فإن الكتاب أود أن أنوه بروغان ضيف، ويفر ميشيل، وكريستين ليبرت. تم توفير التمويل لهذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R03EB009237، فضلا عن منح التدريب NIH-06 T32EB001026 من المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية وT32HL076124 05-.

1. إعداد الأنسجة وتجربة الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخنازير الجهاز مباشرة بعد القتل الرحيم من منشأة مسلخ أو البحث وشطف الدم الزائد. تقليم قلب من الدهون الزائدة والأنسجة، والحفاظ على الشريان الأورطي والأذين سليمة. تقليم بعيدا الدهون لفصل الشريان الرئوي من الشريان الأورطي. إذا كان هناك أي تخفيضات في الأنسجة، وتجاهل بشكل مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف كل قلب على حدة في ورقة المجمد وتخزين جميع الأنسجة في الفريزر -80 ° C لمدة لا تقل عن 24 ساعة لضمان التجميد الكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما جاهزة للاستخدام (عادة أقل من 3 أشهر)، ذوبان الجليد سليمة 1 قلب الخنزير المجمدة في الماء 1 نوع المغمورة بين عشية وضحاها في كوب L 4 في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إذابة قلب تماما، بات قلب الجافة، تزن القلب، وتسجيل الوزن. وينبغي قلب السوق خنزير تزن حوالي 375-450 الوزن ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال أنابيب حجم Masterflex 18 إلى النهاية &quot;ل¼ المخفض الشائكة. أدخل المخفض الشائكة وأنابيب داخل الشريان الأورطي. المشابك خرطوم 2 أو مكان الرمز البريدي العلاقات آمنة حول الأبهر، أسفل الجذع العضدي الرأسي. والمخفض وأنابيب يجب أن تبقى فوق الصمام الأبهري، وبالتالي يمكن perfused الشرايين التاجية (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة مل 30 أو 60 لملء الأنابيب بالماء I نوع. إدراج أنابيب داخل خرطوشة من مضخة الأسطوانة Masterflex في منتصفه تقريبية. يغرق نهاية تدفق للأنابيب في قاع كوب مملوء L 4 2.5 لتر من الماء وتأمين أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القلب في كوب مملوء بالماء، ورئيس المضخة لإزالة فقاعات الهواء. إذا لاحظت فقاعات قادمة من الشريان الأورطي حيث يتم إدراج أنابيب، قد تحتاج إلى الشريان الأورطي أو أعادت العلاقات مع تأمين إضافية. ختم محكم المهم للحفاظ على الضغط الكافي أثناء عملية decellularization (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الكأس التي تحتوي على L 4 3 L لنان 0.2٪ Trypsin/0.05٪ EDTA/0.05٪3 الحل على اثارة وحة والحارة إلى 37 درجة مئوية في إعداد عملية decellularization. </li></ol> 2. يشطف النسيج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مضخة لمعدل التدفق من 400 مل / دقيقة، وضمان أن يتم تحديد حجم أنابيب الصحيح. مسح القلب مع النوع الأول 15-25 دقيقة للمياه. كما بدأت المضخة، يجب قلب تنتفخ ومنفرش الدم من البطينين. ينبغي الاستعاضة حل الطازج كل 5-10 دقيقة، أو حسب الحاجة على أساس كمية من الدم من القلب إزالة. إذا لم يتم effused الدم من القلب، وضبط أنابيب والمشابك حسب الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت وقف ضخ ونقل القلب إلى دورق منفصل مليئة المالحة الفوسفات 2X (PBS). بعد الأنبوب المغمور في الحل، وبدء ضخ زيادة معدل تدفق إلى 700 مل / دقيقة. يجب أن تبقى في قلب حل لمدة 15 دقيقة، وتغيير كل 5 دقائق الحل. كل تغيير يتطلب حل المضخة إلى أن يتوقف مؤقتا بينما يتم نقل الأنسجة وأنابيبإلى دورق جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى النوع الأول الماء لمدة 10 دقيقة وزيادة معدل تدفق إلى 750 مل / دقيقة. </li></ol> 3. Decellularization والحل الإرواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى دورق يحتوي على 0.2٪ Trypsin/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 في 37 ° C. زيادة سرعة مضخة إلى 1،200 مل / دقيقة وتبدأ المضخة. استخدام قضيب تحريك وضعت في أسفل الكأس تعميم الحل في الدورق. يجب أن تبقى