وأيد هذا العمل من قبل FWO-فلاندر، ومشروع الاحتلال IOF10 / StarTT / 027 وجامعة غنت الخاصة بحوث غرانت BOF12 / GOA / 014.

ملاحظة: تم تأسيس بروتوكول ترنسفكأيشن وشارك في مناعي التالية لشكل طبق بتري 9 سم. صيغ أخرى ممكنة أيضا بعد توسيع نطاق البروتوكول. 1. البذر الكلى الجنينية البشرية (HEK) خلايا 293T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور قبل ترنسفكأيشن عند 1.2 × 10 6 خلايا في 9 سم طبق بتري في 12 مل من المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco لفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، 2 مم L-الجلوتامين، 0.4 ملي نا-البيروفات الخلايا HEK293T يوم واحد، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 100 U / البنسلين مل و 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا 16 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بصريا تفتيش على التشكل وقابلية الخلايا مع مجهر الضوء المعكوس قبل ترنسفكأيشن. الخلايا تحتاج إلى أن تكون متكدسة الفرعية لأفضل كفاءة ترنسفكأيشن. </li></ol> 2. الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من خلايا HEK293T ملاحظة: استخدام 0.5-1 ميكروغرام من pCAXL-NP أو فارغة بلازميد pCAXL في تركيبة مع 1-3 ميكروغرام من pCAXL-MX1 في 9 سم الطبق. استخدام مبلغ مساو من إجمالي DNA البلازميد في جميع العينات. ضبط مع البلازميد فارغة إذا لزم الأمر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مخازن ترنسفكأيشن التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تريس، EDTA (TE) مع تركيزات 1.0 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 و 0.1 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد BS / HEPES مع تركيزات 25 ملي HEPES (5.96 غرام / L، 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، 274 مم كلوريد الصوديوم (16 ز / L)، 10 ملي بوكل (0.74 جم / L)، 1.5 ملي NaHPO 4 · 12H 2 O (0.5 غرام / L) و 11.1 مم سكر العنب (2 ز / L). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد CaCl 2 / HEPES مع تركيزات 1.25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183.8 جم / L) و 125 ملي HEPES (29.79 جم / لتر). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05 مع هيدروكسيد الصوديوم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفئة مخازن ترنسفكأيشن في 37 ° C قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العينات البلازميد التي كتبها تمييع DNA البلازميد في 600 ميكرولتر من TE.إعداد هذه الخلائط في الآبار من لوحة 6 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من CaCl 2 / HEPES بطريقة حكيمة قطرة للعينات البلازميد ومزيج من قبل pipetting 3 مرات صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ترنسفكأيشن قطرة مضيفا الحكمة الحل البلازميد (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES، 750 ميكرولتر) إلى 750 ميكرولتر من العازلة BS / HEPES المنصوص عليها في لوحة 6 جيدا جديدة. توزيع الحل البلازميد بالتساوي على كامل تحتوي كذلك BS / HEPES العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز الحل ترنسفكأيشن على لوحة شاكر لمدة 90 ثانية في 1،000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول ترنسفكأيشن (1.5 مل) قطرة من الحكمة أن الخلايا. استخدام ممص مكروي P1000 بالتنقيط الحل ترنسفكأيشن على الخلايا. تفريق الخليط على كامل 9 سم طبق بتري ويهز لوحة بلطف شديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة. ثم إزالة المتوسطة التي كتبها طموح واستبدال واي فوراعشر 12 مل الطازجة والمتوسطة قبل تحسنت. بلطف إضافة متوسطة جديدة للخلايا لمنع انفصال الخلية. لهذا، وعقد غيض من الماصة ضد الجانب من البئر وبلطف طرد المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 16 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. </li></ol> 3. المشارك مناعي ملاحظة: إجراء شارك في مناعي 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منخفض العازلة تحلل الملح والملح العالية غسل العازلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من 2 M N-ethylmaleimide (NEM) عن طريق وزن كمية NEM وحلها في