وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في جزء منح R01 DK060581، R01 DK083583 (على حد سواء لRGM).

مطلوب مواد A.: انظر الجدول 1 (الكواشف) قبل إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (P / S): 100 مل 10X HBSS + 900 مل + H 2 0 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (المخزنة في الثلاجة أو أبقى على الجليد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و20٪ BSA الأسهم في المياه وaliquoted وتخزينها في -20 درجة C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (BSA): 1X 200 مل HBSS (P / S) + 3 مل من 20٪ BSA (BSA تركيزات النهائي هو 0.3٪) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جزيرة المتوسطة: RPMI + 10٪ FBS + الجلوتامين 1٪ + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Histopaque 1100: 240 [مل 1119 مل + 200 Histopaque 1077 Histopaque </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة 4-0 (مكيسون): مقطعة إلى قطع ¾ 2 بوصة وتخزينها في طبق بتري 10 سم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصكوك: ثني ملقط من أدوات العلوم الجميلة إلى 90 درجة، ورفع أسفل الأسنان مسننة من كل ثلاثة أزواج من ملقط. والهدف من ذلك هو أسنان مملة، وليس لإزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قنية لإدارة كولاجيناز / البروتيني خليط: 27G ½ بوصة إبرة، 30 ½ بوصةإبرة، أنابيب PE50 مقطعة إلى قطع 12 بوصة. ملف كل من الإبر لتصل إلى نهاية سلسة تقريب ليس لها حواف حادة. إدراج إبرة 27G في واحدة من نهاية 12 بوصة قطعة من PE50 الأنابيب. إزالة الإبرة 30G من الغلاف عن طريق تحطيم الغلاف مع زوج من كماشة، وتحول الغلاف ¼ تشغيل في كل مرة. إزالة الإبرة مع كماشة من الغلاف وأدخله في الطرف الآخر من الأنبوب PE50 تحت المجهر تشريح. تأكد من عدم شبك الأنبوب عند إدراج الإبرة في أنابيب PE50. الإبرة 27G هو نهاية التي سوف نعلق المحقنة من كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كولاجيناز (CI إنزيم MA) والبروتياز متعادلة (CI إنزيم BP). إعادة تشكيل TDE فقا لتعليمات الشركة الصانعة. الرجوع إلى شهادة الكثير من تحليل محدد لحساب تركيز نشاط انزيم. نقل ما مجموعه 350،000 وحدة الكولاجين المهينة (CDA) نشاط كولاجيناز المعاد و100،000 وحدة البروتيني المحايد للreconstituted BP البروتياز في أنبوب مخروطي الشكل وتمييع إجمالي يصل إلى 15 مل في HBSS (P / S) </li></ol> B. الخطوة بخطوة البروتوكول 1. التضخم البنكرياس مع كولاجيناز / البروتياز خليط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم، تشبع الجذع الفأر مع EtOH 70٪، تجويف البطن مفتوحة تماما من فتحة الشرج إلى الحجاب الحاجز مع أي مقص وملقط تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على منصة المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الأعور والقولون الصاعد من وتضعها خارج تجويف الجسم إلى يسارك. انظر الشكل 1 للاطلاع على موجز للخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فصوص من الكبد ضد الحجاب الحاجز، بل ينبغي أن يظل هناك إذا تجويف الجسم مفتوح بعيدا بما فيه الكفاية. العثور على الشريان الكبدي، والوريد البابي الصفراء حزمة القناة المؤدية إلى الكبد عن طريق تجتاح العفج مع ملقط المنحني. مع آخر زوج من ملقط المنحني، إليها تحت الوريد، الشريان، وبو لاصقndle وسحب 2 ¾ فيها قطعة من خياطة 4-0 تحت القناة الشريان الوريد، والصفراء، وادراك التعادل مرة واحدة وتسحبه ضيقة أقرب