الهدف من هذا البحث هو تعميق فهمنا لدور الأوعية الدموية في البنكرياس في كل من بيولوجيا البنكرياس الطبيعية وتطور المرض. من خلال إثراء الجزء البطاني بنجاح ، نسعى إلى تحديد مسارات محددة داخل الأوعية الدموية تحكم وظائف البنكرياس ، والتي يمكن أن تستهدف استعادة وظائف البنكرياس وتعزيزها في حالات المرض. في الآونة الأخيرة ، تم التركيز بشكل متزايد على دور خلل الخلايا البطانية في أمراض البنكرياس.
سمح تحديد عدم تجانس مجموعات الخلايا البطانية في البنكرياس بفهم كيفية سعي تفاعلات البنكرياس البطاني أو الحماية من الأمراض. يتم استخدام مناهج Omics مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو النواة المفردة والبروتينات وعلم الجينوم لدراسة البنكرياس على المستوى الخلوي. لاكتساب رؤى على مستوى الأنسجة أو المستوى المكاني ، يتم تنفيذ منصات جديدة تستخدم مناهج غير متحيزة وقائمة على المسبار مثل Visium و Xenium.
في هذا البروتوكول ، نصف تقنية تفكك لطيفة تقلل من إنزيمات البنكرياس الداخلية من تقليل صلاحية الخلية وإجراء فرز الخلايا المغناطيسية لإثراء الخلايا البطانية بشكل انتقائي. ستمكن استراتيجية التفكك والإثراء لبروتوكولنا من فهم كل من علامات سطح الخلية ونسخ الخلايا البطانية البنكرياسية التي كانت قيد الاستكشاف سابقا بسبب القيود الفنية. للبدء ، ضع الماوس القتل الرحيم على طاولة العمليات.
قم بتمديد أطراف الفأر وتثبيتها بالمسامير. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق صغير في خط الوسط عبر الجلد والصفاق من منطقة أسفل البطن وتمتد نحو منطقة الصدر. اقطع الحجاب الحاجز وارفع القفص الصدري لكشف القلب.
أدخل إبرة قياس 25 إلى 30 متصلة بحقنة تحتوي على PBS معقم مثلج في البطين الأيسر للقلب. قم بتفريم القلب بمعدل خمسة إلى 10 ملليلتر في الدقيقة وتوقف بعد حقن 10 ملليلتر. ثم ، باستخدام مقص تشريح والملقط ، قم باستخراج البنكرياس بعناية.
انقل البنكرياس إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من PBS المثلج ، جنبا إلى جنب مع مثبط التربسين وضع الأنبوب على الجليد. للبدء ، احصل على بنكرياس الفئران في طبق بتري يحتوي على PBS المثلج. باستخدام المقص والملاقط الجراحية ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة بعناية.
انقل البنكرياس المشذب إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر يحتوي على مليلتر واحد من محلول التفكك. باستخدام مقص تشريح ، افرم أنسجة البنكرياس إلى قطع رفيعة ، مع إبقاء الأنبوب على الجليد. انقل المحللة إلى أنبوب سعة 50 مل يوضع على الثلج.
أضف ملليلترين من محلول الكولاجيناز إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر لإزالة أي أنسجة بنكرياس متبقية ونقلها إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا. احتضان الأنبوب في حمام مائي مقسى عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ضع الأنبوب مع تجانس الأنسجة على الجليد واتركه يستقر عن طريق الجاذبية.
ثم مرر المادة الطافية عبر مرشح 70 ميكرومتر وأضف خمسة ملليلتر من محلول إيقاف التفكك. باستخدام 27 إبرة قياس ، قم بتقطيع الحبيبات المتبقية بمقدار مليلتر إضافي واحد من محلول التفكك وقم بتمريرها عبر المرشح كما كان من قبل. قم بتدوير تعليق الخلية عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول الغسيل.
احتضان مرة واحدة في 10 إلى قوة سبع خلايا مع ميكرولتر واحد من الجسم المضاد للبيوتين المضاد ل CD31 على المدور. أضف 20 ميكرولترا من MicroBeads المضادة للبيوتين واحتضنها لمدة 40 دقيقة أخرى. ثم قم بإعداد حامل مغناطيسي مع حامل فاصل العمود وقم بتطبيق العمود.
بعد موازنة العمود ، أضف العينة إليه واغسلها بإجمالي تسعة ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت. قم بإزالة العمود من الحامل وضعه في أنبوب سعة 15 مل. أضف خمسة ملليلتر من مخزن الغسيل إلى العمود.
باستخدام المكبس ، ادفع الخلايا الموجودة في العمود لأسفل لجمع الشطف الذي يحتوي على الخلايا البطانية. أخيرا ، قم بتدوير كسور التدفق والشطف. بعد إعادة التعليق ، عد الخلايا وقياس الجدوى.
أظهر التحليل الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من صحة تخصيب الخلايا البطانية أن الكسور المخصبة تحتوي على مستويات أعلى بكثير من جينات الواسمات ، Pecam1 و Kdr مقارنة بعينات التدفق. لوحظ وجود مستوى أقل من NK6 homeobox 1 ، وهو عامل نسخ في خلايا الغدد الصماء في البنكرياس ، في الكسور المخصبة. أظهر النشاف الغربي إشارات قوية ل CD31 بالحجم المتوقع ، مما يؤكد تخصيب الخلايا البطانية في الكسور.
