يتم اعتماد الكتاب من النجم * من سنغافورة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم اعتماد المنح الدراسية من قبل MJF النجوم A * الوطنية للعلوم، وهي لوريال للنساء في ميدان العلم الوطني وزمالة لي كوان يو زمالة ما بعد الدكتوراه. ويدعم ترميز YR من منح المعاهد الوطنية للصحة (R01-01 HG004456 وR01 HG003521-01). الكتاب نعترف أيضا فريق بالفيديو للإنتاج بكسل 8، سنغافورة، ولا سيما ايسي كلفن، والسيد تشانغ شيانغ كاي والسيد جان شيرون لتصوير المشاهد، السيدة ستي الرحيم لتحرير الفيديو والسيدة ميشيل تيو لل الصوت عبر.

<ol>
	<li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB1+packages+densely+looped,+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes.">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li><li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+replication+and+transcription.">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li><li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states.">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li><li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li><li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei.">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li><li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing.">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22 (2010).</li><li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation.">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li><li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis.">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12 (2007).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li><li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+at+a+distance:+DNA-looping+and+initiation+of+transcription.">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li><li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شيا-PET هو طريقة تم تطويرها لتحديد التفاعلات طويلة المدى في تنظيم النسخ. واحدة من العوامل الحاسمة التي تحدد نوعية مكتبة شيا-PET هي نوعية المواد رقاقة. البروتوكول هو موضح في الفيديو يتضمن استخدام السلع والخدمات البيئية والفورمالديهايد لعبور الارتباط الخلايا. فإن استخدام الفورمالدهايد جنبا إلى جنب مع كاشف عبر ربط 2 تحمل الذراع يعد التبادل تساعد في الربط من البروتينات التي لا يمكن أن تكون ملزمة الفورمالديهايد وحدها 3،11،15. لقد وضعنا المكتبات مع هذه الطريقة التي أثبتت مواقع الربط قوية وطويلة المدى التفاعلات 9. ومع ذلك، قد عبر ربط وينبغي أن يكون الأمثل ظروف رقاقة لكل عامل في المصالح، وأنه من المهم عدم الإفراط تشعبي كما الكثير عبر ربط سيؤدي إلى صعوبات في تجزئة من قبل صوتنة، ويؤدي ربما في التفاعلات ونين زائفة . لونين التفاعلاتوينبغي التحقق من صحة التي حددتها شيا-PET بطريقة مختلفة، مثل التهجين في الموقع مضان 4. نوصي ما لا يقل عن 100 نانوغرام من المواد لونين. ولئن كنا قد شيدت المكتبات نوعية جيدة من 50 نانوغرام من المواد لونين، لاحظنا أن كميات كبيرة من المواد بدءا يسمح بناء شيا-PET المكتبات مع دورات PCR أقل من 16، وبالتالي تقليل amplicons والتكرار من كل مكتبة. هذا أقل التكرار يرتبط به أعلى فريدة من نوعها، وكذلك تعيين نسبة عالية من البيانات القابلة للاستخدام، وبالتالي تمكين تفاعل أكثر شمولا لونين مع عدد أقل من الخريطة حارات التسلسل. ينبغي أن الحجم النهائي معبأة من الخرز في كل أنبوب يكون 50 ميكرولتر ميكرولتر 100 لوالخرز المغناطيسي وsepharose و على التوالي. وإذا كان حجم حبة معبأة هو أقل من المعلن، وتحقيق الحد الأدنى لحجم محملة مسبقا وبالمثل مسح فارغة الخرز المغناطيسي أو sepharose و لتقليل الخسائر في DNA الحاملة للحبةق في الخطوات اللاحقة. وينبغي أن تستخدم لمرة واعادوا نصائح او نصائح واسعة الأساسية لpipetting الخرز sepharose و. وقد أدرجت التعديلات التالية بعد بروتوكول شيا-PET المنشورة سابقا 