إلى الكبد ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين من أزواج من ملقط المنحني، والاستيلاء بعناية العفج والعثور على القناة الصفراوية التي تعلق على الاثني عشر في الحليمة. استخدام ملقط تونغ من لكزة من خلال البنكرياس والأنسجة الضامة الحق بموجب وثيقة القناة الصفراوية إلى حليمة. كزة ملقط بسرعة من خلال الجهاز لجعل حفرة ثم نضع كلا من ملقط ملقط من خلال والاستيلاء على آخر قطعة 2 ¾ بوصة من الخيط 4-0 والتعادل عن طريق لمرة واحدة وتسحبه إلى دائرة صغيرة، ولكن لا تسحب مشددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير إلى ملقط ° 90 و فائق الجودة إلى Vannas المقص. مع ملقط ° 90، قرصة بعناية وسحب الأمعاء الدقيقة حتى القناة الصفراوية هو مشدود. جعل واحدة خفض الأفقي عبر الحليمة مع مقص المقص من طعن مفتوحة إلى الأمعاء ثم قطع مع اقتراح واحد. في محاولة لجعل فقط سقطع شمال شرق عبر الحليمة دون طرد القناة الصفراوية من حليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الاستمرار في الضغط على الأمعاء مع ملقط 90 درجة، تضاف قنية في القناة الصفراوية حتى طول النصف من القناة الصفراوية، ومن ثم سحب الخيط بلطف مشددة حول قنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 3 مل مل مع 2.0 من كولاجيناز / البروتيني وحقن خليط في قنية بوتيرة بطيئة، مستمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التضخم في البنكرياس اكتمال إزالة قنية من القناة الصفراوية واستخدام ملقط ومقص منحني منحني الربيع لإزالة تضخم في البنكرياس من خلال البدء في القولون النازل والقص النسيج الضام كما كنت سحب ما يصل الأمعاء. تواصل إزالة البنكرياس من الأمعاء حتى تصل إلى القناة الصفراوية، ثم إزالة البنكرياس من الطحال، ثم المعدة والأحشاء ثم من من تجويف البطن. إنهاء إزالة من القص بعيدا الغرز. إضافة إلى أنبوب البنكرياس 50 مل تحتوي على 5 مل من HBSS(P / S). يجب أن يكون هذا الأنبوب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء أعلاه لكل حيوان ما يصل إلى أربعة حيوانات. لأفضل النتائج، فصل أربعة فقط بنكرياسات في وقت واحد. عادة، في حين أن الأربعة الأولى هي في حمام مائي 37 ° C، ونحن تضخيم آخر بنكرياسات الأربعة. </li></ol> 2. البنكرياس التفكك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب تحتوي على 50 مل بنكرياسات إلى 37 درجة C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صخرة بلطف أنبوب التفكك والتحقق من الأنسجة، والأنسجة مما لا شك يأتي بعيدا بسهولة، ثم دوامة الأنابيب 12 مرة بينما كنت عقد الأنبوب من الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة لا أكثر من 30 مل من HBSS (BSA) (يمكن أن يكون هذا مبلغ أقل، تبعا لمدى هو مطلوب لتحقيق التوازن في أنابيب الطرد المركزي للخطوة)، وأجهزة الطرد المركزي الى 290 XG لمدة دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف بعناية وترك كمية صغيرة من طاف (2-3 مل) في أسفل حتى لا تعطل بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 30 مل اتاك[هد] ل14G إبرة، إضافة لا أكثر من 10 مل من HBSS (BSA) ونضح تعليق صعودا وهبوطا 2 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الخليط من خلال مصفاة الخلية الشاي البلاستيك في أنبوب 50 مل وشطف مع آخر HBSS مل 10 (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 330 x ج لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الطافي وعكس أنابيب لتصريف على منشفة ورقية ماصة لل1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق كل أنبوب 10 مل في 1100 histopaque الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب histopaque مع HBSS مل 10 (BSA) وأجهزة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 18 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كامل 20 مل من طاف باستخدام الماصة كبيرة تحمل مل 25 و تمرير طاف من خلال ميكرومتر 70 مقلوب التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجزر في طبق بتري الطول 10 بواسطة pipetting 10 مل من خلال وسائل الإعلام جزيرة تصفية حين عقد الجانب الأيمن على مدى الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الجزر في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة الثقافة حتى الأنسجة جاهزة للتجريب. عادة، يتم الجزر اختارهم وعدها قبل experimentation. </li></ol> 3. ممثل النتائج غلة جزيرة، مورفولوجيا، والجودة هي المعايير العامة المستخدمة في الحكم على نجاح العزلة جزيرة. في أيدينا، والمحاصيل جزيرة من C57BL المتوسط ​​/ 6 هي الماوس في نطاق 150-250 الجزر باستخدام هذا البروتوكول (انظر الجدول 2)، وقابلة للمقارنة مع البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الأمثل سيغما نوع XI كولاجيناز. ومع ذلك، يمكن عوائد تختلف تبعا للسلالة الماوس المستخدمة وعمر من الفأرة. معظم الحيوانات التي نتبعها هي في الفئة العمرية 8-16 أسبوع وقد تم اختبار هذا البروتوكول على سلالات الفئران متعددة، بما في ذلك C57BL / 6 (180-250 الجزر / الماوس)، CD1 (200-300 الجزر / الماوس)، 129 / B6 (200-300 الجزر / الماوس)، BLKS-db/db (120-200 الجزر / الماوس)، NOD (10 أسابيع، 100-150 الجزر / الماوس)، وNOD-SCID (100-150 الجزر / الماوس ). ويظهر عادة التشكل جزيرة في الشكل 2 الذي يملك الجزر مستديرة لمستطيل الشكل مع حجم موحد نسبيا (على الرغم من حجم UNIFيمكن تختلف من سلالة ormity لسلالة). ويبين الشكل 3 تحليلنا نموذجية من الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين من C57BL / 6 الجزر المعزولة باستخدام الماوس TDEs تنقية مقابل سيغما كولاجيناز XI نوع. عادة، وهي جزيرة نتائج جيدة في إعداد عالية التحفيز الأنسولين الجلوكوز في 25 ملم وهذا هو 6-20 أضعاف تلك التي لوحظت في الجلوكوز 2.5 ملم. ويمكن أيضا أن تستخدم تطبيقات أخرى لاختبار نوعية الجزر المعزولة، وهذه تشمل استخدام تقنيات perifusion، كاليفورنيا 2 + التصوير (مع Fura2)، وعكس النسخ-PCR، من بين 11 آخرين. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. موجز لكيفية تركيب الكانيولا من القناة الصفراوية. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تم الحصول عليها من الجزر المظهر النموذجي C57BL / 6 في عزلة على مدار 24 ساعة التالية. صور على فيverted المجهر على التكبير 40X. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين من C57BL / الجزر 6. في عزلة على مدار 24 ساعة التالية، وحضنت 100 الجزر في طبق بشكل جيد ل12-1 ساعة عند 37 ° C-رينغر كريبس في HEPES مخزنة محلول يحتوي على 2.5 ملي الجلوكوز. ثم تم نقل إلى الجزر كريبس، قارع الأجراس في HEPES الجلوكوز 2.5 ملم لساعة إضافية، وبعد ذلك تم جمع طاف لقياس الأنسولين باستخدام اثنين من موقع immunospecific انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) (كريستال علم). تم نقل بعد ذلك إلى الجزر نفسها لكريبس، قارع الأجراس الحل HEPES مخزنة الجلوكوز تحتوي على 25 ملم، وتم قياس إفراز الأنسولين في المتوسط ​​عن طريق ELISA بعد 1 ساعة من الحضانة.

