وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (AR-49419، DD)، رابطة الضمور العضلي (DD)، والمعاهد الوطنية للصحة منح التدريب T90DK70105 (CH).

1. تقييم خصائص سلبية ومقلص من العضلات فيفو السابقين EDL يتم قياس خصائص مقلص والسلبي للعضلات الجسم الحي EDL السابقين باستخدام أورورا العلمية في المختبر نظام اختبار العضلات. الرجوع إلى الجدول رقم 1 للمواد والمعدات. 1،1 معدات إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع حمام الأنسجة الجهاز عن طريق ضمان oxytube إلى الحمام الأنسجة المياه سترة. إرفاق حمام تجميعها لجهاز العضلات في تصاعد مستمر. ربط خط الغاز إلى oxytube. ربط خطوط توزيع المياه إلى الحمام الأنسجة المياه سترة ووضع صمام إبرة في الصرف حمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على حمام مائي تعميم وضبط درجة الحرارة إلى 30 ° C 7. 5 السماح PSI (جنيه لكل بوصة مربعة) من 95٪ O CO 2 -5٪ 2 إلى تدفق من خلال oxytube. املئي حوض الاستحمام مع العازلة رينغر. تتوازن المخزن المؤقت مدة لا تقل عن10 دقيقة مع تدفق الغاز ثابت عن طريق ضبط صمام oxytube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الصكوك (محفز، وضع مزدوج نظام ذراع، واجهة إشارة). تحميل السيطرة على العضلات الحيوي (DMC) والبرمجيات وفقا للتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> تشريح العضلات 1،2 EDL يجب الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس مع حقن داخل الصفاق من 2.5 ميكروليتر / غرام من وزن الجسم من مخدر كوكتيل (يرجى الرجوع إلى قسم المواد). طوال العملية الجراحية، تم فحص عمق التخدير عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميه. يتم إدارتها من الملحق A 10٪ من الجرعة الأولي مخدر عند الحاجة للحفاظ على الحيوانات تحت التخدير. حلق أطرافهم هند. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 ° C قبل إجراء تشريح عن طريق وضع الماوس على وسادة التدفئة. ويتم رصد درجة حرارة الجسم عن طريق قياس باستمرار temperat المستقيملدى عودتهم باستخدام المسبار الحراري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مستلق على لوحة الماوس تشريح (الشكل 1). تقشر الجلد في الساق لفضح العضلات أطرافهم هند. تأمين الساق على الكتلة باستخدام دبابيس خياطة sylgard اثنين، واحد في القدم والآخر في العضلة الناحلة. وضع مصباح الحرارة فوق الماوس الجسم للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 ° C. superfuse باستمرار جميع عضلات يتعرض مع العازلة رينغر. استنزاف العازلة الزائدة من خلال خط فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح TA القاصي ووتر في الرباط الباسطة تحت stereomicroscope من تشريح الجلد نحو القدم. إزالة بلطف اللفافة التي تغطي العضلات TA. قطع في الرباط الباسطة للافراج عن وتر TA البعيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وتر TA القاصي واستخدامها لقشر قبالة العضلات TA. إزالة بعناية TA العضلات في تمسكه القريبة. وضع قطعة رقيقة من القطن غارقة العازلة رينغر بجوار العضلات على امتصاص النزيف EDL الناجمة عن تمزق الأوعية الدموية للعضلات TA. استخدام سطر فراغ لإزالة الزائدة العازلة والدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط عقدة مزدوجة على مربع تليها حلقة عقدة باستخدام الخيط الحرير الخبز في العضلات تقاطع وتر (MTJ) من العضلات في مؤسسة كهرباء لبنان البعيدة (الشكل 2). إجراء شق في الجزء الأعلى من عضلة ذات الرأسين الفخذية لفضح العضلات القريبة EDL. تكرار نفس المجموعة من عقدة (الشكل 2) في MTJ من وتر في مؤسسة كهرباء لبنان القريبة. إرفاق هوك ذراع الرافعة إلى الداني إما أو عقدة عقدة مع القاصي مربع المزدوجة باستخدام سطر خياطة نفسه. قطع خط خياطة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وتر القريبة EDL متفوقة على عقدة الخيط القريبة. ترفع عضلة EDL مع هوك وقطع الأوعية الدموية تحت العضلات. قطع وتر البعيدة EDL أدنى من عقدة الخيط البعيدة لإزالة العضلات EDL من الطرف هند. تغطية الطرف يتعرض هند مع قطعة من القطن غارقة العازلة رينغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق هوك إلى ذراع الرافعة. محاذاة عموديا العضلاتبين قطبين. تأمين خط خياطة البعيدة إلى آخر ثابت. يرفع الحمام الأنسجة العضلية لغمر في المخزن المؤقت رينغر. ضبط التوتر يستريح إلى 1،0 ز باستخدام مزدوج المرحلة ترجمة خشن / ناعم والسماح للعضلات للتوازن لا يقل عن 10 دقيقة. </li></ol> 1.3 قياس خصائص مقلص والسلبي من العضلات EDL استخدام الجدول 2 لإعداد المعلمات في البرنامج DMC لكل من القياسات التالية. تحليل البيانات باستخدام تحليل ديناميكية العضلات (DMA) والبرمجيات. 