في القلب 0.2٪ حل EDTA/0.05٪ 3٪ Trypsin/0.05 نان في C ° 37 ليصبح المجموع ثلاث ساعات. بعد 1 ساعة، زيادة سرعة مضخة إلى 1،500 مل / دقيقة. بعد ساعة إضافية، زيادة سرعة مضخة إلى 1،800 مل / دقيقة. تتعرض الأنسجة ببطء لزيادة سرعات نضح إلى حالة الأنسجة ومنع تمزق الأوعية. سوف تنتفخ وقلب مزدوج تقريبا في حجم أثناء هذه الخطوة من البروتوكول. سوف النسيج يفقد لونه الطبيعي، تتقدم من الأذينين إلى قمة أنحاء اله بروتوكول (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل نضح الحل، يتم تنفيذ الخطوة الثانية شطف لإزالة الأنقاض الخلوية، والمخلفات الكيميائية، والمساعدات تحلل الخلايا. كل شطف يتكون من 10 دقيقة في شطف المياه من النوع الأول تليها 10 دقيقة شطف بمحلول PBS 2X في درجة حرارة الغرفة. كل غسل يتكون من إزالة الحل من الكأس الأصلية، مضيفا شطف الحلول، وتعميم سائل الإرواء في دورق يحتوي على القلب المغمورة. بعد حل 0.2٪ Trypsin/0.05٪ 3٪ EDTA/0.05 نان، يروي المياه في 1900 مل / دقيقة ثم يروي 2X PBS في 1950 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى حل من 3٪ تريتون X-100/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 في درجة حرارة الغرفة. زيادة سرعة مضخة إلى 2،000 مل / دقيقة وحل يروي لمدة ساعة. إزالة الحل من الدورق واستبدالها مع حل جديد، زيادة سرعة مضخة إلى 2100 مل / دقيقة، ويروي الحل الطازجة لمدة ساعة ونصف إضافية، ليصل إجمالي الوقت في3٪ تريتون X-100/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 حتي 2،5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة في الماء I نوع في 2150 دقيقة / مل وPBS 2X في 2180 مل / دقيقة لمدة 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى حل الصوديوم Deoxycholate 4٪ في درجة حرارة الغرفة. زيادة سرعة مضخة إلى 2،200 مل / دقيقة وحل يروي لمدة 3 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة في الماء I نوع و2X في PBS في 2200 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة لكل منهما، بعد تغيير الحلول 5-10 دقيقة في كل حل. ويمكن تقسيم الخطوات الموضحة نضح خلال الأيام متعددة قبل تنفيذ الخطوة شطف مرتين وتخزين أنابيب المرفقة مع القلب بين عشية وضحاها في 4 و C ° المغمورة في المياه I نوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، تنفيذ حد أدنى 5 شطف بالماء I نوع في 750 مل / دقيقة، تليها 5 دقائق شطف PBS 1X في 1500 في مل / دقيقة. ثم قد البروتوكول أن تستمر في معدل التدفق الوارد وصفها في الحل المناسب. </li></ol> 4. التطهير والمعالجة النهائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قلب لperac 0.1٪ETIC حمض / 4٪ محلول الإيثانول وحل يروي ل 1.5 ساعة في 2200 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ جميع يشطف النهائية للنسيج في 2200 مل / دقيقة. يروي النسيج مع 1X PBS لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل من قبل اثنين من 5 دقائق في الماء I نوع. ويتكرر هذا المسلسل من يشطف مرة أخرى من أجل استكمال إجراءات نضح الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل قبالة مضخة وإزالة القلب من حل لتصريف القلب. قطع العلاقات من الشريان الأورطي، وإزالة جميع الأنابيب، ووضع القلب في كوب فارغ لاستنزاف لمدة 1 ساعة. سوف السائل الزائد يجب أن يتم بشكل دوري ينضب. وضع وسادة القلب على ماصة لاستنزاف تماما القلب (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة معظم الماء، سجل وزن المصفوفة خارج الخلية القلب (C-ECM). ويمكن توقع أن يخسر قلب حوالي 20-25٪ من وزنه الأولي خلال عملية decellularization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح البطينين الأيمن والأيسر، وكذلك الحاجز البطيني للquantificati DNAعلى تجهيز والنسيجية من أجل تأكيد decellularization كاملة من النسيج (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد C-C ° ECM في -80 على الأقل 2 ساعة قبل تجفيد. </li></ol>

