أشكر الدكتور جيسيكا دومينغيز Rieg لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (عالم التنمية المنحة 10SDG2610034)، وكارل جورج جوتشالك بحوث المنح للجمعية الأمريكية لأمراض الكلى، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى مركز أوبراين للأبحاث إصابة الكلى الحاد ( P30DK079337)، وزارة شؤون المحاربين القدامى.

1. حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.85٪ كلوريد الصوديوم: 8.5 غرام كلوريد الصوديوم / 1 لتر [ده 2 O (8.5 جم / لتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مول / لتر HEPES 7.4 درجة الحموضة (حل 59.6 غرام من HEPES في 0.5 L من ده 2 0 وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 N). </li></ol> 2. إعداد FITC-حبوب حقن الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن FITC-حبوب لإعداد محلول 5٪ وتذوب في 0.85٪ كلوريد الصوديوم (عادة 100 ملغ / 2 مل 0.85٪ كلوريد الصوديوم) عن طريق التسخين إلى 90 درجة مئوية حتى يذوب تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن حل حل FITC-حبوب وملاحظة الوزن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 20 سم قطعة من غشاء غسيل الكلى (الوزن الجزيئي قطع: 1،000) ووضعها في DDH 2 O لمدة 30 دقيقة لإزالة نان المتبقية 3 من الغشاء وطرد عدة مرات بعد ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حل FITC-حبوب في غشاء غسيل الكلى وختم صحيح مع الإغلاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن كامل غشاء غسيل الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غشاء غسيل الكلى في 1 L محلول كلوريد الصوديوم 0.85٪ ويحرك ببطء محمية ضوء لمدة 24 ساعة عند ريال عمانيدرجة الحرارة ام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن كامل غشاء غسيل الكلى مرة أخرى وحساب تركيز جديد (سوف تتحرك المياه osmotically في غشاء وFITC غير منضم، أو ملزمة FITC-حبوب &lt;1،000 الوزن الجزيئي والخروج من الغشاء، وبالتالي، فإن تركيز حبوب FITC-يقلل إلى حد كبير) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حساب تركيز FITC-حبوب جديدة (ج) باستخدام الصيغة التالية: C = N / V، حيث n = كمية FITC-حبوب الأولي، V = حجم جديد (الفرق في الوزن من أنابيب غسيل الكلى قبل وبعد غسيل الكلى بالإضافة إلى حجم الأولي حل FITC-سكري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام تعقيم مدال حل FITC-حبوب عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على FITC-حبوب محمية من الضوء (رقائق الألومنيوم) في 4 درجات مئوية. مدال وتعقيمها FITC-حبوب يمكن استخدامه لمدة تصل الى 2 أسابيع. شارك FITC-حبوب يمكن حله من خلال إعادة التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. </li></ol> ملاحظة: في حالة استخدامFITC-sinistrin 16-18، والتي لا تتطلب غسيل الكلى، وجميع الخطوات اللازمة لغسيل الكلى يمكن تخطي. 3. حقن وجمع الدم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ وزن الجسم (وزن الجسم) من الفئران قبل التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران لفترة وجيزة مع isoflurane و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعالية الإنتاجية من 6 الفئران يرجى اتباع البروتوكول تنص في الشكل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 2 ميكرولتر / ز من وزن الجسم من مدال FITC-حبوب في الضفيرة retroorbital 24 باستخدام ½ G30 في إبرة (إزالة فقاعات الهواء من 100 ميكرولتر حقنة هاميلتون بواسطة الأول باستخدام ½ G26 في إبرة ومن ثم التحول إلى ½ G30 في إبرة لل حقن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 1 ملم من ذيل الفأر مع مقص مرة واحدة وجمع الدم في 3، 5، 7، 10، 15، 35، 56 و 75 دقيقة بعد الحقن في نا الهيبارين minicapillaries. ختم minicapillaries بعد جمع الدم مع تشا الختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتفاظ بعينات محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مختومة minicapillaries داخل أمراض الدمالحرجة الشعيرات الدموية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر minicapillaries باستخدام قطع الماس ونقل البلازما كامل من قبل pipetting في أنبوب مل 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تخفيف 01:10 باستخدام 2 ميكرولتر من البلازما و 18 ميكرولتر 0.5 مول / لتر HEPES (7.4 درجة الحموضة) في أنبوب 0.2 مل جديدة (يمكن تخزين العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمدة قياسات مضان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 2 ميكرولتر من العينة المخففة مع معمل NanoDrop 3300 في التكرارات. وصفت وصف واستخدام الصك هنا 5. </li></ol> 4. إعداد معايير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم من الفئران من سلالة الخلفية نفسه في الهيبارين المغلفة الهيماتوكريت الشعيرات الدموية، وتدور باستمرار وتمييع 01:10 مع 0.5 مول / لتر HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4)، وعادة 80 ميكرولتر بلازما + 720 HEPES ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل حقن FITC-حبوب مع البلازما الماوس المخفف للحصول على التخفيفات القياسية التالية: 01:10: 10 ميكرولتر مخفف حل FITC-حبوب + 90 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:100: 10 &amp; مو، L (1:10) حل + 90 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:1،000: 10 ميكرولتر (1:100) حل + 90 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:2،000: 30 ميكرولتر (1:1) حل + 30 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:10،000: 10 ميكرولتر (1:5) حل + 40 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:20،000: 20 ميكرولتر (1:1) حل + 20 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:100،000: 10 ميكرولتر (1:5) حل + 40 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف سوف تركيز المعايير تعتمد على غسيل الكلى، وسوف تكون دائما مختلفة لكل إعداد FITC-حبوب. فمن الضروري لدخول تركيز لمنحنى معيار جديد في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات لحساب GFR مع البرامج المناسبة (على سبيل المثال بريزم GraphPad) باستخدام دالة الاضمحلال الأسي على مرحلتين كما هو موضح في هنا 15 و 20 و هو مبين في القسم ممثل النتائج. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