الايثانول المطلق. إعداد الأسهم حل NEM الطازجة قبل استخدامها. تنبيه: NEM سامة جدا، وإعداد واستخدام هذا الحل الأسهم في غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منخفض الملح العازلة تحلل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 1٪ NP40 وكوكتيل مثبط البروتياز (حل الجدول 1ر في 50 مل العازلة تحلل). إضافة NEM إلى تركيز النهائي من 25 ملم (أي تمييع 1:80). الحفاظ على الجليد بعد إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM. ملاحظة: دائما إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM الطازجة قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الملح العالية العازلة يغسل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 500 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA و 1٪ NP40. لاحظ أن غسل العازلة الملح العالية لا يحتوي NEM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لست] الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 2 مل من الفوسفات الجليد الباردة مخزنة المالحة (PBS). إضافة بلطف جدا غسل العازلة، وخلايا HEK293T تنفصل بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 600 ميكرولتر من الجليد الباردة منخفض العازلة تحلل الملح في 9 سم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات لمدة 20 دقيقة على الجليد. تأكد من أن لوحات يتم الاحتفاظ الأفقي، لضمان تغطية كاملة لسطح اللوحة مع تحلل العازلة. يهز بلطف لوحات كل 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المحللة خلية في microcentrifuge 1.5 ملأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و 16،000 x ج لتكوير جزء غير قابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جزء القابلة للذوبان، أي المحللة خلية إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والحفاظ على الجليد. تواصل مباشرة مع بروتوكول التعاون مناعي، لمنع تفكك البروتينات التفاعل. تنفيذ كافة الخطوات التالية قدر الإمكان على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحد من نشاط بروتين في لست]. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جيل من المركبات المناعية. ملاحظة: في هذه الخطوة، البروتين من الفائدة لا بد من الأجسام المضادة المناسبة. لدراسة التفاعل NP-MX1، واستخدام الماوس لمكافحة NP وحيدة النسيلة الأجسام المضادة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، مزيج 135 ميكرولتر من المحللة مع 2 ميكرولتر من مكافحة NP الأجسام المضادة وحيدة النسيلة و 113 ميكرولتر من تحلل العازلة منخفضة الملح (إجمالي حجم 250 ميكرولتر). تخزين المحللة المتبقية في -20 ° C لمزيد من التحليل مثل النشاف الغربي، لتوثيق مستويات التعبير من INTERA مظنونشركاء ction في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. ملاحظة: بدلا من ذلك، وقياس تركيز البروتين من المحللة (على سبيل المثال مع برادفورد كاشف) واستخدام كمية ثابتة من البروتين الكلي، على سبيل المثال، 400 ميكروغرام لكل المحللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مزيج الأجسام المضادة المحللة لمدة 3 ساعة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. ويمكن تمديد هذه الخطوة إلى الحضانة بين عشية وضحاها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البروتين الخرز G. ملاحظة: يتم شحنها والخرز البروتين G وتخزينها في 20٪ من الإيثانول لحفظ. للالطين حبة يتكون عادة من 50٪ الخرز وتحتاج إلى أن تغسل هذه الخرز قبل أن يتم استخدامها لimmunoprecipitate المركبات المناعية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 50 ميكرولتر من الخرز، أي 100 ميكرولتر من حبة الطين، لكل عينة. تغسل كمية من الخرز اللازمة لجميع العينات في مقايسة شارك في مناعي في أنبوب واحد. قطع غيض من طرف ماصة 1 مل لتخفيف pipetting لمن حبة الطين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 Xز و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. إزالة حل الإيثانول وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح. الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وإزالة طاف بلطف. كرر هذه الخطوة يغسل 3 مرات. ملاحظة: منخفض العازلة تحلل الملح تستخدم