג </td></tr><tr><td> Rapid-VAP </td&gt; <td> LabConco </td><td> 790002 </td></tr><tr><td> Vacum משאבת </td><td> KNF נויברגר </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> הידרוליזה הבקבוק </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 06 423A </td></tr><tr><td> Derivatization microvial </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> טרשת נפוצה </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Agilent מערכת סדרת HPLC מצמידים את LC Agilent / MSD-TOF </td></tr></tbody></table>

gc-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil

גישות כמותית מיקרואורגניזמים המאפיינים הם בעלי חשיבות קריטית להבנה רחבה יותר של מצב תפקוד מיקרוביאלי ובתוך מערכות אקולוגיות. האסטרטגיות הקיימות כיום עבור ניתוח חיידקים כוללים הן מסורתיות תרבות תלויי מעבדה טכניקות אלה המבוססים על מיצוי ישיר וקביעת סמנים מסוימים 1, 2. מעטים בקרב מגוון של מינים של חיידקים המאכלסים אדמה יכול להיות מתורבת, כך תלויי תרבות שיטות להציג הטיות משמעותיות, מגבלה נעדר בניתוח סמן ביולוגי. חומצה גלוקוזאמין, mannosamine, galactosamine ו muramic כבר שימש גם אמצעי של החיים וגם המוני חיידקים מתים, חומצה גלוקוזאמין (הנפוץ ביותר) ו muramic אלה (ייחודי של תא החיידק) הם המרכיבים החשובים ביותר במערכות אדמה 3 , 4. עם זאת, חוסר ידע על ניתוח מגביל פופולריזציה רחב בקרב בני גילם מדעיים. בין כל exiהעוקץ שיטות אנליטיות, derivatization כדי aldononitrile acetates ואחריו ניתוח GC מבוסס התפתחה אפשרות טובה מבחינת איזון אופטימלי דיוק, רגישות, פשטות, ההפרדה chromatographic טובה, יציבות על אחסון מדגם 5. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח אמין ופשוט יחסית של גלוקוזאמין וחומצה muramic מהקרקע לאחר ההמרה שלהם acetates aldononitrile. פרוטוקול בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC. הליך צעד אחר צעד הוא שונה על פי פרסומים בעבר 6, 7. בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיה מבנית לאמת את יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה נוצר על יינון אלקטרונים. אנחנו מוחלים GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS ו ריאגנטים שכותרתו isotopically כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized ו מורחומצה amic, היינו שינוי המסה של איזוטופ, שכותרתו נגזרים בספקטרום יון לחקור שברי יון של כל אחד נגזרים 8. בנוסף להבהרה תיאורטית, אימות של יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה יהיה שימושי לחוקרים באמצעות δ 13 C או שברי יון של סמנים אלה במחקרים biogeochemical 9, 10.

Watch this Scientific Journal Video about GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil at JoVE.com

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

אנו מתארים את שיטת פרוטוקול ניתוח GC מבוסס על אצטט נגזרים aldonitrile של גלוקוזאמין וחומצה muramic שחולצו מן הקרקע. עבור הבהרה של מנגנון כימי, יש לנו גם להציג את האסטרטגיה כדי לאשר את המבנה של נגזרת ואת שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים.

GC מבוסס זיהוי של אצטט חומצה Aldononitrile גלוקוזאמין Muramic Derivatized לקביעת שאריות מיקרוביאלית בקרקע

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  University of Wisconsin, Madison. אנו מתארים את שיטת פרוטוקול ניתוח GC מבוסס על אצטט נגזרים aldonitrile של גלוקוזאמין וחומצה muramic שחולצו מן הקרקע. עבור הבהרה של מנגנון כימי, יש לנו גם להציג את האסטרטגיה כדי לאשר את המבנה של נגזרת ואת שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים.

Video: GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

הקהילות מיקרוביאלית בטבע מעבדה - ראיון

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to degrade plastics. Typically, when formulations of plastics are known and a source of the feedstock is available, powdered plastic can be suspended in agar-based media and degradation determined by visualization of clearing zones. However, this approach poorly mimics in situ degradation of BDMs. First, BDMs are not dispersed as small particles throughout the soil matrix. Secondly, BDMs are not sold commercially as pure polymers, but rather as films containing additives (e.g. fillers, plasticizers and dyes) that may affect microbial growth. The procedures described herein were used for isolates acquired from soil-buried mulch films. Fungal isolates acquired from excavated BDMs were tested individually for growth on pieces of new, disinfested BDMs laid atop defined medium containing no carbon source except agar. Isolates that grew on BDMs were further tested in liquid medium where BDMs were the sole added carbon source. After approximately ten weeks, fungal colonization and BDM degradation were assessed by scanning electron microscopy. Isolates were identified via analysis of ribosomal RNA gene sequences. This report describes methods for fungal isolation, but bacteria also were isolated using these methods by substituting media appropriate for bacteria. Our methodology should prove useful for studies investigating breakdown of intact plastic films or products for which plastic feedstocks are either unknown or not available. However our approach does not provide a quantitative method for comparing rates of BDM degradation.

Plastic films labeled "biodegradable" are commercially available for agricultural use as mulches. Tillage represents an attractive disposal method, but degradation under field conditions is poorly understood. The purpose of this study was to develop methods for isolating native soil fungi and bacteria that colonize plastic mulch films after field burial.

בידוד של מיקרואורגניזמים באדמה אינדיאני עם פוטנציאל לפירוק סרטים מאלצים פלסטיק מתכלים המשמש בחקלאות

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing לזיהוי ואפיון חיידקים

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Assay תחרות צלחת כמו הערכה ראשונית מהירה של דיכוי מחלות

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.