فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة سيلفيا B كامبوس Bilderback وجورج J رودس لاستكمال الإجراءات الجراحية التي تنطوي على وضع خطوط الوصول الوريدي. وهم يودون أيضا أن أشكر سارة E فطم عن الحفاظ على المستعمرات ميونيخ-يستار تتكون من كل من سيمونسن وسلالات Frömter.

1. اقتران من مصل الزلال الجرذ إلى سلفو رودامين 101 كلوريد سلفونيل (تكساس الأحمر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 100 ملغ من الجرذ مصل الزلال (RSA) في 6.667 مل من 100 ملي بيكربونات الصوديوم 9.0 درجة الحموضة؛ تركيز النهائي 15 ملغ / مل في 50 مل المخروطية أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الحل في الجليد / الماء كوب وبارد إلى ما بين 0-4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من جودة عالية الفورماميد ثنائي ميثيل اللامائية (DMF) إلى قارورة ملغ 10 من تكساس الأحمر كلوريد سلفونيل (المركز التايلندي)؛ دوامة على المدى المتوسط ​​لمدة 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة حل RSA على المدى المتوسط ​​وإضافة المركز التايلندي المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف 50 مل المخروطية في احباط (Parafilm يمكن استخدامها لأؤكد ختم ضيق يتشكل)، المكان أفقيا في دلو الجليد ث / الجليد فقط ومكان على الكرسي الهزاز للتحريض حل ببطء (تجنب تشكيل فقاعات)، تسمح رد فعل أن تواصل في 0 إلى 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 5 L من محلول ملحي 0.9٪، والرطب 50 كيلو دالتون الوزن الجزيئي بقطع الدائرة التي يمكن أن تكون إما أ) غشاء غسيل الكلى مع لقطات، ب) ديأنابيب alysis كما هو الحال في تعويم-A-lyzer، أو ج) الشريحة-A-lyzer كاسيت (كل مناسبة لإزالة المركز التايلندي اللامقترن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان خليط التفاعل في غرفة غسيل الكلى ومكان في 5 L حاوية ث / محلول ملحي 0.9٪، dialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف باستخدام قضيب تحريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير 5 L حل غسيل الكلى في الصباح وبعد الظهر في وقت متأخر حتى على نتائج الحضانة بين عشية وضحاها تقريبا في أي تغيير اللون (وهذا يأخذ عادة ~ 48 ساعة مع 4 على الأقل التبادلات). بالإضافة إلى ذلك، مع MWCO من 50 كيلو دالتون كونها قريبة جدا من ميغاواط من RSA، 66kDa؛ فمن الممكن أبدا إنتاج حل واضح، وهذا سوف تعتمد على التوزيع في حجم المسام في الغشاء، و 60 ساعة و 5 التبادلات غير أكثر من الوقت الكافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجم قياس وتقسيم الوزن الأولي من 100 ملغ من حجم لإعطاء تركيز تقريبي من TR-RSA؛ عادة ما تتراوح تركيزات 10-13 ملغ / مل. يجب أن تكون نسبة الزلال ~ 4:1، 1 fluorophore في 15،00: الصبغة النهائية0 دالتون من MW البروتين. تخزينها في 4 درجة مئوية؛ NEVER تجميد حل TR-RSA، كما أدى التشرذم الذي قد يحدث سوف يغير القيم النفاذية. </li></ol> 2. إعداد مجهر المرحلة مقلوب لإعدادات التصوير / مجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ~ 4-7 قطعة من شريط الأوتوكلاف (حوالي ¾ &quot;لفترة طويلة) مكدسة فوق بعضها البعض تماما داخل 50 ملم مع طبق 40 مم أسفل ساترة (طبق أسفل ساترة). ينبغي أن توضع هذه أقرب إلى واحدة من الحواف بحيث سوف حافة الشريط اجراء اتصالات مع حافة انحناء في الكلى ولكن ليس قطع الطريق ضوء الهدف (أرقام 1A و 1B)؛ سيتطلب الفئران أكبر مساحة أكبر بين الشريط وحافة الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 2 منصات Repti-الحراريات المقبل إلى المرحلة جنبا إلى جنب مع 50 مم طبق (الشكل 1A). وضع الاحترار المياه بطانية سترة على خشبة المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق أقصى قدر من الكفاءة عندما جمع الصور بطمأنة برج موضوعية لديه 10X الهواء سR 20X (الهواء أو الماء الغمر) هدف وأعلى بالطاقة الهدف غمر المياه لجمع الصور لتحديد الكميات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء التصوير أنجع وسيلة لإضافة الماء إلى الأهداف هو تناوب عليها إلى الجانب وإضافة الماء باستخدام حقنة سم مكعب 1 مع قطعة طويلة من الأنابيب PE-200 يمكن أن تصل إلى الجزء العلوي من الأهداف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين شدة الإثارة من الليزر 10watt إلى ~ 15-20٪ باستخدام مرشحات الكثافة محايدة على البرنامج. يتم تعيين الغاليوم-أرسنيد فوسفيد الاستشعار البصرية غير descanned إلى 750 لجمع الانبعاثات الخضراء، و 625 لجمع انبعاثات الأحمر. الأزرق الانبعاثات (مثل وصمة عار هويشت النووية 33342) يتم جمعها باستخدام معيار كاشف multialkaline nondescanned مع إعداد بين 750-800. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان جمع السليم للانبعاثات منخفضة الكثافة داخل الفضاء بومان، تأكد من تعيين الحدود الدنيا للكشف حتى لا تستبعد هذه القيم. سوف علامات تحذير مرئي بيان ما إذا كانت حساسيةالإعداد هو منخفض جدا، ويجري التعبير عن هذه القيم قيمة كثافة من الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 سم مكعب حقنة مع ~ 5-8 ملغ من حل الألبومين الفلورسنت المخفف بمحلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ لإحضار الحجم الكلي إلى 1 سم مكعب. </li></ol> 3. فضح الكلى في يستار الفئران ميونيخ لحيوي داخلي 2 فوتون التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع الفئران قبل تخدير باستخدام Pentabarbitol (50 ملغ / مل حل، 120 μl/100 غرام من وزن الجسم)، Inactin (130 ملغ / مل حل، 120 μ/100 غرام من وزن الجسم)، أو Isofluorane (5٪ الاستقراء، 1.5 لصيانة 2.5٪)، وهو خط وريدي الساكن وصول (الوريدي الوداجي إما أو الفخذ)، والجهة اليسرى حلق من أسفل القفص الصدري إلى ما فوق الفخذ الأيسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فأر مسطح على جانبها الأيمن بحيث يتم اليسار، جنبا حليق مواجهة؛ تأكد من أنه مسطح على الطاولة، مع موقفها ممدود وليس جاثم، مع الجبهة الكفوف لمس كل الكفوف الأخرى والخلفية لمس كل منهما الآخر (الشكل 2A). </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> جدا جس بلطف ليشعر الكلى لتحديد حيث يضع بشكل طبيعي داخل الحيز خلف الصفاق ورسم خط مستقيم مواز للجسم (من القفص الصدري إلى الفخذ) باستخدام شربي (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الجلد مع زوج من ملقط مسنن، وقرصة الجلد على طول الخط الذي رسمته باستخدام زوج من المرقأة لسحق الأنسجة ومنع النزيف. قطع على طول شق باستخدام زوج من مقص جراحي. سوف سحق الجلد الخارجي وطبقات العضلات قبل القطع والحد بشكل كبير من عادة قضاء على النزيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء للطبقة العضلات الخارجي، والتي هي رقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لشق في طبقة العضلات الداخلية، والتي سوف تعرض الصفاق، وإعادة جس الكلى لتقدير حجم. قرصة خط شق أصغر من الكلى، مؤكدا على شق ما يزيد قليلا على الكلى. فمن الأفضل لجعل هذا شق صغير جدا وجعله أكبر إذا لزم الأمر. إذا تم إجراء هذه كبيرة جدا، وسوف تكون هناك حاجة خياطة.هذا الشق الأخير هو الحرجة؛ بعيدا جدا أكثر في أي اتجاه سوف تؤثر على الاستقرار على المسرح وإما لحث الحركة الفنية من التنفس (أفضل سيناريو) أو سوف تمتد الكلوي عنيق والحد سلبا التروية الكلوي (السيناريو الأسوأ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع الكلى (كما هو موضح في الشكل 2B) وقبضة من الدهون المحيطة باستخدام ملقط، والعمل نحو القطب السفلي من الكلية في تسليم أزياء اليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم الوصول إلى القطب السفلي من الكلى، وسحب بلطف الكلى من خلال شق في حين الضغط بلطف جدا تحت الكلى إلى الداخل للظاهر. إذا شق صغير جدا، سحق الطبقة العضلية وخفض لتوسيع ذلك؛ تكرار الإجراء إلى الداخل للظاهر الكلى. </li></ol> 4. وضع يستار الفئران ميونيخ على المسرح لتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الكلى نحو حافة الطبق ساترة مع الكلى تناوب قليلا نحو (الجانب الخلفي) الظهرية من الفئران وبالتالي فإن الجانب البطني من الكلى طو مما يجعل الاتصال مع الطبق أسفل ساترة (الشكل 1A). إضافة لذلك، معقمة 09. الحل تحسنت٪ المالحة إلى الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ننظر من خلال الهدف 10X 20X أو وتحقق من وجود الحركة. إذا تم الكشف عن الحركة، ولفة من الفئران أكثر قليلا حتى القفص الصدري هو أبعد من الطبق أسفل ساترة؛ تأكد الكلى هو أقرب إلى حافة الطبق دون تمتد الكلوي عنيق (1B الشكل). </li></ol> 5. الحصول على الصور لقياس نفاذية الكلوي من الزلال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نفاذية كبيبي (Glomeruluar النخل معامل؛ GSC) وسوف من أي جزيء يتطلب اتخاذ الصور الخلفية المرجعية من الكبيبات الفردية قبل التسريب من جزيء نيون. إذا تم تجهيز المجهر مع مرحلة الآلية قادرة على مواقع وسم، والعثور على والكبيبات مركز على حدة باستخدام الهدف انخفاض بالطاقة، وعلامة كل موقع. A