المؤلف تلقت تمويلا لتغطية تكاليف هذا المنشور من قبل الحرارية فيشر العلمية.

يصف هذه الدراسة تقنية لتحديد GFR في الفئران واعية من قبل حقن بلعة واحد وتحليل مضان في 8 عينات الدم عن طريق مرحلتين الاضمحلال الأسي. A قياس GFR في 1 الفأر يأخذ 75 دقيقة. باستخدام الخاصة لوحة المجريات، فمن الممكن لقياس GFR من 6 الفئران في 130 دقيقة. فمن الممكن أن يكرر هذا البروتوكول تدفق الرسم البياني يصل إلى 4 مرات في اليوم الواحد وقياس GFR في 24 الفئران. نحن تعديل هذه الطريقة حتى أنه من الممكن لجمع الدم من قص ذيل صغير بدلا من ذيل ثقب الوريد، والتي هي أسرع وأسهل للمحققين لإجراء مقارنة مع ذيل ثقب الوريد. باستخدام 10 ميكرولتر الهيماتوكريت الشعيرات الدموية والتخفيف 01:10، فمن الممكن للحد من المبلغ الإجمالي من الدم اللازم ل&lt;100 ميكرولتر. وأخيرا، يتم قياس مضان باستخدام معمل NanoDrop 3300 fluorospectrometer، الذي يسمح بتحديد مضان في 1-2 ميكرولتر من العينة المخففة. وهذه الطريقة سوف تعطي محقق المهتمةصحيح را قيمة GFR. في المقابل، قياسات الكرياتينين في الفئران لديها العديد من نقاط الضعف بما في ذلك &quot;مجموعة أعمى الكرياتينين&quot; والصعوبات المتعلقة بتحديد محددة وحساسة. في &quot;مجموعة أعمى الكرياتينين&quot; حدود وظيفتها كعلامة للGFR بسبب مصل الكرياتينين يبقى في المعدل الطبيعي حتى يتم فقدان 50٪ من وظيفة الكلى 19. منذ عدة محققين استخدام الفئران المعدلة وراثيا في أبحاثهم لدراسة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية الكلوية، وهذا يحمل المشكلة التالية: وعلى افتراض ماوس خروج المغلوب من الجينات X لديها GFR أقل من ذلك بكثير (بنسبة 40٪) مقارنة مع الماوس من النوع البري، وهو وفحص بسيط بمقارنة البلازما الكرياتينين لا يكشف هذا الاختلاف. الحاجة إلى وجود طريقة دقيقة جيدة من GFR تقرير يصبح أكثر أهمية أصغر الفوارق في GFR تصبح. الفئران لديهم تركيزات عالية من chromagens غير الكرياتينين في البلازما والبول التي تتداخل مع تجارياالمقايسات الكرياتينين المتاحة. ونتيجة لذلك، المقايسات التي تستند إلى جافيه تتجمع القلوية رد الفعل المبالغة تركيز الكرياتينين في البلازما مقارنة مع عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) تحديد 6 و 13. الحد الآخر هو أن الكرياتينين في مصل الدم