فإن الكتاب أود أن أشكر ندى Naffakh وماري آن Rameix-يلتي (معهد باستور) لفيروس rWSN-PB2-بكتيريا.

<html> ويبين المخطط الانسيابي التخطيطي للبروتوكول في الشكل. وتقدم (1) وجدول الكواشف أدناه. 1. إصابة (16 - 24 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذرة من خلايا هيلا في 5 150 ملم من البلاستيك أطباق ثقافة خلية في المتوسط ​​Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) عالية متوسطة الجلوكوز، بحيث سيصل الى حوالي 80٪ confluency في اليوم التالي (ما يقرب من 5 × 10 8 خلايا). من المهم أن الخلايا لا تصل إلى 100٪ confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، يخفف من بكتيريا الموسومة فيروس الانفلونزا الأوراق المالية في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.3٪ الأبقار مصل (BSA) إلى عدد وافر من العدوى من 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسط ​​نمو من الخلايا، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 10 مل PBS التي تحتوي على الفيروس الى الخلايا. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة عدوى مع DMEM عالية الجلوكوز، وتستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية. </li></ol>&quot;&gt; ويبلغ طول الحضانة يعتمد على مرحلة العدوى إلى دراسة (انظر المناقشة). 2. التحت خلوية تقطير (3 ح) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني الباردة وتعليق ثم الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة مع مكشطة المطاط، ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة لمدة 5 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة ومن ثم نضح في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend خلية بيليه في 10 مل العازلة السكروز البارد (10 درجة الحموضة HEPES ملي 7.9، 10 ملي بوكل، 2 خلات الماغنسيوم ملم (MgOAc)، 3 مم CaCl 2، 340 السكروز مم، 1 مم dithiothreitol (DTT)، 1٪ خليط مثبط للبروتياز) . بعد تعليق، تمر الخلايا من خلال طرف 200 ماصة ميكرولتر تعلق على ماصة بلاستيكية المصل 10 مل لعرقلة كتل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 10 دقيقة على الجليد. عكس بلطف دوريا لresuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Nonidet P-40 (NP-40) إلى تركيز النهائي من 0.5٪، ودوامة بسرعة عالية لمدة 15 ثانية. أجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 10 دقيقة في 3500 XG في درجة مئوية 4 في centrifu فوق المنضدةشركة جنرال الكتريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء حشوية. يجب أن يكون بيليه أصغر حجما وأشد بياضا من بيليه الخلية الأصلية. ويمكن تخزين جميع أجزاء ما لا يقل عن 4 ساعات في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه في 5 مل العازلة السكروز الباردة، وإعادة الطرد المركزي كما في الخطوة 2.5 وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه (التي تحتوي على نوى) في 1.5 مل الباردة العازلة استخراج النواة إلى الهيولى (HEPES 50 ملم 7.9 درجة الحموضة، 150 مم KOAc، 1.5 ملم MgCl 2، 0.1٪ NP-40، 1 ملم DTT، 1٪ خليط مثبط للبروتياز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى مبرد، كل من الزجاج 4 الخالط Dounce مل مع مدقة ضيقة والتجانس نواة مع 20 السكتات الدماغية. تجنب الرغوة خلال التجانس. وينبغي زيادة المقاومة بعد ما يقرب من 10 السكتات الدماغية. ويمكن التأكد من تجانس فعال تحت مجهر مرحلة التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل نواة متجانسة إلى أنبوب مل microcentrifuge 1.5 واحتضان 20 دقيقة على عجلة دوارة في 4 درجاتC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في ز س 16000 في microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء النواة إلى الهيولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في 1.5 مل العازلة الهضم (HEPES 50 ملم درجة الحموضة 7.9 و 10 ملم كلوريد الصوديوم، 1.5 ملم MgCl 2، 1 ملم DTT، 1٪ خليط مثبط البروتياز، 100 U / Benzonase مل (الحمض النووي الريبي للتحليل، بديلا مع 20 U / ريبونوكلياز مل خالية من الدناز I)) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، واحتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 42 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم M 5 (لتركيز النهائي من كلوريد الصوديوم 150 مم)، واحتضان 20 دقيقة أخرى في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في ز س 16000 في microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء ch150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في 1.5 مل العازلة عالية من الملح البارد (50 درجة الحموضة HEPES ملي 7.9، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.5 MgCl 2 مم، 0.1٪ NP-40، 1 ملم DTT، 1٪ خليط مثبط للبروتياز)، واحتضان 20 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 16000 س ز &lt;/ م&gt; في microcentrifuge في درجة مئوية لمدة 10 دقيقة 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا هو جزء ch500. </li></ol> 3. بكتيريا، علامة تنقية (2 ح) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم M 5 إلى كسر هيولي (لتركيز النهائي من كلوريد الصوديوم 150 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 100 ميكرولتر من الخرز