1.3.1 قياس خصائص مقلص للعضلات EDL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز العضلات EDL ثلاث مرات ب 150 هرتز مع 60 ثانية على حدة لتحقيق الاستقرار في العضلات 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز العضلات في مؤسسة كهرباء لبنان التوترات يستريح مختلفة لتحديد طول الأمثل (لو). طول الأمثل هو طول العضلات التي تطور التوتر القصوى نشل. السماح للعضلة إلىالاسترخاء لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التوتر يستريح لاتحاد نقابات العمال. قياس قوة العضلات في تحفيز نشل واحدة. تحديد القوة المطلقة نشل (PT)، والوقت إلى التوتر الذروة (TPT) ونصف الساعة الاسترخاء (½ RT) من حزب العمال. يسمح للعضلات بالاسترخاء لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التوتر يستريح لاتحاد نقابات العمال. قياس قوة العضلات ولدت تكززي على ترددات مختلفة التحفيز (50، 80، 100، 120، 150 هرتز و200). تحديد الحد الأقصى المطلق قوة العضلات تكززي (بو) حيث قوة العضلات تصل إلى القصوى. قياس TPT و½ RT من بو 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح للعضلات بالاسترخاء لمدة 5 دقائق. ضبط التوتر يستريح لاتحاد نقابات العمال. تطبيق 10 دورات من تقلصات غريب الأطوار مع بقية حد أدنى 2 بين الدورات. حساب خسارة القوة النسبية للبو بعد كل دورة من انكماش غريب الأطوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل العضلات EDL من أجهزة وقطع الأوتار في موقع خياطة. تحديد وزن العضلات رطبة وحساب مساحة المقطع عبر العضلات (CSA)6،10. </li></ol> 1.3.2 قياس الخصائص السلبية للعضلة EDL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح العضلات المقابل EDL ونعلق عليه لجهاز كما هو موضح في القسم 1.2، الخطوات من 2 إلى 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموضوع عضلة EDL في بروتوكول ست خطوات التي تمتد توتر العضلات للو 160٪ بزيادة قدرها 10٪ لو. تحليل 6 الملف الإجهاد والانفعال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الملكية لزجة من العضلات EDL عن طريق قياس معدل التأكيد على الاسترخاء (SRR) في اطر زمنية تمتد التالية بعد عقد والعضلات في لو 10٪: من الذروة إلى الذروة بعد 0.1s (بي بي)، من 0.1 إلى 0.2s PP، من 0.2 إلى 0.5s بروبلين، بولي بروبلين من 0.5 إلى 1S و1.5s من 1 إلى ص </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الدراسة، الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم و / أو قطع الرأس في حين لا يزال الماوس تحت التخدير. فصل العضلات EDL من أجهزة وقطع الأوتار في موقع خياطة. تحديد وزن العضلات رطبة وحساب العضلات عبر SEctional منطقة (CSA) 6، 10. </li></ol> 2. تقييم خصائص مقلص من العضلات في الموقع TA يتم قياس خصائص مقلص للعضلات TA باستخدام العلمية أورورا في الموقع العضلات نظام الاختبار. الرجوع إلى الجدول رقم 1 للمواد والمعدات. 2،1 معدات إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين المرحلة الحيوان الحرارية التي تسيطر عليها إلى 37 ° C باستخدام تعميم الماء الحمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الصكوك (محفز، وضع مزدوج نظام ذراع، واجهة إشارة). تحميل البرنامج وفقا لتعليمات DMC الشركة المصنعة. </li></ol> 2.2 إعداد العضلات TA لقياس قوة في الموقع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس، حلق أطرافهم هند وفضح العضلات TA كما هو موضح في الخطوات من 1 إلى 3 في القسم 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط عقدة مزدوجة مربع حول الرضفة الرباط USIنانوغرام الحرير الخبز وخياطة. ربط عقدة مزدوجة مربع تليها عقدة في حلقة من العضلات MTJ TA البعيدة (الشكل 2)، ربط عقدة مزدوجة مربع آخر ترك ~ مم 10 حلقة من عقدة TA وتر البعيدة باستخدام سطر خياطة نفسه. ضع الثانية عقدة مزدوجة مربع على جانب الحلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المسامير من طرف هند ووضع