لغسل حبات ليست في حاجة لاحتواء مثبطات الأنزيم البروتيني أو NEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير حجم البروتين الخرز G وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح لجعل الجديد 50٪ حبة الطين في انخفاض العازلة تحلل الملح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، ونقل 100 ميكرولتر من حبة الطين في الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. كن حذرا لresuspend وحبة الطين قبل تقسيم، وهذه الخرز الرواسب بسرعة إلى أسفل الأنبوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناعي من المركبات المناعية عن طريق بروتين G الخرز وشطف بهم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام بروتين G الخرز لمناعي، الطرد المركزي كل 30 ثانية في أنابيب 8،000 x ج و 4 ° C وتحقق عن طريق التفتيش البصري أن هناك مبلغ مساو من الخرز موجودة في جميع العينات. إذا لزم الأمر ضبط كمية من الخرز في بعض من العينات وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على المركبات المناعية (أي.، لست] مع الأجسام المضادة، 250 ميكرولتر) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C لجمع العينة كاملة في الجزء السفلي من الأنبوب. نقل المركبات المناعية للبروتين G الخرز (50 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 60 دقيقة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. لا احتضان هذه المركبات المناعية أطول من 75 دقيقة مع حبات للحد ملزمة انوعي من البروتينات للبروتين G الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G (مع المربوطة المركبات المناعية) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وإزالة supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات. اختياري: تخزين هذه supernatants في 4 درجات مئوية أو -20 ° C لتحليلها لاحقا،على سبيل المثال، لتقدير كمية البروتين غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بروتين G الخرز لحوالي 5 دقائق مع 900 ميكرولتر من الملح العالية العازلة تحلل. تأكد من أن الخرز ومعلق تماما في غسل العازلة لغسل الأمثل. أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وتجاهل supernatants. كرر هذه الخطوة غسل 4 مرات. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز بروتين G مكعبات لتجنب فقدان المواد immunoprecipitated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة غسل الماضي، إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة إلى الخرز وتسخين تعليق لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية إلى أزل (المشترك) البروتينات immunoprecipitated. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 مل من العازلة 6X Laemmli مع 1 غرام من دوديسيل كبريتات الصوديوم، 3.5 مل من الجلسرين، و 3.5 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 420 ميكرولتر من β المركابتويثانول. التكيف مع إجمالي حجم 10 مل بإضافة الماء المقطر. تمييع 3 مرات في الماء المقطر للحصول عازلة 2X Laemmli. تنبيه: &amp;# 946؛ -mercaptoethanol غير سامة، وإعداد واستخدام عازلة Laemmli في غطاء الدخان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد التسخين، أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج وتخزين العينات في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو -20 ° C (على المدى الطويل). </li></ol></li></ol> 4. تحليل (المشارك) Immunoprecipitated البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور البروتينات الموجودة في الخلايا المحللة وشطافة من شارك في مناعي من قبل SDS-PAGE 20 و غرب النشاف 21،22. تحميل عادة نصف شطافة Laemmli على هلام. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز مكعبات G البروتين عند أخذ عينات للهلام التحميل. تم الكشف عن MX1 وNP التعبير مع مضاد للMX1 ومكافحة NP الأجسام المضادة، على التوالي 14. تم الكشف عن العصابات مع لمعان كيميائي على أساس HRP ومطور فيلم الأشعة السينية. </li></ol>

<ol>
