أفادت الأبحاث في هذا المنشور كان مدعوما من المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة القومية تحت رقم R01CA174385 جائزة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. الكواشف إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد RPMI-PLGH عن طريق خلط 500 مل RPMI-1640 و 5 مل الستربتوميسين، كل من البنسلين، L-الجلوتامين، والحل HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد R10 حل عن طريق خلط RPMI-PLGH مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS). وFBS المعطل للحرارة بنسبة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الإضافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة في 37 ° C 50 مل من RPMI-PLGH، 15 مل من برنامج تلفزيوني، و 15 مل من R10 في أنابيب مخروطية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وملفقة باستخدام السيليكون سيد ضوئيه أساسا كما هو موضح سابقا (10): تلفيق صفائف nanowells في PDMS. مزيج دقيق من عدة الاستومر Sylgard 184 قاعدة وكيل علاج في نسبة الوزن في فنجان 10:01 القابل للتصرف باستخدام سكين من البلاستيك. ديغا الخليط في فراغ الغرفة لمدة 1 ساعة. صب الخليط على مجموعة nanowell، ختم مع شريحة زجاجية والسماح لها الجلوس لمدة 30 دقيقة. نقل الجمعية إلى تعيين الفرن إلى 80 ° C لمدة 2 ساعة والسماح لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. ستقوم الاستومر الحاليه خلال هذه الفترة والإرادة السندات إلى شريحة زجاجية. رفع بعناية شريحة زجاجية تحتوي على مجموعة من nanowell PDMS سيد السيليكون، مع تغطية لاصق شفاف وتخزينها حتى استخدامها في المستقبل. </li></ol> 2. الهدف الخليوي (T) وصفها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا المستهدفة 5 ملايين من زراعة الخلايا باستخدام عدادة الكريات وبيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة بواسطة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 5 دقائق. يتم تقسيم خلية ثقافة في اليوم السابق في حجم 5 مل الإجمالي (الكثافة = 1 مليون / مل) ومثقف في T-25 قارورة (VWR). وقد وصفت بروتوكولات لفرز الخلايا باستخدام عدادة الكريات بالتفصيل سابقا 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الزائدة تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل عمل خلية المقتفي الأحمر (CTR) عن طريق خلط 0،5 ميكرولتر الأسهم CTR (1 ملي) إلى 150 ميكرولتر RPMI-PLGH (تركيز النهائي 2.5 ميكرومتر). إضافة 150 ميكرولتر من محلول العمل إلى الخلايا المستهدفة ومزيج دقيق باستخدام ماصة P200.بالتناوب، يمكن استخدام PKH 26 (تركيز النهائي من 2 ميكرومتر) تسمية الخلايا المستهدفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 20 دقيقة. </li></ol> 3. المستجيب وصفها الخليوي (E) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا المستجيب 5000000 من زراعة الخلايا باستخدام عدادة الكريات وبيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة بواسطة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الزائدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل حل Vybrant عمل اللطخة DyeCycleViolet عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من 5 ملي الأسهم البنفسج Vybrant إلى 1 مل من وسائل الإعلام R10 (تركيز النهائي من 5 ميكرومتر). إضافة الحل تعمل على الخلايا و resuspend باستخدام ماصة P200. بالتناوب، يمكن استخدام PKH 67 (تركيز النهائي من 2 ميكرومتر) تسمية الخلايا المستهدفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إذا تم استخدام PKH 67، فإنه لا ينبغي أن تستخدم SYTOX الأخضر لأنها في نفس القناة مضان. ويتم تعداد أهداف أفكارك باستخدام حصرا AnnexinV تلطيخ في هذه الحالة. ملاحظة: إذا يؤدون الوقت الفاصل بين نقطة النهاية وقياسات لا، وينبغي تجنب مثل الأصباغ UV البنفسج Vybrant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 20 