<ol>
	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDS، SAT، وليس لديهم ما RGM الكشف عنها. يعمل AGB البلاغ VitaCyte. كاتب RCM له مصلحة في ملكية VitaCyte.

في هذا البروتوكول، ووصف الإجراء نحن لدينا لكيفية تركيب الكانيولا، نضح كولاجيناز، والتفكك في البنكرياس الفئران، بهدف عزل جزر لانجرهانز. من الناحية الفنية، لدينا وسيلة، يتقن مرة واحدة، يجب أن تسمح لعزل البنكرياس في غضون 4 دقائق من euthanizing الحيوان، و1 ساعة ينبغي أن يؤدي إلى عزل الجزر من حيوان واحد. سرعة هذه التقنية تسمح لنا لعزل الجزر من الفئران تصل إلى 12 في امتداد نموذجية، مما يؤدي إلى عزلة تصل إلى 3،000 الجزر. على عكس غيرها من البروتوكولات التي تستخدم الاستعدادات الخام من كولاجيناز، بروتوكول لدينا ميزات استخدام البروتياز تنقيته، CI إنزيم MA collagenase وCI البروتياز BP إنزيم. الاختلافات في اتساق الاستعدادات TDE المتوفرة تجاريا يتطلب أن يتم اختبار كل على حدة الكثير والأمثل قبل استخدام العام. أدى هذا التغير إلى الكثير الكثير منا النظر في استخدام بوريfied TDEs من VitaCyte. وتتميز هذه TDEs عالي النقاء من أساليب متعددة بما في ذلك استخدام المقايسات الحساسة مضان الركيزة المسمى. الفحص CDA الاستشعاع أكثر حساسية لأشكال مختلفة من كولاجيناز الجزيئية التي لها حركية مختلفة في الكولاجين الأصلية المهينة. المقايسات التاريخية الركيزة الببتيد تقديم تقييم غير مكتملة من كولاجيناز. تميز كولاجيناز بواسطة أساليب متعددة تضمن أكبر نشاط انزيم بين الكثير. على أساس الاختبار في منزلنا باستخدام مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية كولاجيناز المتاحة تجاريا، وجدنا أن الانزيم المنقى تركيبات أسفرت استنساخه الكثير إلى الكثير نتائج. ومرة واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام TDEs عالي النقاء ويتميز بدقة في هذا الطلب تكوين انزيم يعرف الأمثل، وأكد على اتساق أداء الكثير إلى الكثير. هذا الاتساق يلغي عملية كثيفة العمالة التأهيل المطلوبة عادة الكثيركولاجيناز للمنتجات الخام أو المخصب. TDEs المنقى أيضا تمكين تعديلات إضافية للتكوين من أجل تحسين الإنتاجية ونوعية الجزر تعافى من سلالات الفئران مختلفة. يمكن الإبلاغ التراكيب انزيم الأمثل لعزل الجزر من سلالات مختلفة من الفئران يكون أكثر فعالية إبلاغها. وهذا، بدوره، يؤدي إلى استخدام أكثر إنتاجية للموارد وتحسين المرونة في التصميم التجريبي. هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر على نتائج جزيرة العزلة باستخدام بروتوكول دينا. الأول هو الحاجة إلى تحقيق التضخم فعالة في البنكرياس خلال نضح من تحضير الانزيم. من المهم أن تبدأ التضخم بقوة لطيف على الحقنة، وزيادة القوة وعن انتفاخ البنكرياس. ومن المفيد لتحريك الأمعاء والبنكرياس خلال رفع التضخم بحيث كولاجيناز perfuses الجهاز بأكمله. خطوة حاسمة أخرى هي القوة مع أي واحد يهز بعد عملية الشراء أنابيبص الحضانة عند 37 درجة مئوية (الخطوة 2.2). لقد وجدنا أن تهز البنكرياس الثابت ضد غطاء للأنبوب يسبب تفتت الجزر، ولكن من دون أي شكل من أشكال التفكك الميكانيكية في هذه الخطوة، والمحاصيل يمكن أن تقع جزيرة بشكل كبير. ومن الضروري أيضا أن الخطوة خلال التفكك مع حقنة (الخطوة 2.5)، يتم تطبيق قوة متوسطة المستوى خلال الحركة صعودا وهبوطا مع المكبس، وهذا يضمن كافية التفكك الأنسجة قبل الخطوة تصفية (2.6)، حيث القليل جدا ينبغي الإبقاء على الأنسجة الشاي تصفية مصفاة. وأخيرا، فإن الخطوة الأخيرة لمتابعة بعناية هو ما تصبو إليه 20 مل كامل من الجزر ومجزأة histopaque. على الرغم من أن الجزر وعادة ما تكون في واجهة من وhistopaque HBSS، وجدنا أن نفقد الجزر عندما نحاول إزالة واجهة فقط، بدلا من ذلك، ونحن الآن إزالة كامل 20 مل باستخدام الماصة كبيرة تحمل 25 مل. واضاف نحن في الترشيح من خلال فلتر مقلوب ميكرون 70 (الخطوة 2.11) للقضاء على الحاجة إلى Centrifuge الجزر مرارا وتكرارا ليغسل histopaque.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td></td><td> كتالوج # </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> فيشر العلمية </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> سيغما الدريتش </td><td> أي </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 لفة خياطة يارد 100 </td><td> مكيسون </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 نهاية حادة ز إبرة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Sciss Vannas فائق الجودة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> مقص منحني الربيع </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> منحني الملقط (2) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> ملقط المنحني (لمدة 90 °) </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 بوصة إبرة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> إبرة 30G 1/2 بوصة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE أنابيب </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز MA </td><td> Vitacyte، LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP البروتياز </td><td> Vitacyte، LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> حقنة 3 مل </td><td> فيشر العلمية </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 مل حقنة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 ميكرون فلتر </td><td> فيشر العلمية </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 سم 2 طبق بتري </td><td> فيشر العلمية </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> مصفاة الشاي البلاستيكية </td><td> أي مطبخ العرض </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف والمعدات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> سيغما نوع XI (l010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110329) </td><td> MA (081104) BP (100823) </td><td> MA (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 2. غلة جزيرة المتوسط ​​(± SD) باستخدام الكثير TDE مختلفة * * البيانات تمثل عائدات جزيرة متوسط ​​لا يقل عن 10 من الفئران. أرقام بين قوسين </td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