هو أقل من حدود الكشف عن عدة فحوصات متوفرة تجاريا مقارنة HPLC تقرير. ومع ذلك، باستخدام التفاعلات الإنزيمية المحققين تمكنوا من تحديد البلازما الكرياتينين في الفئران 10، 22. تم العثور على GFR في مجموعة مشابهة في الفئران واعية باستخدام أسلوب حقن بلعة واحدة قابلة للمقارنة وكذلك البولية التخليص FITC-حبوب 14. وعلى النقيض من البروتوكول، وبروتوكول لدينا باستخدام قص ذيل لا يتطلب احتياطات خاصة للحفاظ على سلامة السفينة بالمقارنة مع الوريد الصافن الذيل أو ثقب الوريد. عن التخليص البولية / بلازما استنادا FITC-حبوب فمن الضروري لزرع جراحيا اثنين ميل ناضحnipumps. مضختين ضرورية لتحقيق عالية بما فيه الكفاية الحالة المستقرة البلازما تركيزات FITC-حبوب التي يمكن تمييزها بوضوح من الخلفية. وهذا يتطلب أيضا استخدام الأقفاص الأيضية لجمع البول الكامل وتوقيتها. تحتاج الأقفاص إلى أن تشطف لحساب خسارة من 25-37٪ من FITC-حبوب، والذي يحدث خلاف ذلك دون الشطف. مطبات باستخدام هذا الأسلوب FITC-حبوب محدودة. ينبغي للمحققين أن تكون على علم بما يلي: (ط) أؤكد أنه لا توجد فقاعات الهواء في الحقنة المستخدمة للحقن للحل FITC، يجب أن يتحقق (II) الحقن خلف المقلة كاملة لأن كمية حقن يحدد GFR محسوب، و ( III) الفئران فإن معظم التبول المرجح خلال دقيقة التجربة GFR 75، لذا تجنب تلويث عينات الدم مع البول، والتي سيكون لها تركيز FITC-حبوب عالية جدا نتيجة لقدرة تركيز الكلى. مزايا عامة سو هذا الأسلوب FITC-حبوب تتضمن ما يلي: (ط) وهي تقنية غير المشعة، (الثاني) أنه من الممكن تكرار القياسات عدة مرات في نفس الماوس، (الثالث) الفحص لا يمكن أن يؤديها في الفئران واعية، ( رابعا) لا يلزم جمع البول، و(V) خيار الإنتاجية العالية يمكن استخدامها. وتشمل مساوئ لحقن بلعة واحد الحاجة لغسيل الكلى من FITC-حبوب، والتي يمكن التغلب عليها باستخدام أفضل FITC-علامة، FITC-sinistrin، والذي يتوفر الآن، ويمكن أن يقاس transcutaneously باستخدام جهاز المنمنمة الخاصة 18. على الرغم من GFR يقاس، فمن غير الممكن قياس إفرازات كسور من السوائل أو الأيونات مع هذا الأسلوب. أخذت معا، ويوفر هذا الأسلوب جدوى أسلوب الإنتاجية العالية لقياس GFR في الفئران واعية. وبالتالي، هذه التقنية قد تكون ذات فائدة للمحققين آخرين يرغبون في تحديد وظيفة الكلى في الفئران.