دقيقة. </li></ol> 4. فصل الخلايا الحية والميتة باستخدام التدرج الكثافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6.8 مل و 6.0 مل من RPMI-PLGH إلى الهدف والخلايا المستجيب على التوالي وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة 3،5 مل من FICOLL-Plus لPaque أسفل كل أنبوب مخروطي يحتوي على الهدف والخلايا المستجيب. طبقة FICOLL ببطء لضمان تشكيل جيد للطبقات بين FICOLL وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي على حد سواء في 340 XG أنابيب لمدة 30 دقيقة. مع عدم وجود الفرامل والتسارع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الطرد المركزي، ونقل 7 مل من قبل تحسنت PBS إلى لوحة 4-أيضا. إعداد مجموعة nanowell (ملفقة في PDMS): الجزء السفلي من شريحة زجاجية نظيفة مع الإيثانول وأكسدة PDMS في وضع RF عالية باستخدام البلازما مؤكسد لمدة 1 دقيقة. هذه الخطوة سوف مسكrilize مجموعة nanowell حين جعل أيضا PDMS ماء. نقل على الفور إلى مجموعة nanowell لوحة تحتوي على برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية ونضح PBS الزائدة. جعل 10 مل أجار النبيلة 1٪ بإضافة 100 ملغ مسحوق أجار إلى 10 مل ماء ثم DI الميكروويف لمدة 30-45 ثانية من. تطبيق الحارة أجار النبيلة 1٪ على الحافة العلوية والسفلية من الشرائح الزجاجية التي تحتوي على مجموعة nanowell لشل حركة مجموعة وانتظر 10 دقيقة لأجار لترسيخ. إضافة 3 مل PBS وأجار الزائدة الرشفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل من R10 على الجزء العلوي من مجموعة nanowell والسماح لها لتتوازن 10 دقيقة ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي FICOLL، نضح 5 مل من وسائل الاعلام الطبقة العليا من كل أنبوب. يجب الحرص على عدم نضح الطبقة التي تحتوي على الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا (الطبقة البيضاء) من خلال استعادة مل 1-2 من الطبقة بين FICOLL وسائل الإعلام مع P1، 000 ماصة والانتقال إلى أنابيب جديدة المخروطية العقيمة. كرر هذا لهاتين المجموعتين من الخلايا في حين التأكد من أن مكسيمإيزي الخلايا الانتعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من قبل تحسنت RPMI-PLGH إلى كل المزيج، بواسطة أنبوب pipetting وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 5 دقائق على تسريع كامل والفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الزائدة، إضافة 5 مل من قبل تحسنت RPMI-PLGH لكل أنبوب الطرد المركزي وتكرار في 340 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الزائدة و resuspend بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من R10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا الحية باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات. </li></ol> 5. تحميل خلية على صفيف Nanowell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الزائدة من مجموعة nanowell وإضافة 2 مل من R10 جديدة عبر الصفيف. نضح مرة أخرى مع التأكد من الجزء العلوي من مجموعة nanowell ليس رطبة جدا / الجافة لأنها سوف تؤثر على توزيع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع 1 × 10 5 خلايا المستجيب في 200 ميكرولتر من R10 على سطح مجموعة nanowell (الكثافة = 5 × 10 5 خلية / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الخلايا تسوية لمدة 5 دقائق وباستخدام زراعة الأنسجة معيار الاختيار المجهر لENالتأكد من أن توزيع الخلايا غير المرغوب فيه. إضافة المزيد من الخلايا إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع 1 × 10 خلايا الهدف 5 في 200 ميكرولتر R10 على سطح مجموعة nanowell (الكثافة = 5 × 10 5 خلية / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الخلايا تسوية لمدة 5 دقائق وباستخدام زراعة الأنسجة معيار الاختيار المجهر للتأكد من أن توزيع الخلايا غير المرغوب فيه. إضافة المزيد من الخلايا إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف nanowell مجموعة بعناية مع 2 مل R10 وسائل الإعلام الزائدة الرشفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3 مل قبل تحسنت R10 في أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة. إضافة 3 ميكرولتر من حمض النووي 0.5mM الأخضر SYTOX اللطخة (تركيز النهائي 0.5 ميكرومتر) و 60 ميكرولتر من Annexin V-اليكسا فلور 647 لإعداد حل العمل. إضافة الحل يعمل على طبق 4-بعناية جيدا مع التأكد من عدم نزوح الخلايا من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة. </li></ol> 6. التصوير 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور من الصفيف nanowell باستخدام ميكر مضانoscope: في هذا المثال، نستخدم المراقب ZEISS Z-1 المجهر مجهزة بمحرك مرحلة وامبدا DG4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهيئة البرمجيات والمجهر وتحقق قوة إشارة على ضوء المنقولة وغيرها من القنوات الفلورسنت. وعموما، ستكون هناك خمس قنوات الموافق: الضوء المرسل، Annexin V-647 (Cy5 فلتر)، CTR (DsRed فلتر)، SYTOX الأخضر (FITC مرشح)، وVybrant البنفسج (دابي فلتر). تأكد من أن المجهر ذلك لضمان إعداد إشارة القصوى للضوضاء مع تجنب التشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين X و Y لموقف مجموعة nanowell. تبدأ العملية من خلال تحديد موقف وتهيئة صفر التركيز على وسط 7 × 7 بلوك مجموعة nanowell على أعلى الزاوية اليسرى من الطابع مجموعة nanowell. تعيين، X Y مواقف ليتزامن مع مركز كل كتلة وذات قيمة Z لتعكس بدقة التركيز على كل كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في موقف والتركيز على كل مجموعة، للتأكد من الحصول على الصور في تحديد النظام الخطي والحصول على صور. <sترونج&gt; ملاحظة: إذا بدوره اللازمة عن حاضنة CO 2 وعلى المجهر على الأقل 30 دقيقة قبل التجربة. </li></ol> 7. بعد التصوير نقل لوحة 4-يحتوي على مجموعة جيدة nanowell في حاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2) لمدة 6 ساعة. 8. التصوير 2 الحصول على الصور في المرة الثانية نقطة كما هو موضح في الخطوة 6. 9. تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد الخلايا الإشغال في nanowells عن طريق استخدام برامج مناسبة تجزئة الصورة (على سبيل المثال يماغيج، <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) أساسا كما هو موضح سابقا 9،12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم لتوليد قاعدة بيانات من nanowells الفردية التي تحتوي على خلية واحدة بالضبط الهدف الحية (التي تم تحديدها؛ تحليل مجموعة أولية من الصور المجهر (T 0 ر = 0 ساعة)من CellTracker الأحمر؛ الأحمر) وليس الخلايا الميتة (التي حددتها تلطيخ V Annexin والأخضر) [T1t 0 nanowells]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم لتحديد قاعدة بيانات مستقلة الثاني من nanowells تحتوي على 1 الخلية المستهدفة (أحمر) [6 T1t nanowells]؛ تحليل المجموعة الثانية من الصور المجهر (ر 6 طن = 6 ساعة). ويتم تنفيذ التحقق من تكامل (استعلام قاعدة البيانات) لضمان مطابقة جميع الأهداف المباشرة في ر 0 إلى الأهداف عند ر 6 إلى وضع مجموعة من الأهداف النهائية المتطابقة (كما نفذت nanowells التي لديها T1t 0 = T1t 6، تسمى T1match) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد عدد الخلايا المستجيب في nanowells باستخدام Vybrant تلطيخ البنفسج في ر 0 [E1 nanowells] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تنفيذ استعلام قاعدة بيانات لتحديد nanowells التي تحتوي على واحد المستجيبات شارك في المحتضنة مع أهداف واحدة (كما هو محدد nanowells التي لديها مباراة وE1 T1، على النحو المحدد E1T1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسجل المستجيب الخلايا الناجم عن ط<html> dentifying الأهداف التي Annexin V السلبية في ر 0 و V Annexin إيجابية في تي 4 (E1T1 مع تلطيخ Annexin الهدف الخامس في ر 6). </li></ol> 10. اختياري الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام القتل من نيكون BioStation IM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ طبق بيتري مع ساترة أسفل وقطع قطعة صغيرة من رقاقة مجموعة nanowell (أعدت في الخطوة 5) التي تناسب تماما على ساترة. تأكد من أن يبقى رقاقة الرطب بينما القطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 1 × 10 6 أهداف و 1 × 10 6 خلايا T في 100 ميكرولتر وسائل الإعلام، وماصة وضعها على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح حوالي 15-30 دقيقة للسماح للخلايا تسوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس بسرعة مجموعة صغيرة nanowell رقاقة ووضعه على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ضمان أن رقاقة لن تكون قادرة على التحرك خلال مكان، والتصوير واحد أو اثنين X 20MM 20MM coverslips على الجزء العلوي من الشريحة. الضغط برفق لدفع الشريحة إلى الجزء السفلي من الطبق. </li></ol>خيمة &quot;&gt; ملاحظة: أسفل رقاقة مجموعة nanowell هو سميكة جدا لعالية الدقة التصوير، وبالتالي أن انقلب رأسا على عقب خلال ذلك، يتم غسلها العديد من الخلايا من حيث أن هذه لا يمكن أن تكون السيطرة عليها بسهولة، وأرقام الخلية في الخطوة 9.2.. وفترة حضانة في الخطوة 9.3 يجب أن تكون الأمثل.

<ol>
	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد أوجزنا بروتوكول لفحص وحيدة الخلية الإنتاجية العالية عن طريق تمكين لحل الخلايا الحضانة المشتركة للالمستجيبات والأهداف في صفائف nanowells (الشكل 1). بالإضافة إلى الإنتاجية والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على رصد المستجيب بوساطة السمسة ضد الخلايا اله?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> RPMI-1640 ث / س الجلوتامين L- </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> 10،000 وحدة دولية البنسلين 10000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200 ملي مول الحل </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيغما الدريتش </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S11150 </td><td> الكثير اختبار </td></tr><tr><td> خلية المقتفي الأحمر وصمة عار </td><td> إينفيتروجن </td><td> C34552 </td><td> 50 ميكروغرام </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle البنفسج وصمة عار </td><td> إينفيتروجن </td><td> V35003 </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> SYTOX الحمض النووي الخضراء وصمة عار </td><td> إينفيتروجن </td><td> S7020 </td><td> 5 ملم </td></tr><tr><td> Annexin V-اليكسا فلور 647 </td><td> إينفيتروجن </td><td> A23204 </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Dulbecco في PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> نبيلة أجار </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 غ </td></tr><tr><td> التريبان الأزرق </td><td> سيغما الدريتش </td><td> T8154 </td><td> 0،4٪ السائلة وتصفيتها العقيمة </td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> مشرق خط </td></tr><tr><td> 4-وحة جيدا </td><td> الحرارية فيشر </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick البلازما الأنظف </td><td> Harrick البلازما </td><td> PDC-32G </td><td> البلازما الأنظف الأساسية </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><tد&gt; </td><td> المجهر الفلورسنت (يعمل مع الأجزاء الثلاثة أدناه) </td></tr><tr><td> 10-3 لامدا </td><td> سوتر الصك </td><td></td><td> مرشح تحكم </td></tr><tr><td> امدا DG-4 </td><td> سوتر الصك </td><td></td><td> فائقة السرعة الطول الموجي الجلاد </td></tr><tr><td> هاماماتسو EM-CCD كاميرا </td><td> هاماماتسو </td><td> C9100-13 </td><td> مجهر الكاميرا CCD- </td></tr><tr><td> أنبوب مخروطي 15 مل </td><td> BD الصقر </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> أنبوب مخروطي 50 مل </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> نيكون Biostation </td><td> نيكون الآلات شركة </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> طبق زجاج أسفل الثقافة </td><td> شركة ماتيك </td><td> P35G-0 </td><td> طبق بتري 35 مم، 10 مم microwell </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