الحيوان عرضة. فضح عضلة ذات الرأسين الفخذية. إجراء شق في خط الوسط لكشف العصب الوركي. ربط عقدة مزدوجة مربع حول الطرف القريب من العصب الوركي. تقليم جانب واحد من خطوط خياطة وقطع العصب متفوقة على عقدة. بلطف، وسحب العصب الوركي نحو الركبة باستخدام سطر خياطة ومسح الأنسجة المحيطة الضام لتحرير ~ 5 مم من طوله. لا تشد الأعصاب أثناء هذا الإجراء وsuperfuse باستمرار العصب مع العازلة المسابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العضلات TA المقابل كما هو موضح في الخطوات من 1 إلى 3. تغطية واحدة من أطرافهم هند يتعرض مع قطعة من ري<html> غارقة في nger العازلة القطن. superfuse باستمرار سواء مع الأطراف الخلفية قبل تحسنت (37 ° C) العازلة رينغر. إزالة الزائدة العازلة من خلال خط فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوانات المعرضة على منصة الحيوان. المشبك حامل إرفاق الركبة إلى منصة الحيوانية وتأمين ركبتيه إلى مسمار معدني مزدوج مع عقدة مربع باستخدام خياطة الرباط الرضفة خطوط. دبوس كلا القدمين على الكتلة باستخدام دبابيس sylgard خياطة. تأمين منصة الحيوان على خشبة المسرح الحرارية التي تسيطر عليها. وضع مصباح الحرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية الحيوان في C. ° 37 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين حامل قطب كهربائي إلى منصة الحيوانية ووضع العصب الوركي على القطب باستخدام سطر خياطة. الحفاظ على القطب بعيدا عن العضلات أطرافهم هند. قطع وتر TA البعيدة من أطرافهم هند المكشوف في موقع خياطة MTJ. إرفاق وتر TA البعيدة حلقة خياطة لربط ذراع الذراع. تغطية تتعرض العضلات أطرافهم هند مع القطن عازلة على قارع الأجراس في الحارة غارقة. </li></ol>&gt; 2،3 قياس خصائص مقلص للعضلات TA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الجدول 2 لتعيين المعلمات في البرنامج DMC. اتبع نفس البروتوكول وصفها في القسم 1.3.1 لتحديد خصائص مقلص للعضلات TA. تحليل البيانات باستخدام برنامج DMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد قياس الممتلكات مقلص، فصل وتر TA البعيدة حلقة خياطة من المقياس ربط الذراع. إزالة العضلات TA. تحديد وزن العضلات رطبة وحساب CSA 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الخصائص مقلص للعضلات TA المقابل وفقا لخطوات 1-3 المذكورة أعلاه. الموت ببطء الماوس فقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية في نهاية الدراسة. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا البروتوكول، وقد بينت لنا المقايسات الفسيولوجية لقياس خصائص مقلص والسلبي في عضلة EDL وخصائص مقلص للعضلات TA. ومصدر القلق الرئيسي في علم وظائف الأعضاء الدراسات العضلات هو الأوكسجين في العضلات المستهدفة. للعضلات الكبيرة (مثل العضلات TA)، ويفضل في نهج الموقع لنشر الأكسجين من المخزن المؤقت رينغر قد لا تصل إلى وسط العضلات في في فحص المختبر. في نهج الموقع لا يزعج العادية إمدادات الدم ونقص الأكسجة المرتبطة بها، يتم تجنب الآثار الاصطناعية. العضلة EDL هي واحدة من العضلات الأكثر استخداما في دراسة علم وظائف الأعضاء. ويمكن تحقيق الأوكسجين الكافي لكامل العضلة في المختبر في نظام بسبب صغر حجم العضلات. علاوة على ذلك، في نظام المختبر يوفر بيئة مغلقة لمعالجة تركيزات الأيونات (كا 2 +، + نا وK +) وكيماويةتراخيص وصول العملاء (ATP والجلوكوز) والتي هي ضرورية لتوليد قوة العضلات الأمثل. هذا يوفر فرصة كبيرة لدراسة تأثير هذه المتغيرات على إنتاج قوة. قياس دقيق لخصائص مقلص والسلبي للعضلات الأطراف أمر بالغ الأهمية لدراسة الهيكل العظمي وظيفة العضلات. غالبا ما تعتبر التغيرات المميزة لهذه الخصائص والسمات المميزة لأمراض العضلات المختلفة. التغييرات في هذه المعايير هي أيضا مؤشرات هامة لتحديد ما إذا كان العلاج التجريبي فعالة أم لا.