	<li>Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mx+proteins:+antiviral+gatekeepers+that+restrain+the+uninvited.">Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).</li><li>Goujon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MX2+is+an+interferon-induced+post-entry+inhibitor+of+HIV-1+infection.">Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MX2+is+an+interferon-induced+inhibitor+of+HIV-1+infection.">MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+MxB+protein+inhibits+HIV-1+infection.">The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection.</a> Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+human+MxA+GTPase+blocks+nuclear+import+of+Thogoto+virus+nucleocapsids.">Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).</li><li>Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+interactive+region+of+human+MxA+GTPase+is+involved+in+GTPase+activation+and+interaction+with+viral+target+structures.">The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+(Orthomyxoviridae).">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution-guided+identification+of+antiviral+specificity+determinants+in+the+broadly+acting+interferon-induced+innate+immunity+factor+MxA.">Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).</li><li>Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+antiviral+activity+of+the+human+MxA+protein+against+Thogoto+and+influenza+A+virus.">Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus.</a> J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).</li><li>Turan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+MxA+proteins+form+a+complex+with+influenza+virus+NP+and+inhibit+the+transcription+of+the+engineered+influenza+virus+genome.">Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome.</a> Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).</li><li>Dittmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+strains+differ+in+sensitivity+to+the+antiviral+action+of+Mx-GTPase.">Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase.</a> J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).</li><li>Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viral+nucleoprotein+determines+Mx+sensitivity+of+influenza+A+viruses.">The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses.</a> J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).</li><li>Manz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+influenza+A+viruses+escape+from+restriction+by+human+MxA+through+adaptive+mutations+in+the+nucleoprotein.">Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein.</a> PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).</li><li>Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-inducible+protein+Mx1+inhibits+influenza+virus+by+interfering+with+functional+viral+ribonucleoprotein+complex+assembly.">Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly.</a> J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).</li><li>Brewer, C. F., Riehm, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+possible+nonspecific+reactions+between+N-ethylmaleimide+and+proteins.">Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins.</a> Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).</li><li>Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+ribonucleotide+reductase+M1-gemcitabine+interaction+in+vivo+by+N-ethylmaleimide.">Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide.</a> Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).</li><li>Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dimerization+of+human+MxA+promotes+GTP+hydrolysis,+resulting+in+a+mechanical+power+stroke.">Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke.</a> Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).</li><li>Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+metal-ion-binding+properties+of+the+Ca2+-binding+helix-loop-helix+EF-hand+motifs.">Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs.</a> Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+mouse+Mx+proteins+inhibit+different+steps+of+the+influenza+virus+multiplication+cycle.">Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle.</a> J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).</li></ol>