تحول الاستجواب من خلية بيتا التعبير الجيني وظيفة مباشرة في المختبر على مر السنين من دراسة خطوط القوارض الخلية مكون للأورام لدراسة الجزر المعزولة القوارض. الجزر الرئيسية تقدم ميزة واضحة أنهم أكثر بأمانة تعكس مسارات إشارات بيولوجية الخلايا الإفرازية والردود. في حين تم طريقة العزل باستخدام الأنسجة جزيرة الانفصال انزيم (TDE) الاستعدادات راسخة في العديد من المختبرات 1-4، الاختلافات في اتساق وجودة محصول جزيرة من أي سلالة القوارض نظرا تحد من مدى جدوى ودراسات جزيرة الأولية. هذه الاختلافات غالبا ما تحدث نتيجة لتنقية الخام TDEs جزئيا المستخدمة في إجراء العزل جزيرة؛ TDEs يحمل في كثير من الأحيان إلى الكثير الكثير الاختلافات في النشاط وغالبا ما تتطلب إدخال تعديلات على جرعة من الانزيم المستخدمة. وقد استخدم عدد قليل من التقارير عن العزلة TDEs تنقية الخلايا القوارض 5 و 6 </suف&gt;، ولكن هذه الممارسة تتعرض لنطاق واسع على الرغم من الاستخدام الروتيني ومزايا تنقية TDEs للجزيرة العزلة الإنسان. بالتعاون مع VitaCyte، ​​LLC (إنديانابوليس، IN)، وضعنا الماوس جزيرة تعديل بروتوكول العزلة على أساس تلك التي وصفها Gotoh 7 و 8، والتي هي في perfused TDEs مباشرة في قناة البنكرياس من الفئران، تليها تجزئة النسيج الخام عبر التدرج Histopaque 9، وعزل تنقية الجزر. اختلاف كبير في بروتوكول لدينا هو استخدام كولاجيناز المطهرون (CI إنزيم MA) ومحايد الجمع البروتيني (CI إنزيم BP). تميزت كولاجيناز من استخدام الكولاجين مضان 6 المهينة مقايسة (CDA) النشاط التي تستخدم fluorescently المسمى الجلد العجل للذوبان الألياف والركيزة 6. هذه الركيزة هو أكثر التنبؤية لحركية تدهور الكولاجين في المصفوفة الأنسجة لأنها تعتمد على الكولاجين الأصليين الركيزة. كان الفصل البروتينيaracterized مع مقايسة الحساسة الحركية الفلورسنت 10. الاستفادة من هذه المقايسات تحسين جنبا إلى جنب مع التحليل الكيميائية الحيوية التقليدية تمكن من تصنيع TDE أكثر اتساقا، مما يؤدي إلى تحسين الأداء الاتساق بين الكثير. على النحو الأمثل وصفها في البروتوكول هنا للجزيرة الغلة القصوى والمثلى باستخدام التشكل جزيرة C57BL / الفئران 6. خلال تطوير هذا البروتوكول، وتم تقييم مجموعات عديدة من كولاجيناز والبروتياز محايدة في تركيزات مختلفة، ونسبة النهائية للكولاجيناز: البروتيني محايدة من يمثل أداء الإنزيم 35:10 مماثلة لنوع سيغما الحادي عشر. لأن تم الإبلاغ تقلب عوائد كبيرة في جزيرة المتوسط ​​من سلالات مختلفة من الجرذان والفئران، ينبغي إجراء تعديلات إضافية للتكوين TDE لتحسين المحصول ونوعية الجزر تعافى من مختلف الأنواع والسلالات.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease at JoVE.com

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

يوصف وصفا مفصلا لعزل جزيرة الماوس باستخدام تقنية في كيفية تركيب الكانيولا في البنكرياس القنوي الموقع ونضح من مجموعة من تنقية الأنزيم البروتيني كولاجيناز ومحايدة.

الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K Views.  Indiana University School of Medicine. يوصف وصفا مفصلا لعزل جزيرة الماوس باستخدام تقنية في كيفية تركيب الكانيولا في البنكرياس القنوي الموقع ونضح من مجموعة من تنقية الأنزيم البروتيني كولاجيناز ومحايدة.

Video: Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Murine Pancreatic Islet Isolation

فأري عزل جزيرة البنكرياس

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الأول : الهضم ومجموعة من الأنسجة البنكرياس

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

الإنسان عزل جزيرة البنكرياس : الجزء الثاني : تنقية الثقافة والإنسان من الفشوت

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...