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مادة </td><td> الصانع </td><td></td><td> مواصفات والتعليقات </td></tr><tr><td> الأنسجة الجهاز حمام </td><td> Radnoti LLC، CA، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td></td><td> المياه سترة حمام الأنسجة (القط # 158351-LL)، أكسجين أنبوب المفرق (القط # 160192)، صمام الأنبوب (القط # 120722) </td></tr><tr><td> تعميم حمام مائي </td><td> فيشر العلمية، التايم، MA، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مزيج الغاز </td><td> Airgas الوطنية، شارلوت، NC، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td></td><td> 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 </td></tr><tr><td> في المختبر فحص وظيفة عضلات الجهاز </td><td> أورورا العلمية، أورورا، ON، كندا </td><td></td><td> ويتكون النظام من ومشجعا (نموذج # 701A)، ونظام ذراع وضع مزدوج (نموذج # 300C 305C أو)، واجهة إشارة (نموذج # 604B) واختبار APparatus (نموذج # 800A) لتركيب الجهاز عموديا الأنسجة حمام </td></tr><tr><td> في المختبر فحص وظيفة عضلات البرمجيات </td><td></td><td></td><td> ديناميكية العضلات التحكم (DMC) والبرمجيات وتحليل ديناميكية العضلات بيانات التحكم (DMA) والبرمجيات </td></tr><tr><td> كوكتيل الماوس التخدير مختلطة في كلوريد الصوديوم 0.9٪ </td><td> الرجوع إلى المبادئ التوجيهية المؤسسية </td><td></td><td> الكيتامين (25 ملغ / مل)، زيلازين (2.5 ملغ / مل) وآسيبرومازين (0.5 ملغ / مل). طوال العملية الجراحية، قد تكون هناك حاجة لتكملة 10٪ من الجرعة الأولي للحفاظ على الحيوانات تحت التخدير. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> القط # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> A تشريح زجاجي حسب الطلب وحة </td><td> في منزل تصميم </td><td></td><td> الرجوع إلى الشكل 1 </td></tr><tr><td> مصباح التدفئة </td><td> الموترة إضاءة شركة،بوسطن، MA، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td></td><td> 15 مصباح واط للحفاظ على الحارة الماوس أثناء تشريح </td></tr><tr><td> رينغر العازلة </td><td> ويتم شراء المواد الكيميائية من العلم فيشر، التايم، MA، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td></td><td> تكوين في ملي: 1.2 ناه 2 PO 4 (القط # S369)، 1 MgSO 4 (القط # M63)، 4،83 بوكل (القط # P217) و 137 كلوريد الصوديوم (القط # 217)، 24 NaHCO 3 (القط # S233)، 2 CaCl 2 (القط # C79) و 10 الجلوكوز (القط # D16). حل فردي المواد الكيميائية وخلط في ترتيب المذكورة أعلاه. تخزين في C. ° 4 </td></tr><tr><td> ستيريو المجهر تشريح </td><td> نيكون، ميلفيل، NY، USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تشريح الأدوات </td><td> أدوات العلوم الجميلة، فوستر سيتي، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td></td><td> الخشنة ملقط، مقص الخشنة، ملقط غرامة (مستقيم و 45 ° زاوية) </td></tr><tr><td> مضفر خياطة الحرير 4-0 # </td><td> SofSilk الأمني ​​الأمريكي سوتوريس، نورواك، CT، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> القط # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> A الفولاذ المقاوم للصدأ حسب الطلب هوك </td><td> أجزاء صغيرة، وشركة </td><td></td><td> 2&#39;&#39; طويل S / S 304V (0.18&#39;&#39; قطر) لمحول القوة أو 305C 2.5 بوصة طويلة S / S 304V (0.012&#39;&#39; قطر) لمحول 300C (القط # ASTM A313) </td></tr><tr><td> في الموقع العضلات وظيفة نظام مقايسة </td><td> أورورا العلمية، أورورا، ON، كندا </td><td></td><td> نظام (809B، في أجهزة الماوس الموقع) تتكون من محفز (نموذج # 701B)، ونظام ذراع وضع مزدوج (نموذج # 305C)، واجهة إشارة (نموذج # 604A) وجهاز الصفيحة القدمية الحرارية للرقابة (نموذج # 809A ) </td></tr><tr><td> في المختبر فحص وظيفة عضلات البرمجيات </td><td> أورورا العلمية، أورورا، ON، كندا </td><td></td><td> ديناميكية العضلات التحكم (DMC) والبرمجيات وتحليل ديناميكية العضلات بيانات التحكم (DMA) والبرمجيات </td></tr><tr><td> A TA الفحص حسب الطلب الحيوان منصة </td><td> في منزل تصميم </td><td></td><td> الرجوع إلى الشكل 2 </td></tr><tr><td> A الفولاذ المقاوم للصدأ حسب الطلب هوك </td><td> أجزاء صغيرة، وشركة </td><td> القط # ASTM A313 </td><td> 0،5&#39;&#39; طويلة S / S 304V (0.18&#39;&#39; قطر) </td></tr><tr><td> حسب الطلب أقطاب البلاتين 25G </td><td> Chalgren الشركات، غيلروي، CA </td><td></td><td> هما جندي 0،016 أسلاك البلاتين&#39;&#39; أسلاك سميكة ل24G 2 الكهربائية </td></tr></tbody></table> الجدول 1. المواد والمعدات.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

