فإن الكتاب أود أن أنوه بروغان ضيف، ويفر ميشيل، وكريستين ليبرت. تم توفير التمويل لهذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R03EB009237، فضلا عن منح التدريب NIH-06 T32EB001026 من المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية وT32HL076124 05-.

1. إعداد الأنسجة وتجربة الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخنازير الجهاز مباشرة بعد القتل الرحيم من منشأة مسلخ أو البحث وشطف الدم الزائد. تقليم قلب من الدهون الزائدة والأنسجة، والحفاظ على الشريان الأورطي والأذين سليمة. تقليم بعيدا الدهون لفصل الشريان الرئوي من الشريان الأورطي. إذا كان هناك أي تخفيضات في الأنسجة، وتجاهل بشكل مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف كل قلب على حدة في ورقة المجمد وتخزين جميع الأنسجة في الفريزر -80 ° C لمدة لا تقل عن 24 ساعة لضمان التجميد الكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما جاهزة للاستخدام (عادة أقل من 3 أشهر)، ذوبان الجليد سليمة 1 قلب الخنزير المجمدة في الماء 1 نوع المغمورة بين عشية وضحاها في كوب L 4 في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إذابة قلب تماما، بات قلب الجافة، تزن القلب، وتسجيل الوزن. وينبغي قلب السوق خنزير تزن حوالي 375-450 الوزن ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال أنابيب حجم Masterflex 18 إلى النهاية &quot;ل¼ المخفض الشائكة. أدخل المخفض الشائكة وأنابيب داخل الشريان الأورطي. المشابك خرطوم 2 أو مكان الرمز البريدي العلاقات آمنة حول الأبهر، أسفل الجذع العضدي الرأسي. والمخفض وأنابيب يجب أن تبقى فوق الصمام الأبهري، وبالتالي يمكن perfused الشرايين التاجية (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة مل 30 أو 60 لملء الأنابيب بالماء I نوع. إدراج أنابيب داخل خرطوشة من مضخة الأسطوانة Masterflex في منتصفه تقريبية. يغرق نهاية تدفق للأنابيب في قاع كوب مملوء L 4 2.5 لتر من الماء وتأمين أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القلب في كوب مملوء بالماء، ورئيس المضخة لإزالة فقاعات الهواء. إذا لاحظت فقاعات قادمة من الشريان الأورطي حيث يتم إدراج أنابيب، قد تحتاج إلى الشريان الأورطي أو أعادت العلاقات مع تأمين إضافية. ختم محكم المهم للحفاظ على الضغط الكافي أثناء عملية decellularization (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الكأس التي تحتوي على L 4 3 L لنان 0.2٪ Trypsin/0.05٪ EDTA/0.05٪3 الحل على اثارة وحة والحارة إلى 37 درجة مئوية في إعداد عملية decellularization. </li></ol> 2. يشطف النسيج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مضخة لمعدل التدفق من 400 مل / دقيقة، وضمان أن يتم تحديد حجم أنابيب الصحيح. مسح القلب مع النوع الأول 15-25 دقيقة للمياه. كما بدأت المضخة، يجب قلب تنتفخ ومنفرش الدم من البطينين. ينبغي الاستعاضة حل الطازج كل 5-10 دقيقة، أو حسب الحاجة على أساس كمية من الدم من القلب إزالة. إذا لم يتم effused الدم من القلب، وضبط أنابيب والمشابك حسب الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت وقف ضخ ونقل القلب إلى دورق منفصل مليئة المالحة الفوسفات 2X (PBS). بعد الأنبوب المغمور في الحل، وبدء ضخ زيادة معدل تدفق إلى 700 مل / دقيقة. يجب أن تبقى في قلب حل لمدة 15 دقيقة، وتغيير كل 5 دقائق الحل. كل تغيير يتطلب حل المضخة إلى أن يتوقف مؤقتا بينما يتم نقل الأنسجة وأنابيبإلى دورق جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى النوع الأول الماء لمدة 10 دقيقة وزيادة معدل تدفق إلى 750 مل / دقيقة. </li></ol> 3. Decellularization والحل الإرواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى دورق يحتوي على 0.2٪ Trypsin/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 في 37 ° C. زيادة سرعة مضخة إلى 1،200 مل / دقيقة وتبدأ المضخة. استخدام قضيب تحريك وضعت في أسفل الكأس تعميم الحل في الدورق. يجب