עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (AR-49419, DD), ניוון שרירים אגודים (DD), והכשרת NIH מענק T90DK70105 (CH).

1. הערכה של נכסים וההתכווצות פסיביים של vivo לשעבר השריר אדי מאפייני ההתכווצות ופסיביים של שריר האד נמדדים vivo לשעבר באמצעות אורורה המדעית במערכת בדיקת שריר המבחנה. עיין בטבלת המס &#39;1 לחומרים וציוד. הכנת ציוד 1.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את אמבטית רקמות האיבר ידי הבטחת oxytube לאמבטית רקמת מי מעייל. צרף האמבטיה כנסה למנגנון השרירים הגוברים. חבר את קו הגז לoxytube. הדק את קווי זרימת מים לאמבטית רקמת מי מעייל ולמקם את שסתום המחט לניקוז האמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מי אמבטית המחזור ולהתאים את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס 7. אפשר 5 PSI (ק&quot;ג לסנטימטר רבוע) של 95% O CO 2 -5% 2 לזרום דרך oxytube. מלא את האמבטיה בחיץ רינגר. לאזן חיץ לפחות10 דקות עם זרימת גז קבועה על ידי התאמת שסתום oxytube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשירים (ממריץ, מערכת מנוף מצב כפול, וממשק אות). טען את השריר השולט על תוכנה הדינמית (DMC) בהתאם להוראתו של היצרן. </li></ol> נתיחת שריר 1.2 אדי כל המחקרים בבעלי החיים חייבים להיות מאושרים על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדה ושימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר עם הזרקת intraperitoneal של 2.5 μl / משקל גוף גרם קוקטייל ההרדמה (ראה סעיף חומרים). לאורך כל ההליך כירורגי, העומק של הרגעה נבדק על ידי ביצוע קמצוץ בוהן. תוספת של 10% ממינון ההרדמה הראשונית מנוהלת בעת צורך לשמור על בעלי החיים תחת הרדמה. גילוח האיבר האחורי. לשמור על טמפרטורת ליבת הגוף על 37 מעלות צלזיוס לפני הליך נתיחה על ידי צבת העכבר על משטח חימום. טמפרטורת הגוף מבוקרת על ידי המדידה רקטלית temperat כל הזמןיור באמצעות בדיקה תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר שכיבה על קרש החיתוך (איור 1). לקלף את עור הרגל לחשוף את שרירי הגפיים האחוריים. אבטח את הרגל ברחוב sylgard באמצעות שתי סיכות תופרות, אחד ברגל והשני בשריר gracilis. מקם מנורת חום מעל גוף העכבר כדי לשמור על טמפרטורת גוף הליבה ב 37 ° C. כל זמן superfuse כל השרירים שנחשפו עם חיץ רינגר. מסנן חיץ עודף באמצעות קו ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את גיד ת&quot;א דיסטלי ורצועות פושטים תחת stereomicroscope על ידי ביתור העור לכיוון כף הרגל. בעדינות להסיר את כיסוי fascia שרירי ת&quot;א. חותך את רצועות פושטים לשחרר את גיד ת&quot;א דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד ת&quot;א הדיסטלי ומשתמש בו כדי לקלף את שרירי ת&quot;א. מוציא בזהירות את שרירי ת&quot;א בקובץ המצורף הפרוקסימלי שלה. מניח חתיכה דקה של הכותנה הספוגה החיץ של רינגר ליד שריר אדי לספוג דימום שנגרם על ידי הקרע של כלי דם שרירי ת&quot;א. שימוש בקו הוואקום כדי להסיר חיץ ודם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור קשרים מרובעים כפולים אחרי קשר לולאה באמצעות תפרי משי לחם בצומת שריר הגיד (MTJ) של שריר אדי דיסטלי (איור 2). עושה חתך בחלק הדיסטאלי של שריר biceps femoris לחשוף שרירי אדי הפרוקסימלי. חזור על אותה הקבוצה של קשר (איור 2) בMTJ של גיד אדי הפרוקסימלי. צרף וו זרוע מנוף לאו הפרוקסימלי או את קשרי דיסטלי עם קשר מרובע כפול באמצעות אותו קו התפר. הוא ניתק את קו התפר שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד אדי הפרוקסימלי העדיף על קשר התפר הפרוקסימלי. הרם את שריר האד עם הוו ולחתוך את כלי הדם מתחת לשריר. חותך את גיד אדי דיסטלי הנחות קשר התפר דיסטלי כדי להסיר את שריר האד מהאיבר האחורי. כריכה האחורי האיבר החשוף בפיסת הכותנה הספוגה חיץ רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הקרס לזרוע המנוף. יישר את השרירים אנכייםבין שתי אלקטרודות. לאבטח את קו תפר דיסטלי לתפקיד הקבוע. הרם את אמבטית הרקמה לשקע את השרירים בחיץ רינגר. כוון את מתח המנוחה ל1.0 גרם באמצעות שלב התרגום גס / עדין הכפול ולאפשר לשריר לאזן לפחות 10 דקות. </li></ol> 1.3 מדידת תכונות ההתכווצות ופסיביות של שריר אדי השתמש בטבלה 2 כדי להגדיר את הפרמטרים בתוכנת ד&quot;ש לכל אחת מהמדידות הבאות. לנתח את הנתונים באמצעות ניתוח השרירים הדינמי (DMA) תוכנה. 