<ol>
	<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart.">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li><li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization:+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities.">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li><li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds.">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li><li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li><li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction.">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li><li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds.">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li><li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold.">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li></ol>

وكان الدكتور جيلبرت على المجلس الاستشاري العلمي في ACell، وشركة في حين يجري القيام به الدراسة، وأصبح مؤخرا نائب الرئيس للبحوث والتنمية. ACell، وشركة تبيع البولية مصفوفة المثانة وليس لديه مصلحة تجارية في هذه الدراسة.

وحددت الدراسة الحالية منهجية متسقة وفعالة decellularization من قلب الخنزير. كان بروتوكول تعديل لتقرير نشر سابقا 1، وشملت يعد التعرض لتدفق وزيادة الضغط، التي وفرت المزيد من النتائج للتكرار. التقى الأنسجة الناتجة decellularized كافة المعايير المنشورة لdecellularization ناجحة من الأنس...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> التربسين </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> الصياد </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> نان 3 </td><td> سيجما </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> سيجما </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> الصياد </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> الصوديوم Deoxycholate </td><td> سيجما </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> البيروكسي حمض </td><td> Pfaltz وباور </td><td> P05020 </td><td> 35٪ CAS 79-21-0 # </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></tد&gt; </tr><tr><td> Masterflex مضخة القيادة </td><td> كول Parmer </td><td> SI-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex الأنابيب </td><td> كول Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> حجم 18 </td></tr><tr><td> الشائكة المخفض </td><td> كول Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> 4L بيكر </td><td> فيشر العلمية </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

وقد اكتسب نضح على أساس decellularization الجهاز كله مؤخرا الاهتمام في مجال هندسة الأنسجة كوسيلة لخلق مواقع محددة السقالات المصفوفة خارج الخلية، إلى حد كبير مع الحفاظ على بنية الأصلية هي السقالة. حتى الآن، وقد استخدمت هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من أجهزة الجسم، بما في ذلك القلب والرئة والكبد و1-5. وقد اعتمدت أساليب decellularization السابقة لأنسجة الأوعية الدموية وشبكة دون الوصول إليها بسهولة عند التعرض لفترات طويلة من النسيج إلى حلول من المنظفات، والأحماض، أو العلاجات الأنزيمية كوسيلة لإزالة المكونات الخلوية والنووية من البيئة المحيطة خارج الخلية 6-8. ومع ذلك، فإن فعالية هذه الأساليب يتوقف على قدرة الحلول لتتخلل نسيج عبر نشرها. في المقابل، نضح من الأجهزة من خلال النظام الأوعية الدموية الطبيعية على نحو فعال خفض المسافة نشرها وتيسير النقل من decellularizatiعلى وكلاء في الأنسجة والمكونات الخلوية من الأنسجة. هنا، نحن تصف طريقة لdecellularize تماما قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء التاجية. أسفرت عن بروتوكول القلب خارج الخلية decellularized تماما مصفوفة (C-ECM) سقالة مع هيكل ثلاثي الأبعاد للقلب سليمة. استخدام أسلوب لدينا سلسلة من الإنزيمات، والمنظفات، والأحماض بالإضافة إلى يشطف مفرط التوتر وناقص التوتر للمساعدة في تحلل وإزالة الخلايا. استخدام بروتوكول حل لفصل الخلايا التربسين من المصفوفة تليها حلول تريتون X-100 deoxycholate والصوديوم للمساعدة في إزالة المواد الخلوية. بروتوكول يستخدم أيضا وصف سرعات نضح من أكبر من 2 لتر / دقيقة لفترات طويلة من الزمن. ضمان معدل تدفق عالية، إلى جانب التغييرات حل يسمح النقل من وكلاء للأنسجة دون التسبب في تلوث الحطام الخلوية وفعالة الشطف من الأنسجة. الطريقة الموضحة إزالة جميع المواد النووية من ناتيهاء الأنسجة القلبية الخنازير، وخلق مواقع محددة القلب ECM سقالة التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات.

تأثير على قلوب الخنازير decellularization كله يختلف بطبيعة الحال بسبب الاختلافات في حجم والضغوط وترتيب السفينة. ولذلك، فإن تكوين الدقيق للالسقالات المصفوفة خارج الخلية المستمدة لن تكون هي نفسها من القلب الى القلب. والانتهاء من البروتوكول وصف تسفر عن القلب الذي يظهر بيضاء أ?...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion at JoVE.com

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

ووصف طريقة لإزالة بسرعة وبصورة كاملة المكونات الخلوية من قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء. هذه الطريقة تعطي القلب موقع خارج الخلية مصفوفة محددة سقالة الذي لديه القدرة لاستخدامها في التطبيقات السريرية المتعددة.

إجراءات Decellularization من القلب التاجي لحم الخنزير من قبل الإرواء الوراء

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K Views.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. ووصف طريقة لإزالة بسرعة وبصورة كاملة المكونات الخلوية من قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء. هذه الطريقة تعطي القلب موقع خارج الخلية مصفوفة محددة سقالة الذي لديه القدرة لاستخدامها في التطبيقات السريرية المتعددة.

Video: Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

الداخلي للهندسة الرئة

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

منهج Decellularization لإنتاج وغير خلوي الطبيعية المعوية ماتريكس

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

إجراءات Decellularization من الجرذ الأكباد في تتأرجح ضغط الإرواء الأجهزة

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

طريقتين ديسيلولاريزيشن أنسجة النباتية لتطبيقات هندسة الأنسجة

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

ديسيلولاريزيشن ومنهجية ريسيلولاريزيشن للاوردة الصافن البشرية

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

ديسيلولاريزيشن قلب البشري برمته داخل حقيبة الضغط في اتجاه معكوس

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

والعزلة وديسيلولاريزيشن من بنكرياس الخنزير كله

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.