أصبح معدل تشكيل البلازما رشاحة مستدقة في الكبيبة أساس لتقييم وظائف الكلى (معدل الترشيح الكبيبي، GFR). علامة مثالية لتحديد GFR ينبغي تصفيتها بحرية، لا يفرز أو استيعابها وليس استقلابه. تم العثور على مثل هذا السلوك أن يكون صحيحا لحبوب، وأصبحت إزالة حبوب معيار الذهب لتحديد GFR 3. في حين يتم استخدام إزالة الكرياتينين على نطاق واسع كمقياس للGFR في البشر والحيوانات، والكرياتينين لا يلبي متطلبات من GFR علامة مثالية. حوالي 10 - 40٪ من تصفية الكرياتينين في البشر هو نتيجة لإفراز أنبوبي بالموقع 1، 11، وإفراز الكلوي من الكرياتينين هو أيضا بارزة في الفئران والجرذان 4، 7، 9، 22. ومن المعروف الكلى اختلال وظيفي لزيادة إفراز أنبوبي من الكرياتينين مما يحد من قيمتها كعلامة من GFR 1، 2. لقد أظهرنا سابقا أن العضوية أنيون الإسوي نقل3 (OAT3) يسهم في إفراز الفئران الكرياتينين كلوي 22. ومع ذلك، وإزالة حبوب يتطلب عادة استخدام المشعة صفت حبوب (3 H أو 14 C). تحديد المشعة من حبوب يمكن استخدامه في كل من الفئران تخدير واعية، ولكن تؤوي مساوئ عديدة لوائح السلامة والتعامل مع قضايا صارمة متأصلة مع استخدام النظائر المشعة. على طول تلك الخطوط، والأعمال التحضيرية إزالة الجراحية لتحديد GFR هي مضيعة للوقت وكذلك محطة في الطبيعة. في عام 1999 لورينز وآخرون. 12 قدم FITC-حبوب كعلامة من واحد كليون GFR في تخدير الفئران. خمس سنوات بعد الانعقاد تشى وآخرون. 15 تحديد كامل GFR الكلى في الفئران واعية باستخدام FITC-حبوب. بروتوكولات بديلة تستخدم الآن FITC-حبوب باعتباره علامة خارجية لقياس GFR في الفئران واعية وتخدير. هذه البروتوكولات الإبقاء على حساسية حبوب المشعة باستخدام مضان detectiعلى التحايل وعيوب العمل مع علامة مشعة المسمى. تم تعديل مقايسة FITC-حبوب من قبل الآخرين 7 و 8 و لنا 22 و 23 للاستفادة من القدرة microvolume من معمل NanoDrop 3300 fluorospectrometer. وهذا يسمح تخفيض مجموع حجم العينة المطلوبة ل&lt;100 ميكرولتر من الدم في قياس GFR. مع أسلوب وبروتوكول الإنتاجية العالية المقدمة في هذا المنشور، ونحن لشرح جدوى قياس GFR في ما يصل الى 24 الفئران واعية لكل يوم. هذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة للمحققين آخرين يدرسون GFR الفئران، ونحن نأمل أن تحل محل أساليب أقل دقة مؤشرين لوظائف الكلى، مثل الكرياتينين واليوريا والنيتروجين في الدم.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو معيار الذهب في تقييم وظائف الكلى. حاليا، محققين تحديد GFR عن طريق قياس مستوى الكرياتينين العلامات البيولوجية الذاتية أو خارجيا التطبيقية المشعة صفت حبوب (3 H أو 14 C). الكرياتينين لديه عيب كبير أن الداني حسابات إفراز أنبوبي ل~ 50٪ من إجمالي إفراز الكرياتينين الكرياتينين كلوي وبالتالي ليس GFR علامة موثوق بها. اعتمادا على تجربة أداء، يمكن تحديد إزالة حبوب عن طريق حقن بلعة واحدة في الوريد أو التسريب المستمر (minipump في الوريد أو ناضح). كلا النهجين يتطلب جمع البلازما أو البلازما والبول، على التوالي. وتشمل العوائق الأخرى المشعة حبوب صفت استخدام النظائر، مضيعة للوقت إعداد الجراحية للحيوانات، واشتراط وجود تجربة محطة. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يستخدم حقن بلعة واحدة منفلوريسئين ثيوسيانات-(FITC) حبوب وصفت وقياس مضان في 1-2 ميكرولتر من البلازما المخفف. عن طريق تطبيق نموذج اثنين من المقصورة، مع 8 مجموعات الدم في الماوس، فمن الممكن لقياس GFR في ما يصل الى 24 فئران لكل يوم باستخدام بروتوكول تدفق العمل الخاص. هذا الأسلوب يتطلب سوى تخدير isoflurane وجيزة مع جميع عينات الدم التي يتم جمعها في الماوس غير مقيدة ومستيقظا. ميزة أخرى هي أنه من الممكن لمتابعة الفئران على مدى فترة من عدة أشهر والعلاجات (أي القيام بتجارب إرفاقها مع التغييرات الغذائية أو التطبيقات المخدرات). نأمل أن هذا الأسلوب من قياس GFR هو مفيد للمحققين الأخرى دراسة وظائف الكلى الماوس وسوف تحل محل أساليب أقل دقة من تقدير وظائف الكلى، مثل البلازما الكرياتينين واليوريا والنيتروجين في الدم.