أن تبقى في القلب 0.2٪ حل EDTA/0.05٪ 3٪ Trypsin/0.05 نان في C ° 37 ليصبح المجموع ثلاث ساعات. بعد 1 ساعة، زيادة سرعة مضخة إلى 1،500 مل / دقيقة. بعد ساعة إضافية، زيادة سرعة مضخة إلى 1،800 مل / دقيقة. تتعرض الأنسجة ببطء لزيادة سرعات نضح إلى حالة الأنسجة ومنع تمزق الأوعية. سوف تنتفخ وقلب مزدوج تقريبا في حجم أثناء هذه الخطوة من البروتوكول. سوف النسيج يفقد لونه الطبيعي، تتقدم من الأذينين إلى قمة أنحاء اله بروتوكول (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل نضح الحل، يتم تنفيذ الخطوة الثانية شطف لإزالة الأنقاض الخلوية، والمخلفات الكيميائية، والمساعدات تحلل الخلايا. كل شطف يتكون من 10 دقيقة في شطف المياه من النوع الأول تليها 10 دقيقة شطف بمحلول PBS 2X في درجة حرارة الغرفة. كل غسل يتكون من إزالة الحل من الكأس الأصلية، مضيفا شطف الحلول، وتعميم سائل الإرواء في دورق يحتوي على القلب المغمورة. بعد حل 0.2٪ Trypsin/0.05٪ 3٪ EDTA/0.05 نان، يروي المياه في 1900 مل / دقيقة ثم يروي 2X PBS في 1950 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى حل من 3٪ تريتون X-100/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 في درجة حرارة الغرفة. زيادة سرعة مضخة إلى 2،000 مل / دقيقة وحل يروي لمدة ساعة. إزالة الحل من الدورق واستبدالها مع حل جديد، زيادة سرعة مضخة إلى 2100 مل / دقيقة، ويروي الحل الطازجة لمدة ساعة ونصف إضافية، ليصل إجمالي الوقت في3٪ تريتون X-100/0.05٪ EDTA/0.05٪ نان 3 حتي 2،5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة في الماء I نوع في 2150 دقيقة / مل وPBS 2X في 2180 مل / دقيقة لمدة 10 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب إلى حل الصوديوم Deoxycholate 4٪ في درجة حرارة الغرفة. زيادة سرعة مضخة إلى 2،200 مل / دقيقة وحل يروي لمدة 3 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة في الماء I نوع و2X في PBS في 2200 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة لكل منهما، بعد تغيير الحلول 5-10 دقيقة في كل حل. ويمكن تقسيم الخطوات الموضحة نضح خلال الأيام متعددة قبل تنفيذ الخطوة شطف مرتين وتخزين أنابيب المرفقة مع القلب بين عشية وضحاها في 4 و C ° المغمورة في المياه I نوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، تنفيذ حد أدنى 5 شطف بالماء I نوع في 750 مل / دقيقة، تليها 5 دقائق شطف PBS 1X في 1500 في مل / دقيقة. ثم قد البروتوكول أن تستمر في معدل التدفق الوارد وصفها في الحل المناسب. </li></ol> 4. التطهير والمعالجة النهائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قلب لperac 0.1٪ETIC حمض / 4٪ محلول الإيثانول وحل يروي ل 1.5 ساعة في 2200 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ جميع يشطف النهائية للنسيج في 2200 مل / دقيقة. يروي النسيج مع 1X PBS لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل من قبل اثنين من 5 دقائق في الماء I نوع. ويتكرر هذا المسلسل من يشطف مرة أخرى من أجل استكمال إجراءات نضح الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل قبالة مضخة وإزالة القلب من حل لتصريف القلب. قطع العلاقات من الشريان الأورطي، وإزالة جميع الأنابيب، ووضع القلب في كوب فارغ لاستنزاف لمدة 1 ساعة. سوف السائل الزائد يجب أن يتم بشكل دوري ينضب. وضع وسادة القلب على ماصة لاستنزاف تماما القلب (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة معظم الماء، سجل وزن المصفوفة خارج الخلية القلب (C-ECM). ويمكن توقع أن يخسر قلب حوالي 20-25٪ من وزنه الأولي خلال عملية decellularization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح البطينين الأيمن والأيسر، وكذلك الحاجز البطيني للquantificati DNAعلى تجهيز والنسيجية من أجل تأكيد decellularization كاملة من النسيج (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد C-C ° ECM في -80 على الأقل 2 ساعة قبل تجفيد. </li></ol>