وتقدم أساسا حركات الجسم حسب الوظيفة الميكانيكية للعضلات الهيكل العظمي. ويتكون الهيكل العظمي والعضلات من حزم العديد من myofibers التي مغمد من الأنسجة الضامة العضلي. كل ليف عضلي يحتوي على العديد من اللييفات العضلية التي تعمل على طول طولي من ليف عضلي. اللييفات العضلية هي جهاز مقلص من العضلات وأنها تتألف من وحدات متكررة تعرف باسم مقلص sarcomeres. وحدة قسيم عضلي يحتوي على خيوط الأكتين والميوسين التي كتبها متباعدة الأقراص Z والبروتين titin. يتم تعريف وظيفة العضلات الهيكلية الميكانيكية من خصائص مقلص والسلبي من العضلات. وتستخدم خصائص مقلص لوصف مقدار القوة المتولدة خلال تقلص العضلات، والوقت من جيل القوة والوقت للاسترخاء العضلات. أي عامل يؤثر على تقلص العضلات (مثل التفاعل بين الأكتين وخيوط الميوسين، التوازن من الكالسيوم، ATP / ADP النسبة، الخ.) يؤثر على prope مقلصrties. خصائص سلبية تشير إلى خصائص المرونة واللزوجة (تصلب واللزوجة) من العضلات في غياب الانكماش. ويتم تحديد هذه الخصائص من خارج الخلية والمكونات الهيكلية داخل الخلايا (مثل titin) والأنسجة الضامة (الكولاجين بشكل رئيسي) 1-2. خصائص مقلص والسلبي جانبان لا ينفصلان من وظيفة العضلات. على سبيل المثال، يتم إنجاز انثناء الكوع من انكماش العضلات في المقصورة الأمامية من الذراع والسلبية وتمتد من العضلات في المقصورة الخلفية للذراع العلوي. لفهم حقا وظيفة العضلات، ينبغي دراسة كل الخصائص مقلص والسلبي. وغالبا ما يثير الشبهة خصائص مقلص و / أو السلبي الميكانيكية للعضلة في أمراض العضلات. وخير مثال هو ضمور العضلات دوشين (DMD)، والعضلات الهزال الشديد المرض الناجم عن نقص dystrophin 3. Dystrophin هو المتواجد هيكل الخليةفي هذا استقرار غشاء الخلية العضلية (غمد الليف العضلي) خلال 4 تقلص العضلات. في غياب dystrophin، تلف غمد الليف العضلي بسبب قوة القص ولدت أثناء الإرسال القوة. تمزق هذا الغشاء يبدأ سلسلة من ردود الفعل التي تؤدي إلى موت الخلايا العضلية وفقدان آلات مقلص. ونتيجة لذلك، يتم تقليل قوة العضلات ويتم استبدال الأنسجة myofibers برصاص تليفي 5. هذا التغيير في وقت لاحق يزيد تصلب العضلات 6. القياس الدقيق لهذه التغيرات توفر مرشدا هاما لتقييم تطور المرض وتحديد الفعالية العلاجية من الجينات رواية / خلية / التدخلات الدوائية. هنا، نقدم طريقتين لتقييم خصائص كل مقلص والسلبية الميكانيكية للأصابع الطويلة الباسطة (EDL) العضلات وخصائص مقلص من العضلات الظنبوبي (TA) الأمامي.