1.3.1 מדידת תכונות ההתכווצות של שריר אדי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את שריר אדי שלוש פעמים ב 150 הרץ עם 60 שניות זו מזו כדי לייצב את השרירים 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את שריר האד במתחי מנוחה שונים כדי לקבוע את האורך האופטימלי (Lo). האורך האופטימלי הוא האורך שבו שריר מתפתח מתח עווית מרבית. לאפשר לשרירלהירגע במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את מתח המנוחה ללו. מדוד כוח השריר בעווית גירוי יחיד. לקבוע את הכח המוחלט העווית (PT), זמן למתח שיא (TPT) וזמן הרפית מחצית (½ RT) של Pt. לאפשר לשריר לנוח למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את מתח המנוחה ללו. מדוד כוח שרירי tetanic נוצר גירוי בתדרים שונים (50, 80, 100, 120, 150 ו 200 הרץ). לקבוע את הכח המוחלט המקסימאלי tetanic השריר (פו) שבו כוח השריר מגיע מקסימאלי. מדוד את TPT ו½ RT של 9 פו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לשריר לנוח למשך 5 דקות. כוון את מתח המנוחה ללו. החל 10 מחזורים של התכווצויות אקסצנטריות עם מנוחת 2 דקות בין המחזורים. לחשב את אובדן כוחו היחסי של פו אחרי כל מחזור של כיווץ אקסצנטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק שריר האד מהמכשיר וחתך את הגידים באתר התפר. לקבוע את המשקל הרטוב השריר ולחשב את שטח חתך השריר הנגדי (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 מדידת התכונות הפסיביות של שרירי אדי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתח את שרירי אדי הנגדיים ולצרף אותו למכשיר, כמתואר בסעיף 1.2, על שלבי 2 עד 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא שרירי האד לפרוטוקול מתיחת שישה שלב שבו השריר מתוח עד 160 Lo% עם תוספת של Lo 10%. נתח 6 פרופיל מתח המתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הנכס הצמיג של שריר האד על ידי מדידת קצב הרפית המתח (SRR) במסגרות הזמן הבאות לאחר המתיחה ומחזיק את השריר ב10% Lo: מפסגה ל0.1s לאחר השיא (PP), מ -0.1 ל 0.2s עמ &#39;, בין 0.2 ל 0.5s עמ&#39;, בין 0.5 ל 1s pp ובין 1 ל 1.5s עמ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף המחקר, להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר רחם ו / או עריפה בעוד העכבר הוא עדיין מורדם. ניתוק שריר האד מהמכשיר וחתך את הגידים באתר התפר. לקבוע את המשקל הרטוב השריר ולחשב את השריר הנגדי seאזור ctional (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. הערכה של מאפייני ההתכווצות של שריר ת&quot;א באתר מאפייני ההתכווצות של שריר ת&quot;א נמדדים באורורה המדעית במערכת בדיקת שריר אתר. עיין בטבלת המס &#39;1 לחומרים וציוד. הכנת ציוד 2.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את השלב החייתי תרם המבוקר עד 37 מעלות צלזיוס שימוש במי האמבטיה במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשירים (ממריץ, מערכת מנוף מצב כפול, וממשק אות). טען את תוכנת DMC פי ההוראות של היצרן. </li></ol> 2.2 הכנה של השריר בת&quot;א למדידת כוח אתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר, לגלח את האיבר האחורי ולחשוף את שרירי ת&quot;א כמתוארת בשלבי 1 עד 3 בסעיף 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור קשר מרובע כפול סביב הרצועה USI הפיקהng תפר משי לחם. לקשור קשר מרובע כפול אחרי קשר לולאה בMTJ של שריר ת&quot;א דיסטלי (איור 2), לקשור קשר מרובע כפול נוסף עוזב ~ לולאת 10 מ&quot;מימ מפקעת גיד ת&quot;א דיסטלי באמצעות אותו קו התפר. הנח את הקשר המרובע הכפול השני בצד של הלולאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסיכות מהאיבר האחורי ולמקם את החיה מועדת. לחשוף את שרירי femoris רירי. עושה חתך בקו האמצע כדי לחשוף את גיד הנשה. לקשור קשר מרובע כפול סביב הקצה הפרוקסימלי של עצב הירך. חתוך צד אחד מקווי התפר וחותך את העצבים העדיפים על הקשר. בעדינות, מושך את גיד הנשה לכיוון הברך באמצעות קו התפר ולנקות את הרקמה