<ol>
	<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart.">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li><li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization:+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities.">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li><li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds.">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li><li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li><li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction.">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li><li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds.">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li><li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold.">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li></ol>

وكان الدكتور جيلبرت على المجلس الاستشاري العلمي في ACell، وشركة في حين يجري القيام به الدراسة، وأصبح مؤخرا نائب الرئيس للبحوث والتنمية. ACell، وشركة تبيع البولية مصفوفة المثانة وليس لديه مصلحة تجارية في هذه الدراسة.

وحددت الدراسة الحالية منهجية متسقة وفعالة decellularization من قلب الخنزير. كان بروتوكول تعديل لتقرير نشر سابقا 1، وشملت يعد التعرض لتدفق وزيادة الضغط، التي وفرت المزيد من النتائج للتكرار. التقى الأنسجة الناتجة decellularized كافة المعايير المنشورة لdecellularization ناجحة من الأنس...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> التربسين </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> الصياد </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> نان 3 </td><td> سيجما </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> سيجما </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> الصياد </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> الصوديوم Deoxycholate </td><td> سيجما </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> البيروكسي حمض </td><td> Pfaltz وباور </td><td> P05020 </td><td> 35٪ CAS 79-21-0 # </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></tد&gt; </tr><tr><td> Masterflex مضخة القيادة </td><td> كول Parmer </td><td> SI-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex الأنابيب </td><td> كول Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> حجم 18 </td></tr><tr><td> الشائكة المخفض </td><td> كول Parmer </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> 4L بيكر </td><td> فيشر العلمية </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

وقد اكتسب نضح على أساس decellularization الجهاز كله مؤخرا الاهتمام في مجال هندسة الأنسجة كوسيلة لخلق مواقع محددة السقالات المصفوفة خارج الخلية، إلى حد كبير مع الحفاظ على بنية الأصلية هي السقالة. حتى الآن، وقد استخدمت هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من أجهزة الجسم، بما في ذلك القلب والرئة والكبد و1-5. وقد اعتمدت أساليب decellularization السابقة لأنسجة الأوعية الدموية وشبكة دون الوصول إليها بسهولة عند التعرض لفترات طويلة من النسيج إلى حلول من المنظفات، والأحماض، أو العلاجات الأنزيمية كوسيلة لإزالة المكونات الخلوية والنووية من البيئة المحيطة خارج الخلية 6-8. ومع ذلك، فإن فعالية هذه الأساليب يتوقف على قدرة الحلول لتتخلل نسيج عبر نشرها. في المقابل، نضح من الأجهزة من خلال النظام الأوعية الدموية الطبيعية على نحو فعال خفض المسافة نشرها وتيسير النقل من decellularizatiعلى وكلاء في الأنسجة والمكونات الخلوية من الأنسجة. هنا، نحن تصف طريقة لdecellularize تماما قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء التاجية. أسفرت عن بروتوكول القلب خارج الخلية decellularized تماما مصفوفة (C-ECM) سقالة مع هيكل ثلاثي الأبعاد للقلب سليمة. استخدام أسلوب لدينا سلسلة من الإنزيمات، والمنظفات، والأحماض بالإضافة إلى يشطف مفرط التوتر وناقص التوتر للمساعدة في تحلل وإزالة الخلايا. استخدام بروتوكول حل لفصل الخلايا التربسين من المصفوفة تليها حلول تريتون X-100 deoxycholate والصوديوم للمساعدة في إزالة المواد الخلوية. بروتوكول يستخدم أيضا وصف سرعات نضح من أكبر من 2 لتر / دقيقة لفترات طويلة من الزمن. ضمان معدل تدفق عالية، إلى جانب التغييرات حل يسمح النقل من وكلاء للأنسجة دون التسبب في تلوث الحطام الخلوية وفعالة الشطف من الأنسجة. الطريقة الموضحة إزالة جميع المواد النووية من ناتيهاء الأنسجة القلبية الخنازير، وخلق مواقع محددة القلب ECM سقالة التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات.