5. أولا، تم استخدام الخرز المغناطيسي G لتقليل الخسائر خلال عينة يغسل. وبالإضافة إلى ذلك، حددنا نطاقات غير محددة مع أحجام تقريبية من 100 شركة بريتيش بتروليوم BP و138 إلى تكون amplicons الذاتي ligated linkers نصف أو / والمحولات. وبالتالي، خفضنا تركيز المعقدة البيروكسيديز linkers نصف و 454 محولات GS20 للحد من نطاقات غير محددة خلال التضخيم PCR. تم تخفيض حجم ربط القرب من 50 مل إلى 10 مل لتقليل الخسائر خلال عينة الخطوات اللاحقة تنقية وحفظ أيضا على تكاليف كاشف. ونحن أيضا زيادة فترة حضانة لشل شيا-PET DNA لالتقاط حبات لضمان القصوى لشيا-PET DNA على الخرز streptavidin. خلال ربط القرب الخطوة، عمليات ربط خيالية ثار لا تمثل الحقيقية في التفاعلات المجراة لونين يتم إنشاؤها حتما بطريقة غير محددة وبشكل عشوائي. وبالتالي، لتقييم جودة البيانات من أي تجربة شيا-PET، ويقدر معدل الخيمرية من استخدام اثنين من مختلف linkers نصف مع محددة TAAG الباركود النوكليوتيدات وATGT 5. بعد التسلسل الإنتاجية العالية، ويتم تحليل متواليات شيا لأول مرة-PET لتكوين رابط الباركود وتسلسل مشتقة من منتجات محددة ومنتجات ربط ربط غير محددة يمكن تمييزها 8. النسبة المئوية للتعرف الوهم (أي heterodimers linkers AB) الموجودة في منزلنا في MCF-7 RNA البلمرة II-PET المكتبات شيا هو أقل من 15٪. وتصنف فيما بعد شيا-PET متواليات إلى فئتين، هما الذاتي ربط الحيوانات الأليفة والحيوانات الأليفة ربط بين. ويتم الحصول على الحيوانات الأليفة ربط الذاتي من التعميم ربط الذاتي من لونين شظايا في حين يتم اشتقاق ربط بين الحيوانات الأليفة من أناnter-ربط بين اثنين من شظايا الحمض النووي مختلفة. هذا الأخير هو ثم تقسيمها إلى ثلاث فئات مختلفة استنادا إلى المسافة الجينية من كل علامة على نفس الصبغي (داخل الصبغي ربط بين الحيوانات الأليفة) أو التي يتم تعيينها إلى كل من به صبغيين مختلفة (interchromosomal ربط بين الحيوانات الأليفة). قمنا بتطوير برنامج أداة شيا-PET حزمة لفرز الفئات المختلفة 8. وسوف يستند هذا على شظايا الحمض النووي الموجودة في المكتبة. عموما، سوف شظايا أصغر رقاقة تعطي دقة أعلى وقطع لهذه المكتبات البلمرة RNA-PET شيا II حوالي 4 كيلو بايت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تمييز الحقيقي من التفاعلات لونين الضجيج العشوائي عن طريق حساب عدد من الحيوانات الأليفة ربط بين كتلة في التفاعل، وبعبارة أخرى، قال مجموعة من العد PET عالية لديها أعلى احتمال كونه تفاعل حقيقي لونين 8 . لتصفية ايجابيات كاذبة لدينايرتفع من المراسي عالي التخصيب التي يمكن أن تشكل ربط بين الحيوانات الأليفة عن طريق الصدفة العشوائية، كما تم وضع إطار التحليل الإحصائي وضعت لتشكل تشكيل عشوائية من الحيوانات الأليفة أي ربط بين بين اثنين من المراسي 8. في الختام، هذه التقنية تسمح شيا-PET رسم خرائط شبكات التفاعل لونين على نطاق عالمي. تنفيذ المعالج في شيا-PET يسمح في الحد من التعقيد ومكتبة ضجيج في الخلفية. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف رقاقة خصوصية لونين التفاعلات، وتمكن من دراسة التفاعلات لونين المحددة المرتبطة عوامل النسخ خاص 5.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 4-20٪ التدرج TBE هلام </td><td> إينفيتروجن </td><td> EC6225BOX </td><td> الخطوة B، 6.3 </td></tr><tr><td> 5 × يغاز DNA T4 العازلة مع PEG </td><td> إينفيتروجن </td><td> 46300018 </td><td> B الخطوة، 2.2 </td></tr><tr><td> 6٪ TBE هلام </td><td> إينفيتروجن </td><td> EC6263BOX </td><td> الخطوة B، 6.8 </td></tr><tr><td> اجيلنت DNA 100 الفحص </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> B الخطوة، 7.1 </td></tr><tr><td> اجيلنت DNA حساسية عالية الفحص </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> اجيلنت Bioanalyzer 2100 </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> أجهزة الطرد المركزي أنابيب مرشحات (SPIN-X) </td><td> كورنينج &lt;/ TD&gt; <td> CLS8160 </td><td> الخطوة B، 3.7 و 6.9 </td></tr><tr><td> الظلام قارئ Transilluminator </td><td> كلير بحوث الكيميائية </td><td> DR46B </td><td> الخطوة B، 6.8 </td></tr><tr><td> Sonifier الرقمية المحمولة ديسروبتر </td><td> برانسون </td><td> 450D-0101063591 </td><td> خطوة، 4.3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 المغناطيس (المغناطيسي المكثف الجسيمات) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 123-21D </td><td> خطوة خطوة 7.5.1، B، لجميع الخرز المغناطيسي الغسيل الخطوات </td></tr><tr><td> DynaMag-15 المغناطيس (المغناطيسي المكثف الجسيمات) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 123.01D </td><td> الخطوة A، 5 و 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (المغناطيسي المكثف الجسيمات) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 49-2025 </td><td> الخطوة B، 6.5 </td></tr><tr><td> البلمرة DNA القولونية القولونية I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> الخطوة B، 5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </TD&gt; <td> خطوة خطوة 7.5.1، B، 4.3 و 6.5 </td></tr><tr><td> البورشيد الجيل الكتلة CBOT النظام </td><td> البورشيد </td><td> SY-301-2002 </td><td> B الخطوة، 7.4 </td></tr><tr><td> محلل البورشيد الجينوم منظمة شات </td><td> البورشيد </td><td> SY-301-1301 </td><td> B الخطوة، 7.5 </td></tr><tr><td> البورشيد PE الاشعال </td><td> البورشيد </td><td> PE-102-1004 </td><td> B الخطوة، 5.4 (إذا لزم الأمر) </td></tr><tr><td> Intelli-خلاط </td><td> Palico التكنولوجيا الحيوية </td><td> RM-2L </td><td> الخطوة B، أي مع دوران حضانات </td></tr><tr><td> LightCycler 480 نظام PCR في الوقت الحقيقي </td><td> روش </td><td> 04 640 268 001 </td><td> الخطوة A، B الخطوة 7.5.3، 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR الخضراء I MasterMix </td><td> روش </td><td> 03 752 186 001 </td><td> B الخطوة، 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidin Dynabeads </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11206D </td><td> الخطوة B، 5.2 </td></tr> &lt;TR&gt; <td> المغناطيسي (Dynabeads) بروتين G </td><td> إينفيتروجن </td><td> 100.03D </td><td> الخطوة A، و5.1.1 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract عالية الكثافة (2ml) </td><td> QIAGEN </td><td> 129056 </td><td> الخطوة 7.5.1، </td></tr><tr><td> MaXtract عالية الكثافة (50ML) </td><td> QIAGEN </td><td> 129073 </td><td> B الخطوة، 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز ONE ريبونوكلياز </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> B الخطوة، 4.8 </td></tr><tr><td> RNA البلمرة II (8WG16) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة </td><td> كوفانس </td><td> MMS-126R </td><td> الخطوة A، 5.2.4 </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي البلوط ريدج (البولي بروبلين) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> خطوة، 3.1 </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي البلوط ريدج (تفلون FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> B الخطوة، 4.3 </td></tr><tr><td> Phusأيون عالية الإخلاص ماجستير ميكس </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> الخطوة B، 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (كوانت-IT) dsDNA الكاشف </td><td> إينفيتروجن </td><td> P11495 </td><td> الخطوة A، 7.5.2 </td></tr><tr><td> البوليسترين اختبار القاع جولة تيوب </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 352057 </td><td> خطوة، 4.1 </td></tr><tr><td> أقراص البروتيني كوكتيل المانع (كامل، EDTA خالية) </td><td> روش </td><td> 11873580001 </td><td> خطوة، 1.6 وما بعده </td></tr><tr><td> بروتين K الحل (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> الخطوة A، 4.4، 7.5.1 B الخطوة، 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNA يغاز </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> B