النتائج التالية هي تمثيل من تقاريرنا السابقة 6،9. يتم عرض البيانات كما يعني ± الخطأ القياسي من الوسط. ويبين الجدول 3 خصائص المظهرية من العضلات في مؤسسة كهرباء لبنان BL10 العادية والتي تعاني من نقص dystrophin (MDX) في الفئران 4 إلى 6 أشهر من العمر. ويبين الشكل 4 ممثل خصائص مقلص والسلبي لل EDL العضلات من BL10 وMDX الفئران. ويرد وصف خصائص مقلص للعضلات من قبل مؤسسة كهرباء لبنان على النحو التالي بما في ذلك (القوة المطلقة مقسوما على CSA) محددة قوة نشل (الشكل 4A)، محددة القوة القصوى تكززي (الشكل 4B)، TPT و½ RT القوة المطلقة القصوى تكززي (الشكل 4C وD). ويمكن للTPT ½ RT أيضا حساب من القوة المطلقة نشل. الملف الشخصى الإجهاد والانفعال (4E الشكل) وSRR (4F الشكل) علىإعادة استخدامها لوصف خصائص السلبي للعضلات EDL. غياب dystrophin له تأثير كبير على خصائص مقلص والسلبي للعضلات EDL 6،9. تتضاءل إلى حد كبير نشل محددة وقوات تكززي في العضلات EDL MDX. وTPT هو أسرع بكثير في حين أن RT ½ أبطأ بشكل ملحوظ في العضلات EDL MDX. الملف الشخصى الإجهاد والانفعال يوحي أن يتم زيادة كبيرة تصلب في العضلات EDL MDX. العضلة EDL MDX ينتج أيضا قوة المقاومة بشكل كبير أعلى بكثير (الإجهاد السلبي) قبل الوصول إلى ذروة التوتر، في حين أن الضغوط ما بعد الذروة تنخفض أسرع بكثير. علاوة على ذلك، كان أعلى بكثير SRR في العضلات EDL MDX مقارنة بما كان عليه في العضلات EDL BL10. التحليل الإحصائي ويتم تحليل دلالة إحصائية بين مجموعتين من الطلاب اختبار t. لياليويوصى أهمية tatistical بين مجموعات متعددة، في اتجاه واحد أو اتجاهين تحليل ANOVA تليها تحليل Bonferroni مخصصة آخر باستخدام برنامج SAS (SAS معهد شركة، كاري، NC). ويعتبر فارقا كبيرا عندما p &lt;0.05. الجدول 1. المواد والمعدات. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> تجربة </td><td class="jove_content_small"> يستريح التوتر (غرام) </td><td class="jove_content_small"> نبض التردد (هرتز) </td><td class="jove_content_small"> نبض العرض (MS) </td><td class="jove_content_small"> مدة التحفيز (MS) </td><td class="jove_content_small"> تمتد طول </td><td class="jove_content_small"> تمتد مدة (MS) </td><td class="jove_content_small"> تمتد معدل </td><td class="jove_content_small"> تعليقات </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. تقييم خصائص مقلص والسلبي من الجسم الحي العضلات السابقين EDL </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 قياس خصائص مقلص للعضلات EDL </td></tr><tr><td> 1. تسخن </td><td> 1.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> ضع العضلات لمدة 60 ثانية بين كل الحوافز. هذه الانقباضات الأولية تكززي استقرار العضلات لقياسات لاحقة. </td></tr><tr><td> 2. الأمثل طول العضلات (لو) </td><td> 0.5، 1.0، 1.5 و 2.0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> يسمح للعضلات بالاسترخاء لمدة 30 ثانية بين كل الحوافز. قياس طول العضلات الأمثل باستخدام الفرجار الرقمية. </td></tr><tr><td> 3. واحد التويTCH القوة (PT) </td><td> ضبط التوتر يستريح إلى LO </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. كزازي العضلات القوة </td><td> ضبط التوتر يستريح إلى LO </td><td> 50، 80، 100، 120، 150 و 200 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> يسمح للعضلات بالاسترخاء لمدة 1 دقيقة بين كل الحوافز. تحديد وتيرة القصوى التي تولد قوة مطلقة تكززي (بو). </td></tr><tr><td> 5. غريب الأطوار الانكماش </td><td> ضبط التوتر يستريح إلى LO </td><td> استخدام التردد الذي يولد قوة تكززي الأقصى (بو) </td><td> 0.2 </td><td> 700 </td><td> 10٪ لو </td><td> مشاركة 200 مللي ثانية من مدة التحفيز </td><td> 0،5 لو / ثانية </td><td> تكرار انكماش غريب الأطوار لمدة 10 دورات مع بقية حد أدنى 2 بين الدورات. </td></tr><tr><td> 6. CSA من العضلات EDL </TD&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (كتلة العضلات (ز) / [1.06 غ / سم 3 × (لو X 0.44)]. 