تأثير على قلوب الخنازير decellularization كله يختلف بطبيعة الحال بسبب الاختلافات في حجم والضغوط وترتيب السفينة. ولذلك، فإن تكوين الدقيق للالسقالات المصفوفة خارج الخلية المستمدة لن تكون هي نفسها من القلب الى القلب. والانتهاء من البروتوكول وصف تسفر عن القلب الذي يظهر بيضاء أ?...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion at JoVE.com

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

ووصف طريقة لإزالة بسرعة وبصورة كاملة المكونات الخلوية من قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء. هذه الطريقة تعطي القلب موقع خارج الخلية مصفوفة محددة سقالة الذي لديه القدرة لاستخدامها في التطبيقات السريرية المتعددة.

إجراءات Decellularization من القلب التاجي لحم الخنزير من قبل الإرواء الوراء

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.7K Views.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. ووصف طريقة لإزالة بسرعة وبصورة كاملة المكونات الخلوية من قلب الخنزير سليمة من خلال نضح الوراء. هذه الطريقة تعطي القلب موقع خارج الخلية مصفوفة محددة سقالة الذي لديه القدرة لاستخدامها في التطبيقات السريرية المتعددة.

Video: Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

إجراءات Decellularization من الجرذ الأكباد في تتأرجح ضغط الإرواء الأجهزة

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

ديسيلولاريزيشن قلب البشري برمته داخل حقيبة الضغط في اتجاه معكوس

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

والعزلة وديسيلولاريزيشن من بنكرياس الخنزير كله

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

الوقت الذي تم حله في الجسم الحي قياس ديناميكيات Neuropeptide بواسطة مسبار مناعي سعوي في قلب لحم الخنزير

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

شراء ونزع الخلايا من اللوحات الوعائية الخنازير في مفاعل حيوي مخصص للتروية

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

شراء وإزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران باستخدام مفاعل حيوي قائم على التروية خارج الجسم الحي لزراعة الخيول المركبة الوعائية

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

تقييم الخواص الهيدروديناميكية في الصمامات الأبهرية الخنازير المركبة

An Ex Vivo Porcine Model for Hydrodynamic Testing of Experimental Aortic Valve Procedures and Novel Medical Devices

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a method for mounting a porcine aortic valve in a pulse duplicator to evaluate its hydrodynamic properties. These properties can then be evaluated before and after the procedure under investigation is performed and/or the investigative medical device is applied. Securing the inflow segment presents some difficulty owing to the lack of circumferential myocardium in the left ventricular outflow tract. This method addresses that issue by securing the inflow segment using the anterior leaflet of the mitral valve and then suturing the left ventricular free wall around the inflow fixture. The outflow segment is secured simply by inserting the fixture into an incision in the superior aspect of the aortic arch. We found that specimens had significantly different hydrodynamic properties before and after tissue fixation. This finding induced us to use fresh specimens in our testing and should be considered when using this method. In our work, we used this method to test novel intracardiac patch materials for use in the valvular position by performing an aortic valve neocuspidization procedure (Ozaki procedure) on the mounted porcine aortic valves. These valves were tested before and after the procedure to assess the change in hydrodynamic properties in comparison to the native valve. Herein, we report a platform for hydrodynamic testing of experimental aortic valve procedures that enables comparison with the native valve and between different devices and techniques used for the procedure under investigation.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير اختبار إجراءات القلب قبل الشروع في الدراسات الحيوانية الكبيرة 

We present a method for mounting a porcine aortic valve on a pulse duplicator to test its hydrodynamic properties. This method can be used to determine the change in hydrodynamics after the application of an experimental procedure or novel medical device prior to use in a large animal model.

نموذج الخنازير خارج الجسم الحي للاختبار الهيدروديناميكي لإجراءات الصمام الأبهري التجريبية والأجهزة الطبية الجديدة

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a ...