يمكن علاج مناعي السرطان تسخير خصوصية الاستجابة المناعية لاستهداف والقضاء على الأورام. وقد أظهرت بالتبني العلاج بالخلايا (ACT) استنادا إلى نقل بالتبني من الخلايا T المعدلة وراثيا للتعبير عن مستقبلات مستضد خيالية (CAR) وعد كبير في التجارب السريرية 1-4. هناك العديد من المزايا لاستخدام الخلايا T + CAR لعلاج السرطان بما في ذلك القدرة على استهداف مستضدات غير مقيد MHC والخلايا T functionalize من أجل البقاء الأمثل، واستمرار صاروخ موجه داخل المضيف، وأخيرا للحث على موت الخلايا المبرمج للCAR + T الخلايا في حالة سمية المضيف 5. ترسيم الوظائف الأمثل للخلايا T + CAR المرتبطة فائدة سريرية أمر ضروري لتصميم الجيل القادم من التجارب السريرية. التطورات الحديثة في مجال التصوير المجهري مثل الحيوانات الحية multiphoton أحدثت ثورة في دراسة وظيفة الخلايا المناعية طن فيفو 6،7. في حين أن هذه الدراسات تقدمت فهمنا للخلية T-ظائف في الجسم الحي، T-ACT خلية مقرها في التجارب السريرية يتطلب الحاجة إلى ربط الميزات الجزيئية والوظيفية للخلية T-الاستعدادات قبل التسريب مع الفعالية السريرية بعد التسريب، من خلال الاستفادة في المقايسات المختبر رصد الخلايا T-ظائف مثل إفراز خلوى السمسة و. وقد وضعت معيار التدفق الخلوي المقايسات تستند إلى تحديد الأداء العام للسكان من الخلايا T على مستوى وحيدة الخلية ولكن هذه ليست مناسبة لرصد وتشكيل المتقارن أعمار أو قدرة الخلية نفسها لقتل أهداف متعددة 8. صفائف Microfabricated مصممة في مثل البوليمرات حيويا polydimethylsiloxane (PDMS) هي وسيلة جذابة بشكل خاص لحصر مكانيا المستجيبات والأهداف في حجم صغير 9. بالاشتراك مع المجهري مضان الآلي الوقت الفاصل بين، ثويمكن رصدها من usands المستجيب المستهدفة التفاعلات في وقت واحد من الآبار الفردية تصوير مجموعة nanowell. نقدم هنا منهجية عالية الإنتاجية لرصد الخلايا T-السمسة بوساطة على مستوى وحيدة الخلية التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسة وظائف الخلايا T لحل الخلايا.

ويتجلى مثال على تطبيق الفحص عالية الإنتاجية لحل الخلايا في الشكل 2. لفترة وجيزة، وصفت CD19 محددة CAR + T والخلايا شارك في المحتضنة مع خلايا فأر المسمى الهدف EL4 في الآبار الفردية للمجموعة nanowell (الأقسام 1-5). تم تسجيل صورة أولية عن المجهر الفلورسنت الآلي لتحديد ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells at JoVE.com

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

نحن وصف وحيدة الخلية الإنتاجية العالية فحص لقياس السمسة من الخلايا T عندما حضنت مع الخلايا المستهدفة الورم. هذا الأسلوب يستخدم مجموعة كثيفة من اللدائن المرنة، من شبه نانولتر الآبار (آبار ~ 100،000 / مجموعة) لحصر الخلايا T مكانيا والخلايا المستهدفة في نسب محددة ويقترن إلى مضان المجهر لمراقبة المستجيب المستهدفة الاقتران وموت الخلايا المبرمج اللاحقة.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  University of Houston. نحن وصف وحيدة الخلية الإنتاجية العالية فحص لقياس السمسة من الخلايا T عندما حضنت مع الخلايا المستهدفة الورم. هذا الأسلوب يستخدم مجموعة كثيفة من اللدائن المرنة، من شبه نانولتر الآبار (آبار ~ 100،000 / مجموعة) لحصر الخلايا T مكانيا والخلايا المستهدفة في نسب محددة ويقتر?...

Video: Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

وظيفية من القوة الذرية مجهر Cantilevers مع خلايا واحدة تي أو الجسيمات واحدة لالمناعية أحادية الخلية قوة مطيافية

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...