1،06 جم / سم 3 هو كثافة العضلات و 0.44 هو طول الألياف العضلية EDL للو النسبة. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 قياس الخصائص السلبية للعضلة EDL </td></tr><tr><td> 1. ست خطوات تمتد البروتوكول </td><td> ضبط التوتر يستريح إلى LO </td><td></td><td></td><td></td><td> 10٪ لو </td><td></td><td> 2 سم / ثانية </td><td> تكرار بروتوكول تمتد بزيادة قدرها 10٪ حتى لو تم التوصل 160٪ لو. Alow 1.5 ثانية تمتد بين دورات. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> ضبط التوتر يستريح إلى LO </td><td></td><td></td><td></td><td> 10٪ لو </td><td></td><td> 2 سم / ثانية </td><td> ويحسب بقسمة SSR الفرق في الضغط مع رIME المنقضي بين نقطتين زمنيتين في إطار زمني. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2.3 قياس خصائص مقلص للعضلات TA </td></tr><tr><td> 1. تسخن </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> ضع العضلات لمدة 60 ثانية بين كل الحوافز. </td></tr><tr><td> 2. الأمثل طول العضلات (لو) </td><td> 3.0، 4.0، 5.0، 6.0 و 7.0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> يسمح للعضلات بالاسترخاء لمدة 30 ثانية بين كل الحوافز. قياس طول العضلات الأمثل باستخدام الفرجار الرقمية. </td></tr><tr><td> 3. CSA من العضلات TA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (كتلة العضلات (ز) / [1.06 غ / سم 3 × (لو X 0.6)]. 0،6 هو طول الألياف العضلية TA لرا لوتيو. </td></tr></tbody></table> الجدول 2. معلمات لتقييم الخواص الميكانيكية للعضلات وEDL TA. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> توتر </td><td> العمر (شهر) </td><td> وزن الجسم (ز) </td><td> EDL الوزن (ملغ) </td><td> لو EDL (مم) </td><td> EDL CSA (مم 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32،03 ± 0،57 </td><td> 13،90 ± 0،77 </td><td> 14،09 ± 0.04 </td><td> 2.12 ± 0.12 </td></tr><tr><td> MDX </td><td> 6 </td><td> 35،44 ± 0،42 * </td><td> 16،73 ± 0،42 * </td><td> 13،93 ± 0.05 * </td><td> 2.57 ± 0.07 * </td></tr></tbody></table> الجدول 3. خصائص المظهرية للعضلة EDL. *، القيمة في MDالفئران X يختلف كثيرا عن أن من هم في سن المتطابقة BL10 الفئران. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> الشكل 1. رسم تخطيطي للمجلس الماوس تشريح حسب الطلب. ويتكون المجلس من زجاج شبكي تشريح ½ بوصة سميكة وكانت ملفقة في متجر المؤسسية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="الشكل 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; الشكل 2. هذه سلسلة من الصور الرقمية التي تبين الخطوات من ربط عقدة مزدوجة مربع تليها عقدة حلقة في MTJ. النجمة، في<html> EDL العضلات؛ السهم، في وتر العضلات القاصية من مؤسسة كهرباء لبنان. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="الشكل 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; الشكل 3. تم تصميم رسم تخطيطي لمنصة مصنوعة خصيصا لفي الموقع TA العضلات فحص وظيفة. منصة الحيوان وزجاج شبكي الركبة الصلب غير القابل للصدأ حامل لتحميل على جهاز الماوس 809B في الموقع. *، الفولاذ المقاوم للصدأ قضيب (القط # MPR-2.0 ، Siskiyou، المنح باس، OR)؛ #، حامل قطب كهربائي العالمي (القط # MXB، Siskiyou، المنح باس، OR)؛ §، قضيب القطب المرفقات (القط # MPR-3.0، Siskiyou، المنح باس، OR)؛ **، Sylgard كتلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . GE = &quot;دائما&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="الشكل 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; الشكل 4. ممثل النتائج للخصائص مقلص والسلبي من العضلات EDL. خصائص مقلص للعضلات EDL تتميز القوة نشل محددة (A)، وقوة تكززي محددة (B)، ووقت لذروة التوتر (C) والوقت الاسترخاء نصف (D). يتم تقييم خصائص السلبي للعضلات EDL من الإجهاد الشخصي سلالة (E) وSSR لل. * والفئران MDX تختلف اختلافا كبيرا من العمر المتطابقة BL10 الفئران.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice at JoVE.com