تمريرة مزدوجة فلوريسئين / رودامين epifluorescence فيلثالثا مثالية لهذا الإجراء على الرغم إما تصفية الانبعاثات ستعمل (لن النقيض من المرحلة أو غيرها من مصادر غير مضان من إضاءة لا تعمل). سوف الكبيبات تظهر هياكل دائرية فارغة محاطة الأنابيب القريبة جود autoflourescence الأصفر والبرتقالي المتأصلة عند عرضها من خلال تمرير مرشح مزدوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن لديك مجهر مرحلة الآلية، مسح الكلى في نمط النقطية مع الهدف منخفضة الطاقة وعمل خريطة بدائية من حيث تقع الكبيبات الفردية؛ الاعتماد على المعالم الطبيعية مثل الأوعية الدموية السطحية الكبيرة تقع فوق الكبسولة الكلوي أو بقع الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل البرج إلى الماء أعلى سلطة الهدف الغمر واتخاذ مجموعات بيانات 3D من كل الكبيبات والتأكد من العرى الشعرية والفضاء بومان هي واضحة للعيان. وسوف تستخدم لوحة pseudocolor (شيء ما عدا B / W) تساعد على تصور هذه الهياكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التركيز في على الأوعية الدموية السطحية لبث ببطء في تيوقال انه يتم إعطاء الألبومين الفلورسنت مما يجعل الوقت تأكد من السماح لتوزيع النظامية. لجزيئات منخفضة مع GSC فمن الضروري لتعظيم قيم الكثافة في البلازما ولكن ليس للوصول إلى مستويات من شأنها أن تشبع للكشف عن الصورة في المجهر. وهذا يزيد من إمكانية الكشف الجزيئات التي تمت تصفيتها. ملاحظة: هناك عادة 5-7 ثوانى الفاصل بين الوقت الذي يتم عرض الألبومين الفلورسنت إلى الوقت الذي يظهر على الشاشة (الحصول على إطارات كامل في ~ 1 إطار / ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح حوالي 10 دقيقة للسماح أي شظايا الوزن الجزيئي صغير المحتملة لمسح قبل الحصول مجلدات 3D على فترات ميكرون 1 لاستخدامها في حساب GSC الزلال. عادة، سلالة من سيمونسن من ميونخ ويستار الفئران لديها الكبيبات سطح أقل بكثير، لذلك كل ما يمكن تصور وتصوير وكميا. سلالة Frömter لديها عدد أكبر بكثير حتى نتمكن تحديد عدد كميا إلى ~ 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الدراسة هو الموت الرحيم الفئران عن طريق جرعة زائدة من anesthetIC المستخدمة في الدراسة. يتم تنفيذ pneumothoracotamy المزدوج لضمان القتل الرحيم. </li></ol> 6. حساب GSC للنيون الزلال من وحدات التخزين 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام Metamorph برامج معالجة الصور تحميل مجموعات البيانات 3D لكل الكبيبات، فإن كلا من مجموعة أساسية ومجموعة اتخاذها بعد ضخ الزلال الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مجلد يحتوي على الألبومين الفلورسنت تحديد حلقة الشعرية سطحية مع مساحة كافية مساحة فارغة بين الهوامش المحددة لها وعلى حافة كبسولة بومان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حجم خلفية تحديد موقع الطائرة نفسها التنسيق التي ينبغي أن تحتوي على جميع الإشارات البصرية للصورة التي تحتوي على الزلال. حدد منطقة ضمن حلقة شعري من الاهتمام ونلاحظ أن متوسط ​​القراءة كثافة. المقبل تحديد منطقة داخل الفضاء بومان ونلاحظ أن متوسط ​​القراءة كثافة. وسوف تستخدم هذه كقيم الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد الكميات، تحديد المنطقة مماثلة داخل الفضاء بومان في ج الزلالontaining الصورة. القيام بذلك لمدة سنتين على الأقل من أقاليم أخرى لتأخذ في المتوسط ​​قيمة لمتوسط ​​كثافة داخل الفضاء بومان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر حلقة الشعرية مع ألمع كثافة البلازما ورسم المنطقة من حوله. القادم باستخدام وظيفة عتبة، تسليط الضوء على القيم مشرق داخل البلازما المنتشرة، وتجنب الشرائط السوداء التي تنتشر في RBC. لاحظ أن متوسط ​​قيم كثافة المساحة البلازما المحددة. فمن المهم لتحديد تفضيلي المناطق مشرق من البلازما بسبب عوامل داخل الدم لن تؤدي إلا لسبب والتقليل من مستويات مضان البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جدول بيانات Microsoft Excel بإدخال القيم لحساب GSC حيث: </li></ol><img alt="الشكل 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تمثل الخطوات تسليط الضوء هنا ما نشعر به لتكون تلك التي من شأنها أن تنتج قيم نفاذية متسقة ودقيقة لأنها تحايل على المزالق التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نثر: إن استخدام fluorophores ينبعث منها الأحمر يسمح لجمع أكثر كفاءة من الضوء منذ الفوتونات ال?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