الخطوة، 2.2، 3.9 و 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA يغاز العازلة (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> B الخطوة، 3.3 و 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA البلمرة </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>B الخطوة، 1.2 </td></tr><tr><td> T4 كيناز عديد النوكليوتيد DNA </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> الخطوة B و 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS كيت V5-GA </td><td> البورشيد </td><td> FC-104-5001 </td><td> الحكام لنظام الجينوم البورشيد منظمة شات محلل </td></tr><tr><td> TruSeq PE-V2 الكتلة كيت CBOT-GA </td><td> البورشيد </td><td> PE-300-2001 </td><td> أن يكون استخدام مع الكتلة البورشيد CBOT نظام توليد </td></tr><tr><td> SYBR الخضراء I </td><td> إينفيتروجن </td><td> S-7585 </td><td> B الخطوة، 6.3 و 6.8 </td></tr><tr><td> إكس سيل SureLock النظام الكهربائي ميني خلية </td><td> إينفيتروجن </td><td> EI0001 </td><td> B الخطوة، 6.3 و 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td colspan="2"> تسلسل </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td rowspan="2"> المعقدة البيروكسيديز نصف linkers A (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية الداخلية البيوتين DT (9) </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية </td></tr><tr><td rowspan="2"> المعقدة البيروكسيديز نصف linkers B (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية الداخلية البيوتين DT (9) </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية </td></tr><tr><td rowspan="2"> غير المعقدة البيروكسيديز نصف linkers (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 محول A (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT GTG CCC TGC TCC CATCTG TTC CTC CCT CCC TGT AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG GAT CAG GGA TGA GG 3 &#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 محول B (200ng/μl) </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;AGA CTG CAC GCA ACA GGG GAT CAA AGG GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td rowspan="2"> البورشيد-NN محولات </td><td> أعلى </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC ACG TAC ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق HPLC تنقية انظر الخطوة B و 5.4 </td></tr><tr><td> النغفة يرقانة النبر </td><td> 5 &#39;فوس - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> فسفرته 250 nmole نطاق HPLC تنقية نهاية 5 &#39;انظر الخطوة B و 5.4 </td></tr><tr><td> البورشيد 1-454 (إلى الأمام) التمهيدي (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC ACC GAG ATC TAC GTG CTA TCC CCT TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> البورشيد 2-454 (العكسية) التمهيدي (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> qPCR التمهيدي 1.1 (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GAG ACC ACC GCG AT 3&#39; </td><td> 10nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> qPCR التمهيدي 2.1 (10 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole نطاق الصف PCR </td></tr><tr><td> البورشيد التمهيدي التسلسل 3-454 (100 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG TTC CTC CCT CCC TGT AG 3 &#39; </td><td> 100nmole نطاق HPLC تنقية </td></tr><tr><td> البورشيد التمهيدي التسلسل 4-454 (100 ميكرومتر) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole النطاقHPLC تنقية </td></tr></tbody></table> وصف oligos ترتيب جدول oligos والمحولات. من تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) وإعداد linkers ومحولات بنفس الطريقة كما في السابق 10. قد تكون مستعدة نصف linkers ومحولات مسبقا وتخزينها لعدة أشهر في -20 ° C.

chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing (chia-pet) for mapping chromatin interactions and understanding transcription regulation

ويتم تنظيم الجينوم في هياكل ثلاثية الأبعاد، واعتماد العليا التشكل داخل المساحات ميكرون الحجم النووية 7، 2، 12. أبنية هذه ليست عشوائية وتنطوي على التفاعل بين الجينات والمروجين العناصر التنظيمية 13. الربط من عوامل النسخ متواليات التنظيمية ليجلب محددة شبكة من تنظيم النسخ والتنسيق 1، 14. وقد وضعت لونين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لتحديد هذه الهياكل العليا لونين 5،6. يتم إصلاح الخلايا ويتم التقاطها بواسطة التفاعل المكاني التساهمية DNA البروتين الروابط المتبادلة. للحد من الضوضاء غير محددة والحد من التعقيد، وكذلك لزيادة خصوصية تحليل التفاعل لونين، لونين مناعي يستخدم (رقاقة) ضد العوامل المحددة لتخصيب البروتين شظايا لونين من الفائدة قبل ربط القرب. ربط تنطوي نصف linkers تشكل في وقت لاحق الروابط التساهمية بين أزواج من شظايا الحمض النووي المربوطة معا ضمن مجمعات لونين الفردية. تقييد انزيم مواقع MmeI المرافقة في linkers نصف تسمح استخراج المقترنة يبني مجتمع طلال أبوغزاله للرابط، علامة النهاية (الحيوانات الأليفة) على الهضم MmeI. كما هي المعقدة البيروكسيديز وlinkers نصف، وتنقية هذه التركيبات PET باستخدام streptavidin المغناطيسي الخرز. وligated الحيوانات الأليفة تنقيته مع محولات الجيل القادم التسلسل وفهرس للشظايا التفاعل يتم إنشاؤها عن طريق الجيل المقبل من التعاقب مثل الجينوم محلل البورشيد. ثم يتم تنفيذ رسم الخرائط وتحليل المعلومات البيولوجية للتعرف على رقاقة التخصيب ملزمة المواقع ورقاقة التخصيب التفاعلات ونين 8. لدينا انتاج شريط فيديو لإثبات الجوانب الحاسمة للبروتوكول شيا-PET، وخاصة إعداد شريحة ونوعية المعالج تلعب دورا رئيسيا في نتائج مكتبة شيا-PET. كما البروتوكولات هيطويلة جدا، وتظهر فقط الخطوات الحاسمة في الفيديو.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation at JoVE.c

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

الكروماتين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) هو وسيلة ل<em&gt; من جديد</em&gt; الكشف عن التفاعلات لونين، لفهم أفضل للتحكم النسخي.

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

chromatin-interaction-analysis-with-paired-end-tag-sequencing-chia

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

30.5K Views.  Agency for Science, Technology and Research, Singapore. الكروماتين تحليل التفاعل عن طريق ترتيب العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) هو وسيلة ل من جديد الكشف عن التفاعلات لونين، لفهم أفضل للتحكم النسخي.

Video: Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

قراءة واحدة المقترنة مكتبات نهاية البورشيد مرنا ، في الفترة من 10 نانوجرام تسلسل الحمض النووي الريبي مجموع

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

لونين مناعي (رقاقة) باستخدام ذبابة الفاكهة الأنسجة

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

جيل وتنقية الإنسان INO80 ونين إعادة عرض مجمعات وSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).