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

التغييرات في خصائص الطرف العضلات مقلص الميكانيكية والسلبية هي المؤشرات الحيوية الهامة لأمراض العضلات. يصف هذا المخطوط المقايسات الفسيولوجية لقياس هذه الخصائص في الطويلة الباسطة لأصابع الفئران والعضلات الأمامية الظنبوبي.

تقييم وظيفة عضلة من العضلات الباسطة لأصابع الطويلة<em&gt; خارج الجسم</em&gt; العضلات الظنبوبي الأمامي و<em&gt; في الموقع</em&gt; في الفئران

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

evaluation-muscle-function-extensor-digitorum-longus-muscle-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

41.8K Views.  University of Missouri. التغييرات في خصائص الطرف العضلات مقلص الميكانيكية والسلبية هي المؤشرات الحيوية الهامة لأمراض العضلات. يصف هذا المخطوط المقايسات الفسيولوجية لقياس هذه الخصائص في الطويلة الباسطة لأصابع الفئران والعضلات الأمامية الظنبوبي.

Video: Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

في القياس الصغير تداول المجراة في الهيكل العظمي والعضلات التي البينية الحيوية الميكروسكوب

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

إجراءات الجرذ<em&gt; في الموقع</em&gt; خصائص العضلات الهيكلية مقلص

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج من انتشار الخلايا العضلية السلس والوظيفة البطانية

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

بروتوكول الآلي السريع لالعضلات تحليل الألياف السكان في الجرذ العضلات المقاطع العرضية عن طريق سلسلة الميوسين الثقيلة المناعية

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

في الموقع تلطيخ إمونوفلورزنت من البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...