أمراض الكلى التي تنطوي على فقدان البول من الجزيئات الأساسية الكبيرة، مثل ألبومين المصل، منذ فترة طويلة يعتقد أن سببها تغييرات في حاجز نفاذية تتألف من podocytes، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والغشاء القاعدي تعمل في انسجام تام. وكشفت بيانات من مختبرنا باستخدام المجهر حيوي داخلي 2 الفوتون أكثر نفاذية كبيبي حاجز الترشيح (GFB) مما كان يعتقد سابقا في ظل ظروف الفسيولوجية، مع استرجاع تصفيتها الزلال التي تحدث في وقت مبكر فرعية من الخلايا تسمى الخلايا نبيب الداني (PTC) 1،2، 3. التقنيات السابقة تستخدم لدراسة الترشيح الكلوي وإنشاء سمة من حاجز الترشيح تشارك بزل مجهري من تجويف أنبوبي هذه القطاعات في وقت مبكر مع عينة من المحتوى وتحليل السائل 4. تحدد هذه الدراسات تركيز الألبومين في السائل اللمعية أن تكون شبه معدومة؛ المقابلة عن كثبلماذا يتم الكشف عادة في البول. ومع ذلك، وتوصيف البوليمرات ديكستران مع الأحجام التي تحددها هذه التقنية كشفت تلك ذات حجم مماثل لألبومين المصل لديهم مستويات أعلى في التجويف الأنبوبي والبول؛ مما يوحي زيادة نفاذية 5. وهنا هو مخطط تفصيلي للتقنية المستخدمة لتصور مباشرة وقياس نفاذية كبيبي الألبومين الفلورسنت في الجسم الحي. هذا الأسلوب يسمح للكشف عن ألبومين تصفيتها عبر حاجز الترشيح في الفضاء بومان (الغرفة الأولي من الترشيح البولية)، وأيضا يسمح الكمي لاستيعاب الزلال بواسطة الأنابيب القريبة والتخيل من transcytosis الزلال اللاحقة 6. غياب الفلورسنت الألبومين في وقت لاحق على طول قطاعات أنبوبي في طريقها إلى المثانة يسلط الضوء على كفاءة مسار استرجاع في قطاعات نبيب الداني في وقت سابق. وعلاوة على ذلك، عندما تم تطبيق هذه التقنية لتحديد نفاذيةمن تم الإبلاغ عن dextrans وجود حجم مماثل لالزلال القيم نفاذية مطابقة تقريبا 2. هذه الملاحظات دعم مباشرة على الحاجة إلى توسيع تركيز العديد من الأمراض الكلوية بروتيني البيلة إلى التعديلات المدرجة في القريب أنبوب صغير استصلاح الخلية.

