يركز بحثنا على تقييم التنوع الوظيفي للخلايا التائية CAR من خلال تغليف الخلايا التائية المستجيب الفردي CAR مع الخلايا المستهدفة لفهم إمكاناتها السامة للخلايا بشكل أفضل على مستوى الخلية الواحدة. فحوصات السمية الخلوية الحالية محدودة لأنها غالبا ما يتم إجراؤها بكميات كبيرة. هذا يتجاهل الاختلافات بين الخلايا التائية الفردية CAR ويفشل في تحديد مجموعات سكانية فرعية متميزة ذات استجابات مختلفة للأهداف.
تتيح تقنيتنا فحوصات قتل الخلايا المتعددة في شكل خلية واحدة باستخدام مقاييس التدفق الخلوي القياسية وأوامر الخلايا. يعطي هذا نتائج أكثر دقة من البروتوكولات المجمعة ، حيث لا يوجد تدخل من الخلايا المجاورة. نأمل أن يسمح لنا هذا النوع من البحث لنا ولعلماء آخرين بفحص التفاصيل الدقيقة لسيارات السيارات لدينا بشكل أفضل وكيفية عملها على مستوى الخلية الواحدة.
للبدء ، قم بتخفيف محاليل المخزون من أصباغ الفلورسنت بنسبة 1: 5 ، 000 في برنامج تلفزيوني من Dulbecco. نقل الخلايا إلى أنابيب منفصلة سعة 15 مل. الطرد المركزي الأنابيب على وزن 300 جرام لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق كريات الخلايا المستجيب في محلول عمل صبغة الفلورسنت البنفسجية. أعد تعليق كريات الخلية المستهدفة في محلول عمل صبغة الفلورسنت الحمراء البعيدة. احتضان الخلايا الملطخة لمدة 20 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا على وزن 300 جرام لمدة خمس دقائق لتكويبها. أعد تعليق كريات الخلية في 15 مل من وسط RPMI 1640 الكامل لغسلها. اغسل وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كريات الخلية المستجيبة في 225 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الكامل وكريات الخلية المستهدفة في 450 ميكرولتر من نفس الوسط. أضف 30 ميكرولترا من وسط التدرج إلى معلقات الخلية المستجيب و 60 ميكرولترا إلى معلقات الخلية المستهدفة. امزج محلول المرق المتوسط المتدرج جيدا قبل سحب العينات.
بعد ذلك ، قم بتخفيف مخزون الركيزة Granzyme B مسبقا بوسيط RPMI 1640 كامل. محلول مخزون يوديد البيريديوم الماصة والركيزة المخففة Granzyme B إلى معلقات الخلية المستجيبة ومعلقات الخلايا المستهدفة. ثم الماصة لخلط المحاليل جيدا.
لتغليف الخلايا ، قم بتسخين خرطوشة التغليف ومحلول التثبيت مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة. أضف محلول تثبيت متوسط RPMI 1640 كامل بنسبة 33٪ للخلايا ومتوسط تدرج بنسبة 10٪. واخلطهم لتحضير مخزون من الوسط الخارجي.
لكل عينة تغليف ، امزج 65 ميكرولترا من تعليق الخلية المستجيب المحضر مع 65 ميكرولترا من تعليق الخلية المستهدفة المحضر في أنبوب سعة 1.5 مل. أعد تعليق الخلايا جيدا باستخدام ماصة. قم بتحميل الآبار المشار إليها لخرطوشة التغليف بكواشف بالترتيب المحدد.
يعلق ريس الخلايا جيدا باستخدام ماصة قبل التحميل مباشرة. أغلق الحشية بعناية على الخرطوشة. انقل الخرطوشة إلى جهاز الموائع الدقيقة ، ثم ابدأ التغليف وفقا لدليل المستخدم.
بعد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة الخرطوشة وحصاد القطرات من البئر D عن طريق تعليقها في وسط التراكب ونقلها إلى أنبوب ربط منخفض من الحمض النووي بسعة ملليلترين مع غطاء. اغسل جيدا D بالوسط الخارجي المتبقي من البئر أ لجمع القطرات المتبقية. عندما تترسب القطرات في أنابيب التجميع ، تأكد من مرحلتين متميزتين بوضوح في الأنابيب قبل الفحص المجهري.
املأ ما يقرب من ثلث طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر بقطرات من سطح طبقة القطرات. ثم املأ الثلثين المتبقيين المتبقيين من طرف الماصة بوسائط التراكب. قم بتحميل العينة على الفور على شريحة زجاجية مكونة من ثماني غرف.
افحص القطرات مجهريا بتكبير 4x و 20x لتأكيد تحميل القطرات بالخلايا. للحضانة ، استخدم إبرة حقنة قياس 21 لثقب غطاء العدد المطلوب من أنابيب ربط منخفضة من الحمض النووي بعناية. أضف ملليلتر واحد من الوسط الخارجي إلى كل أنبوب حضانة.
أعد تعليق القطرات المتولدة في وسائط التراكب وقسم كل إنتاج إلى ثلاثة أنابيب حضانة معدة. ضع الأنابيب في وضع مستقيم في الحاضنة لمدة ساعتين أو أربع أو ست ساعات من الحضانة بعد توليد القطرات. بعد الحضانة ، انقل عددا صغيرا من القطرات إلى شريحة مجهرية.
تحليل القطرات عن طريق المجهر اللامع والفلوري باستخدام مجهر فلوري قياسي مع تكوين الليزر والمرشح المناسب. أعد تعليق كل عينة قطرة في وسط التراكب. نقل العينات المعلقة إلى خمسة مليلتر أنابيب FAC.
قم بتحليل القطرات باستخدام مقياس التدفق الخلوي القياسي. إشارات ارتفاع الشدة القياسية للتشتت الأمامي والتشتت الجانبي والفلوروفورات التي تم فحصها. اغسل مقياس التدفق الخلوي من خلال منفذ حقن العينة بعد كل مجموعة من عمليات الاستحواذ على القطرات باستخدام محاليل التنظيف والشطف القياسية.
تم إثراء الخلايا التائية CAR بنجاح إلى نقاء يزيد عن 98٪ لكل من المتبرعين باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل NGFR وتم قياس نسبة CD4-CD8 عند 0.73 مع ملاحظة نمط ظاهري ساذج يشبه الذاكرة. تم استخدام الخلايا التائية غير المحولة كعناصر تحكم في التجربة. أظهر الفحص المجهري الفلوري بعد أربع ساعات من الحضانة إفراز Granzyme B في قطرات مع خلايا JeKo-1 مغلفة بخلايا CAR T بينما لم يتم الكشف عن أي إفراز بالخلايا التائية غير المحولة.
حدد قياس التدفق الخلوي مجموعات قطرات متميزة بناء على أنواع الخلايا المغلفة ، مما يؤكد أن إفراز Granzyme B الواضح والنشاط السام للخلايا حدث في قطرات تحتوي على خلايا CAR T والخلايا المستهدفة JeKo-1. أظهر إفراز Granzyme B وقتل الخلايا المستهدفة بواسطة الخلايا التائية CAR زيادة تعتمد على الوقت مع أكثر من 30٪ من الخلايا التائية CAR التي تفرز Granzyme B بعد ست ساعات وأكثر من 20٪ من الخلايا التائية CAR التي تقتل الخلايا المستهدفة كما هو موضح في إيجابية يوديد البروبيديوم.