معبأة sepharose و بكتيريا، Tactin في كسر في أنبوب 15 مل مخروطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مجلدا من عازلة غسيل بكتيريا (20 درجة الحموضة HEPES ملي 7.9، 150 مم كلوريد الصوديوم (500 ملي مول كلوريد الصوديوم لch500 عينات)، 1 ملم EDTA) لالخرز، وعكس أنبوب لخلط، وأجهزة الطرد المركزي في 5 دقائق ز س 1000 في منضدية الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، كرر الخطوة 3،3 مرتين وresuspend ثم بيليه حبة في حجم مساو من عازلة غسيل بكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من غسلها الطين حبة بكتيريا-Tactin إلى كل جزء (1،5 في أنابيب microcentrifuge مل nuceloplasmic، ch150، وch500 الكسور وأنبوب 15 مل مخروطي لكسر حشوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناوبأنابيب 1H في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة أنابيب 1 دقيقة في ز س 1000 في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل غسيل بكتيريا الباردة العازلة على كل أنبوب. نقل حبات من أنبوب مل 15 (جزء حشوية) إلى أنبوب 1.5 مل. غسل جميع مواسير 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، بعد الطرد المركزي كما في الخطوة 3.7. كرر هذه الخطوة يغسل مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة غسل الماضي، وإزالة كل أثر للغسيل العازلة باستخدام طرف ماصة شقة. إضافة 100 العازلة شطف ميكروليتر (بكتيريا العازلة غسيل تحتوي على 2،5 desthiobiotin ملم) ومزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 15 دقيقة على الجليد. مزيج بلطف حبات من حين لآخر من خلال استغلال الجزء السفلي من الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي 1 دقيقة في 1000 × ز في 4 درجات مئوية في microcentrifuge. جمع تحتوي على بكتيريا مزال طاف الموسومة vRNPs. </li></ol> 4. ممثل النتائج فإن الحكم على كفاءة التجزئة عن طريق تحليل لطخة غربية من lysates مجزأة باستخدام antibعلامات محددة لالتحت خلوية (الشكل 2) odies. على وجه التحديد، ينبغي تجزئة النووية الدقيقة الناجحة تظهر ضئيلة أو معدومة بوليميريز الحمض النووي الريبي الخلوية الثاني (بول الثاني) في النواة إلى الهيولى، أو جزء النووية القابلة للذوبان 4، ومعظم وينبغي استخلاص مع 150 ملم كلوريد الصوديوم 5. وأيضا تدهور بول الثاني لوحظ في بتكاثر الخلايا المصابة بالفيروسات إنفلونزا مقارنة مع الخلايا غير المصابة، بما يتفق مع الأدب 6. يتم الحكم على أفضل تنقية vRNPs بواسطة فضة أو تلطيخ Coomassie، كما هو موضح لشطافة السيتوبلازمية في الشكل. 3. في تجربتنا، ويتم تنقيته معظم بكتيريا، PB2 في كجزء من vRNP الصياغة التامة، يتم القبض على أي بوليميريز قابل للذوبان القليل. وينعكس هذا في ارتفاع NP: PA/PB1/PB2 نسبة الفضة التي لاحظها أو تلطيخ Coomassie. انخفاض نسبة تلوث يوحي العازلة مع RNases، كما هي معروفة في كل مكان RNases عدة (مثل ريبونوكلياز A) على الحمض النووي الريبي يلتصق الفيروس في مثل هذه الطريقة لdissociيأكل من البلمرة من multimers NP 7. ومن المثير للاهتمام، والمعاملة مع Benzonase وحدها، في حين يكفي لهضم RNA الفيروسي، ويبدو أن ليس لها أي تأثير على نسب stochiometric من البروتينات vRNP. على الرغم من أننا لا يمكن تفسير هذه الظاهرة، لاحظنا انقطاع vRNPs بعد الهضم مع RNases أخرى (لا تظهر البيانات)، مما يوحي بأن Benzonase قد يترك بعض مناطق مهمة من الناحية الهيكلية RNA سليمة. بعد تنقية vRNPs من السيتوبلازم وnucleoplasm (القيام بها دون هضم nuclease)، يمكن ملاحظة 8 فرق خافت ولكن منفصلة في أوزان جزيئية عالية من تلطيخ الفضة، والتي تتوافق مع الأوزان الجزيئية وتوقع من شرائح إنفلونزا الجينوم 8 (انظر المرجع. 3 ). وترد المبالغ النسبية للvRNPs تنقيته من كل جزء في 9 إصابة آخر ساعة في الشكل. 4. توزيع vRNPs يختلف على مدى الإصابة، مع أقوى تراكم في جزء ch150 نقاط في وقت مبكر، وزيادة تراكم في nucleoplasm والسيتوبلازم في نقاط وقت متأخر. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الرسم البياني رقم 1 التدفق. للتجزئة التحت خلوية. مقتبس من المرجع. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. الغربية لطخة تحليل الكسور التحت خلوية من الخلايا المصابة بالفيروسات الأنفلونزا. أصيب 10 9 خلايا هيلا مع فيروس الانفلونزا WSN سلالة لمدة 9 ساعات قبل تجزئة التحت خلوية. تم تحميل كميات متساوية من البروتين الكلي في كل حارة وتحليلها باستخدام الأجسام المضادة هو مبين. تم الكشف عن الحمض النووي الريبي الثاني بوليميريز (بول الثاني) باستخدام استنساخ 8WG16، الذي يعترف جميع أشكال المجال C-محطة (الفرقة hypophosphorylated هو الأبرز). مقتبس من المرجع. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="الشكل (3)"/> الشكل 3.وصمة عار تحليل الفضة النقية من vRNPs. أصيب خلايا هيلا مع rWSN (كعنصر تحكم سلبية) أو rWSN-PB2-بكتيريا لمدة 9 ساعات، تليها تنقية بكتيريا من الكسر حشوية. النجمة يدل على الفرق التي ليست واضحة بعد الهضم ريبونوكلياز. مقتبس من المرجع. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. تحليل وصمة عار من فضة vRNPs تنقيته من كسور الخلوية المختلفة. أصيب 10 9 خلايا هيلا مع rWSN-PB2-بكتيريا أو rWSN لمدة 9 ساعات ثم بواسطة تجزئة التحت خلوية وتنقية بكتيريا. تم تحميل كميات متساوية من شطافة من كل جزء. مقتبس من المرجع. 3.