وسيتم احتساب GFR باستخدام الصيغة التالية: GFR = ن / (A/K1 + B/K2)، حيث ن = كمية حقن (ن = ج • V، حيث C = FITC-حبوب التركيز، V = حجم حقن) A = Span1، التقاطع y القضاء K1 = الاضمحلال المستمر للقضاء B = Span2، التقاطع y التوزيع K2 = الاضمحلال المستمر للتوزيع ملاحظة: A، K1، K2 وB هي الاختصارات التي قدمها GraphPad بريزم، كل برنامج قادر على تحليل مرحلتين الاضمحلال الأسي يمكن استخدامها، ومع ذلك، قد البرامج العلمية الأخرى تستخدم الاختصارات المختلفة. من خلال توظيف مرحلتين الأسي الاضمحلال تناسب منحنى، والتي تقوم على تركيزات البلازما FITC-حبوب، منحنى مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 1 ينبغي الحصول عليها. حساب GFR بواسطة الصيغة أعلاه هو مبين (وكما هو موضح في هنا &lt;سوب&gt; 20) يتيح للكشف عن الضعف في وظائف الكلى أو 15 hyperfiltration الكبيبي 8، 23 كما هو موجود في الفئران مع نوع 1 داء السكري (الشكل 2). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> الشكل 1. لقياس GFR في الفئران واعية، ويتم استخدام البلازما حركية FITC-حبوب بعد الحقن في الوريد بجرعة واحدة. لحساب GFR، ويستخدم نموذج اثنين من المقصورة. في النموذج ثنائي مقصورة، مرحلة الاضمحلال السريع الأولي يمثل إعادة توزيع FITC-حبوب من مقصورة داخل الأوعية الدموية إلى السائل خارج الخلية. في مرحلة لاحقة، مع الاضمحلال أبطأ في تركيز FITC-حبوب، يعكس في الغالب إزالة نظامية من البلازما. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> الشكل 2. Detectioن من hyperfiltration السكري في الفئران من النوع البري. النوع الأول وكان المستحث داء السكري من خلال تطبيق داخل الصفاق من بالستربتوزوتوسين (STZ، 50 ملغ / كغ لمدة 5 أيام متتالية). تم تحديد GFR بعد قبل (القاعدية) و 5 أسابيع تحريض السكري. ونظرا لردود الفعل tubuloglomerular، زيادة الابتدائية في استيعاب الداني في وقت مبكر يسبب السكري hyperfiltration 21 وهو الاكتشاف الذي هو استنساخه في الفئران البرية من نوع (ن = 10، P &lt;0.01 مقابل نفس الماوس القاعدية). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> الشكل (3). مخطط بياني لقياس GFR في مجموعة من 6 الفئران. لقياس كله الكلى GFR من خلال طريقة واحدة حقن بلعة، يجب جمع 8 عينات الدم في 3، 5، 7، 10، 15، 35، 56 و 75 دقيقة بعد FITC-حبوب الحقن. تشير الأرقام إلى نقاط زمنية. أرقام بين قوسين تشير إلى عدد عينة. نقاط الوقت المتبقي من الخط الأحمر العمودي تشير حقننقاط زمنية (في 0، 11، 22، 33، 44 و 55 دقيقة). ويتميز كل الفأر مع لون مختلف. للحصول على مجموعات الدم متتابعة اتبع السهام. مربعات رمادي إشارة عندما يجب أن يكون مستعدا الماوس المقبل للتخدير isoflurane وقبل الحقن. باستخدام هذا البروتوكول الحد الأدنى من الوقت بين 2 مجموعات الدم من الفئران مختلفة هي 1 دقيقة.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو المعيار الذهبي لتقييم وظائف الكلى. هنا نحن تصف طريقة الإنتاجية العالية التي تسمح بتحديد GFR في الفئران واعية باستخدام حقنة واحدة بلعة، وتحديد فلوريسئين ثيوسيانات (FITC)، حبوب في البلازما وحساب GFR بواسطة نموذج الاضمحلال الأسي على مرحلتين.

وهناك طريقة عالية الإنتاجية لقياس معدل الترشيح الكبيبي في الفئران وإدراكا

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

a-high-throughput-method-for-measurement-glomerular-filtration-rate

Research

JoVE Journal

Biology

43.1K Views.  University of California, San Diego. قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو المعيار الذهبي لتقييم وظائف الكلى. هنا نحن تصف طريقة الإنتاجية العالية التي تسمح بتحديد GFR في الفئران واعية باستخدام حقنة واحدة بلعة، وتحديد فلوريسئين ثيوسيانات (FITC)، حبوب في البلازما وحساب GFR بواسطة نموذج الاضمحلال الأسي على مرح...

Video: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

سريع سرعة عالية طريقة لرسم الخرائط Ribonucleoproteins (RNPs) على مرنا ما قبل الإنسان

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

عالية الإنتاجية قياس وتصنيف ف العضوية في العينات البيئية

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

الايس كاب : منهج في تزايد Arabidopsis الطماطم والنباتات في لوحات 96 - جيدا لالرفيع المناولة التنميط الجيني

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

علم وظائف الأعضاء مختبر مظاهرة: معدل الترشيح الكبيبي في الجرذ

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Speed

Subtitles

وهناك طريقة عالية الإنتاجية لقياس معدل الترشيح الكبيبي في الفئران وإدراكا