ويبين الشكل 3 مثالا لصورة مأخوذة من الكبيبة سطح ميونيخ يستار الفئران Frömter والخطوات المتخذة لتحديد نفاذية الفلورسنت الزلال. قيمة GSC لالزلال من 0.0111 المشتق من هذا الخريف الكبيبة الفردية ضمن نطاق ينظر في هذه السلالة من ميونخ فئران ويستار عندما تكون في حالة بنك ا...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats at JoVE.com

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

وهناك تقنية عالية الدقة باستخدام المجهر intavital 2 الفوتون لتصور مباشرة وتحديد الترشيح gloemrular في الكبيبات السطح. هذا الأسلوب يسمح للتقرير مباشرة من خصائص نفاذية الجزيئات في الدول على حد سواء طبيعية والمريضة.

قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Views.  Indiana University School of Medicine. وهناك تقنية عالية الدقة باستخدام المجهر intavital 2 الفوتون لتصور مباشرة وتحديد الترشيح gloemrular في الكبيبات السطح. هذا الأسلوب يسمح للتقرير مباشرة من خصائص نفاذية الجزيئات في الدول على حد سواء طبيعية والمريضة.

Video: Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

إينترافيتال المجهري لاستخدام المفرج المرتبطة بورم متقدم الظهرية Skinfold الدوائر النافذة في الفئران المعدلة وراثيا نيون

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

A طريقة لقياس أداء الطرف العلوي في الحياة اليومية عن طريق التسارع

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

في فيفو تحليل شكلي لاعصاب البشرية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في سويندل للمرض آذان وآذان السمع العادي

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

تقييم لوظيفة الكلي في نماذج الماوس من المرض الكبيبي

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

قياس معدل الترشيح الكبيبي في الفئران عبر الجلد

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

قياس حساس للغاية من نفاذية الكبيبي في الفئران مع الفلورسيين إيزوثيوسيانات-بوليسوكروز 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

تلطيخ التألق المناعي بالكامل ، والتصوير البؤري وإعادة البناء 3D للعقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية في الماوس

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

عزل وثقافة البلاعم القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

تحليل تسجيلات تخطيط كهربية القلب على المدى الطويل للكشف عن عدم انتظام ضربات القلب في الفئران

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...