<ol>
	<li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II.">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li><li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes.">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329 (2005).</li><li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting.">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).</li><li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell:+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure.">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li><li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin.">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II.">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li><li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins.">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li><li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle.">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).</li><li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection.">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li><li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma,+MOPC+315.">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).</li><li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research.">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618 (2011).</li><li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication.">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في حين أن العديد من الدراسات قد حددت مؤخرا البروتينات الفردية أو الشبكات الخلوية العاملة في عدوى فيروس الانفلونزا 8، وأهمية وظيفية لغالبية هذه التفاعلات لا يزال غير واضح. بالنظر إلى الاعتماد المطلق من لونين على أساس وظائف لتخليق فيروس انفلونزا الحمض النووي ال?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DMEM عالية الجلوكوز </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> جيش صرب البوسنة </td><td> سيغما </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> البروتيني المانع ميكس G </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Novagen </td><td> 71206 </td><td> يو 25 / ميكرولتر </td></tr><tr><td> الدناز أنا، ريبونوكلياز خالية </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> يو 50 / ميكرولتر </td></tr><tr><td> الخالط Dounce </td><td> ويتون </td><td> 432-1271 </td><td> استخدام نوع &quot;ب&quot; مدقة </td></tr><tr><td> بكتيريا-Tactin sepharose و </td><td> IBA شركة محدودة </td><td> 2-1201-025 </td><td> ويمكن أيضا أن 50٪ شكل عمود التعليق يمكن استخدام </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBAشركة محدودة </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells

على غرار جميع فيروسات RNA سلبي حبلا، يتم حزم الجينوم من فيروسات الانفلونزا في شكل مجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNP)، التي يتم فيها encapsidated الجينوم واحد الذين تقطعت بهم السبل من البروتين النووي (NP)، ويترافق مع مجمع بوليميريز مثلوثي تتكون للسلطة الفلسطينية، PB1، ومفارز PB2. لكن، على النقيض من معظم الفيروسات الحمض النووي الريبي، فيروسات الانفلونزا الفيروسية أداء توليف الحمض النووي الريبي في نوى الخلايا المصابة. ومن المثير للاهتمام، الفيروسية تخليق مرنا يستخدم الخليوي قبل mRNAs كما الاشعال، واقترحت أن تتم هذه العملية في لونين 1. التفاعلات بين البلمرة الفيروسية وبوليميريز الحمض النووي الريبي الثاني المضيفة، وكذلك بين الحزب الوطني و nucleosomes المضيفة كما تميزت 1،2. في الآونة الأخيرة، وتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف ترميز واحدة تنصهر فيها بكتيريا طلال أبو غزاله وراثيا لمحطة-C من الوحيدات PB2 من بوليميريز الفيروسي (rWSN-PB2 بكتيريا-3) قد يكونووصف EN. هذه الفيروسات المؤتلف السماح للتنقية من PB2 المحتوية على المجمعات، بما في ذلك vRNPs، من الخلايا المصابة. للحصول على تنقية vRNPs، يصاب الثقافات الخلية، وvRNPs هي تقارب تنقيته من lysates المستمدة من هذه الخلايا. ومع ذلك، وقد وضعت إجراءات تحلل تستخدم حتى الآن على خطوة واحدة تحلل المنظفات، والذي، على الرغم من وجود nuclease العامة، واستخراج كثير من الأحيان لونين متجهة الى مادة غير فعال فقط. عملنا الاولية اشارت الى ان عدم استخراج جزء كبير من vRNPs النووية خلال تحلل الخلية التقليدية، وبالتالي لا يمكن أن يكون تقارب المنقى. لزيادة كفاءة هذا الاستخراج، وفصل الكروماتين ملزمة من غير لونين متجهة vRNPs النووية، وتكييفها لدينا خطوة حكيمة بروتوكول الاستخراج التحت خلوية إلى الخلايا المصابة بالفيروسات الأنفلونزا. باختصار، هذا الإجراء يفصل لأول مرة من نواة الخلية ومن ثم استخراج البروتينات النووية القابلة للذوبان (وهو ما يسمى هنا &quot;النواة للهيولى&quot; جزء).يتم هضمها ثم ما تبقى من المواد النووية غير قابلة للذوبان مع Benzonase، وهي غير محددة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي nuclease، تليها خطوتين استخراج الملح: الأولى باستخدام 150 مم كلوريد الصوديوم (وهو ما يسمى &quot;ch150&quot;)، ثم كلوريد الصوديوم 500 ملم (&quot;ch500&quot;) (الشكل 1 ). وقد تم اختيار هذه الخطوات استخراج الملح على أساس ما نلاحظه 500 ملم كلوريد الصوديوم كان كافيا لذوبان أكثر من 85٪ من vRNPs النووية حتى الآن لا تزال تسمح ملزم من vRNPs المفتاحية للمصفوفة تقارب. بعد تجزئة التحت خلوية من الخلايا المصابة، فمن الممكن أن تنقي vRNPs تقارب PB2 الموسومة من كل جزء فردي وتحليل البروتين ومكوناتها باستخدام الحمض النووي الريبي البقعة الغربية وتمديد التمهيدي، على التوالي. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذه الطريقة لأننا نكتشف أن vRNP شكل مجمعات التصدير خلال نقاط في وقت متأخر من بعد الإصابة على جزء لونين المستخرجة مع كلوريد الصوديوم 500 ملم (ch500) 3.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells at JoVE.com

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

فيروسات الأنفلونزا من تكرار الحمض النووي الريبي الجينوم بالاشتراك مع الخلية المضيفة لونين. هنا، نقدم طريقة لتنقية سليمة المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية من لونين من الخلايا المصابة. يمكن تنقية المجمعات فيروسي يتم تحليلها من قبل كل من لطخة غربية والإرشاد التمهيدي من البروتين ومحتوى الحمض النووي الريبي، على التوالي.

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

affinity-purification-influenza-virus-ribonucleoprotein-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K Views.  Universitätsklinikum Freiburg. فيروسات الأنفلونزا من تكرار الحمض النووي الريبي الجينوم بالاشتراك مع الخلية المضيفة لونين. هنا، نقدم طريقة لتنقية سليمة المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية من لونين من الخلايا المصابة. يمكن تنقية المجمعات فيروسي يتم تحليلها من قبل كل من لطخة غربية والإرشاد ?...

Video: Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

المظهرية والتحليل الوظيفي من المنشط خلايا تنظيم تي المعزولة من الفئران المصابة بفيروس المزمنة الليمفاوي المشيمي

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...