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

دراسة التفاعل بين البروتينات المضادة للفيروسات وأهدافها الفيروسية مهم جدا لفهم تفاصيل آلية المضادة للفيروسات من هذه البروتينات. هذا يمكن أن تعطي رؤى جديدة في كيفية الفيروسات ومضيفيهم شارك تطورت وتكون أساسا لوضع استراتيجيات المضادة للفيروسات جديدة. والأمثل بروتوك?...

مقاومة فيروس مخاطي (MX) البروتينات تعد جزءا هاما من الدفاع المناعي الفطري ضد مسببات الأمراض الفيروسية. هذه البروتينات هي GTPases مثل dynamin الكبيرة التي يتم الناجمة عن النوع الأول والنوع الثالث إنترفيرون. المقابلة الجينات الإرسال المتعدد موجودة في جميع الفقاريات تقريبا في واحدة أو عدة نسخ والمنتجات الجينات، تمنع مجموعة واسعة من الفيروسات، بما في ذلك فيروسات مخاطية قويمة (على سبيل المثال، فيروس الأنفلونزا)، فيروسات ربدية (على سبيل المثال، فيروس التهاب الفم الحويصلي)، الفيروسات البنياوية (على سبيل المثال. ، LA فيروس اكروس) وRetroviridae (على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1-4. ومن غير الواضح كيف تعترف هذه البروتينات مثل مجموعة واسعة من الفيروسات، من دون أي تسلسل الأساسي المشترك واضح الزخارف في هذه الفيروسات. تحليل تفاعل البروتينات الإرسال المتعدد مع أهدافها الفيروسية، ويحتمل أن تنطوي على المجمعات أجل أعلى مع العوامل الخلية المضيفة الأخرى، سوف تساعد على فهم الآليات الجزيئية روقد تطورت قبعة في سباق التسلح بين الفيروسات ومضيفيهم. وقد تمت دراسة التفاعل بين البروتينات الإرسال المتعدد في الثدييات والأهداف الفيروسية الأكثر نطاق واسع لMXA البشري. MXA الإنسان يمكن أن تحول دون تكرار العديد من الفيروسات، بما في ذلك orthomyxoviruses الأنفلونزا وفيروس Thogoto. MXA يربط Thogoto المجمعات بروتين نووي ريبوزي فيروس (vRNPs)، وبالتالي منع دخولهم النووي، مما يؤدي إلى كتلة من العدوى 5. وقد تجلى هذا التفاعل بين MXA وThogoto vRNPs فيروس مع زملاء الترسيب وشارك في مناعي التجارب 6-9. كيف تعيق البروتينات الإرسال المتعدد فيروسات الأنفلونزا A غير أقل وضوحا. واحد المشكلة الرئيسية هي أنه ليس واضحة لإثبات وجود التفاعل بين البروتين الإرسال المتعدد ومنتج الجين الأنفلونزا. أظهر تقرير واحد تفاعل بين MXA البشري والبروتين NP في الأنفلونزا A خلايا الفيروس 10. يمكن أن يظهر هذا التفاعل إلا من خلال التعاون immunoprecipitation إذا كان قد تعامل الخلايا مع ربط عبر dithiobis كاشف (succinimidyl بروبيونات) قبل تحلل، مما يدل على أن التفاعل هو عابر و / أو ضعيف. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الفرق الإرسال المتعدد حساسية مختلفة سلالات الأنفلونزا A يتم تحديد من أصل البروتين NP 11،12. وتماشيا مع هذا، يمكن أن فيروسات الأنفلونزا A الهروب جزئيا من سيطرة الإرسال المتعدد التي تحور بقايا محددة في البروتين NP 13. وهذا يشير إلى أن الهدف الرئيسي من فيروسات الإنفلونزا A للمضيف MX هو البروتين NP، على الأرجح NP تجميعها في مجمعات vRNP. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الدراسات الأخيرة أظهرت وجود أكثر التفاعل بين NP الإنفلونزا أو vRNPs وإما MXA البشري أو الماوس MX1. أظهرنا مؤخرا، لأول مرة، وهو التفاعل بين أنفلونزا NP والبروتين MX1 الماوس مع الأمثل بروتوكول التعاون مناعي 14، الذي يوصف هنا بالتفصيل. في العام، وشارك في طmmunoprecipitation هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية الأكثر استخداما للتحقيق تفاعلات البروتين البروتين. وغالبا ما يفضل هذه التقنية على تقنيات بديلة، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين، لأنه يسمح للتحقيق في التفاعلات البروتين البروتين في بيئتها الطبيعية. يمكن أن يتم التعاون مناعي خارجا على البروتينات وأعرب التطور الطبيعي إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتينات ذات الاهتمام المتاحة. بدلا من ذلك، البروتينات من الفائدة يمكن التعبير في الخلية من خلال ترنسفكأيشن أو العدوى، ويمكن استخدامه علامة التقارب. وبالإضافة إلى المزايا المذكورة أعلاه، وبروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح للكشف عن ضعف و / أو عابرة تفاعلات البروتين. المكون الرئيسي في هذا البروتوكول الأمثل هو إضافة N-ethylmaleimide (NEM) في المخزن المؤقت تحلل الخلية. NEM هو كاشف مؤلكل أن يتفاعل مع مجموعات ثيول المجانية مثل موجودة في cysteines، في الرقم الهيدروجيني من 6،5-7،5، لتشكيل مستقر ثيو استر(الشكل 1). في ارتفاع درجة الحموضة، ويمكن NEM أيضا تتفاعل مع مجموعات الأمينية أو الخضوع التحلل 15. وعادة ما تستخدم NEM لمنع الجماعات ثيول الحرة، وذلك لمنع تشكيل ثاني كبريتيد السندات أو تمنع النشاط الأنزيمي. على سبيل المثال، غالبا ما يستخدم NEM لمنع desumoylating الإنزيمات، والتي هي البروتياز السيستين. في بروتوكول التعاون مناعي وصفها، أدرج NEM في البداية في المخزن المؤقت تحلل لقد ذكر أن sumoylation من البروتينات الإنفلونزا يمكن أن تؤثر في التفاعل بين البروتينات الفيروسية 16. بشكل غير متوقع، أثبتت إضافة NEM أن يكون المفتاح لتوثيق التفاعل بين NP الإنفلونزا، والماوس MX1 التي شارك في مناعي. ومن غير الواضح لماذا إضافة NEM أمر حاسم للكشف عن التفاعل NP-MX1. ربما التفاعل هو عابر جدا و / أو ضعيف. NEM يمكن تحقيق الاستقرار في التفاعل، على سبيل المثال، من خلال الحفاظ على التشكل محدد من MX1، وهو بروتين فيروسي أو حتى كومبو الثالث غير معروفnent. وقد لوحظ مثل هذا أثر في تحقيق الاستقرار من NEM من قبل، على سبيل المثال، للتفاعل بين اختزال الريبونوكليوتيد M1 وجيمسيتابين المانع لها (F2dC) 17. MX1 وNP كلا تحتوي على بقايا السيستين متعددة والتي يمكن تعديلها من قبل NEM. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أجرتها ريني آخرون أن stalkless MXA-البديل يحتوي على ثلاثة المذيبات بقايا السيستين يتعرض التي يمكن تعديلها من قبل iodoacetamide. تحور هذه المخلفات إلى serines لم يؤثر على النشاط الأنزيمي من MXA، ولكن منعت بوساطة ثاني كبريتيد التجميع 18. كما يتم حفظها هذه cysteines في MX1، وهذا يشير إلى أن cysteines مماثل في MX1 يمكن تعديلها من قبل NEM وعلى هذا النحو تأثير التشكل، أو الذوبان. وبالإضافة إلى ذلك، NEM قد تؤثر أيضا على النشاط GTPase من MX1، وهو أمر ضروري للنشاط مضاد للأنفلونزا من MX1، وبالتالي تحقيق الاستقرار في التفاعل بين MX1 وNP. ومع ذلك، فإن التأثير المباشر للNEM على تشغيل إشارات GTPasevity من MX1 غير المحتمل، كما هو مطلوب NEM أيضا للكشف عن التفاعل بين NP الإنفلونزا، وGTPase المسوخ غير نشطة من البروتين MX1 14. ومن الواضح أن هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لكشف تأثير NEM على التفاعل NP-MX1. وباختصار، فإن بروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح لدراسة التفاعل بين البروتين MX1 المضادة للفيروسات وهدفه الفيروسي والأنفلونزا البروتين NP. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة أخرى التفاعلات الضعيفة أو عابرة التي تعتمد على استقرار التشكل البروتين محددة. وقد وصفت البروتين البروتين التفاعل التي تعتمد على التشكل محددة من قبل، على سبيل المثال، على البروتينات ملزم الكالسيوم مثل كالمودولين 19. وأخيرا، يمكن أن تستخدم أيضا دور الفعال لNEM في الطرق الأخرى التي تكشف عن تفاعلات البروتين البروتين، مثل فحوصات المشارك الترسيب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-ethylmaleimide هو مركب عضوي التي يمكن استخدامها لتعديل بشكل لا رجعة فيه جماعات ثيول الحرة، على سبيل المثال لمنع البروتياز السيستين (الشكل 1). بروتين مضاد للفيروسات الأنفلونزا A MX1 يمنع تكاثر الفيروس من خلال التفاعل مع البر...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein at JoVE.com

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

co-immunoprecipitation-mouse-mx1-protein-with-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K Views.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Video: Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.