הסובבת חיבור לחופשי ~ 5 מ&quot;מ אורכו. אל תמתח עצב במהלך הליך זה וכל זמן superfuse העצב עם חיץ צלצול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שרירי ת&quot;א הנגדיות כמתוארים בשלבים 1 עד 3. כריכה אחת הגפיים האחוריים החשופים בפיסת הר&quot;י<html> החיץ של nger ספוג כותנה. כל זמן superfuse שני גפיים אחוריים עם מראש התחמם (37 ° C) חיץ רינגר. הסר חיץ עודף באמצעות קו ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את בעלי החיים נוטים על הפלטפורמה של בעלי החיים. צרף בעל מהדק הברך לפלטפורמת החיה ולאבטח את שתי ברכיים לסיכת המתכת עם קשרים כפולים מרובעים באמצעות קווי תפר רצועות הפיקה. הצמד את שתי רגליו על בלוק sylgard באמצעות סיכות תופרות. אבטח את פלטפורמת חיה על הבמה תרמה המבוקרת. מקם מנורת החום כדי לשמור על טמפרטורת גוף ליבת חיה על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את מחזיק האלקטרודה לפלטפורמת החיה ולהניח את גיד הנשה על האלקטרודה באמצעות קו התפר. שמור את האלקטרודה הרחק מרירי הגפיים האחוריים. חותך את גיד ת&quot;א הדיסטלי של הגפיים האחוריים שנחשפו באתר MTJ התפר. צרף לולאת תפר גיד ת&quot;א דיסטלי לוו זרוע המנוף. כסה את שרירי הגפיים האחוריים החשופים עם הכותנה הספוגה החיץ של רינגר חם. </li></ol>&gt; 2.3 מדידת תכונות ההתכווצות של שריר ת&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטבלה 2 להגדיר את הפרמטרים בתוכנת DMC. עקוב באותו הפרוטוקול שתואר בסעיף 1.3.1 כדי לקבוע את תכונות ההתכווצות של שריר ת&quot;א. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת DMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מדידת רכוש כויץ, לנתק את לולאת דיסטלי ת&quot;א גיד התפר מוו זרוע הפלס. הסר את שרירי ת&quot;א. לקבוע את המשקל הרטוב השריר ולחשב CSA 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את תכונות ההתכווצות של השריר הנגדי ת&quot;א לפי שלבים 1 עד 3 שתואר לעיל. להרדים את העכבר על פי הנחיות מוסדיות בסוף המחקר. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בפרוטוקול זה, יש לנו מאויר מבחנים פיסיולוגיים למדידת שריר edl ואת מאפייני ההתכווצות של שריר ת&quot;א את מאפייני התכווצות ופסיביים. דאגה עיקרית בלימודי פיזיולוגיה של שרירים היא החמצון של שריר המטרה. לשרירים גדולים (כגון שרירי ת&quot;א), בגישה באתרו עדיף מכיוון דיפוזיה חמצן מהמאגר של רינגר לא יכולה להגיע למרכז של השריר בבדיקת מבחנה. בגישת אתרו לא מפריע לאספקת דם נורמלית והיפוקסיה הקשורים השפעות מלאכותיות הם נמנעו. שרירי האד הוא אחד מהשרירים הנפוצים ביותר במחקר פיזיולוגיה. חמצון נאות של כל השרירים יכול להיות מושג במערכת במבחנה בגלל הגודל הקטן של השרירים. יתר על כן, במערכת המבחנה מספקת סביבה סגורה כדי לתפעל את הריכוזים של יונים (Ca 2 +, Na + ו K +) וחמיםרישיונות CAL (ATP וגלוקוז) הנדרשים לייצור כוח שריר אופטימלי. זה מציע הזדמנות מצוינת לבחון את ההשפעה של משתנים אלו על ייצור כוח. מדידה מדויקת של תכונות התכווצות ופסיביות של שרירי הגפה היא קריטית כדי ללמוד לתפקד שריר שלד. שינויים אופייניים של נכסים אלה נחשבים לעתים קרובות כסימני ההיכר של מחלות שרירים שונות. שינויים בפרמטרים אלה הם גם מדדים חשובים כדי לקבוע אם טיפול ניסיוני הוא יעיל או לא.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר </td><td> יצרן </td><td></td><td> מפרטים והערות </td></tr><tr><td> אמבטית רקמות איבר </td><td> מיקלוש רדנוטי כבר LLC, קליפורניה, ארה&quot;ב </td><td></td><td> אמבט מים-מעייל רקמה (מק&quot;ט 158351-LL), צינור חמצן disperser (Cat # 160192), שסתום luer (חתול # 120722) </td></tr><tr><td> במחזור אמבט מים </td><td> הפישר סיינטיפיק, Waltham, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תערובת גז </td><td> Airgas הלאומי, שרלוט, צפון קרוליינה, ארה&quot;ב </td><td></td><td> 95% O 2 ו 5% CO 2 </td></tr><tr><td> במנגנון בדיקת תפקוד שרירי המבחנה </td><td> אורורה המדעית, אורורה, ON, קנדה </td><td></td><td> המערכת מורכבת ממערכת מנוף מצב הכפול (דגם # 300C או 305C) ממריץ (דגם # 701A), ממשק אות (דגם # 604B) ומבחן apparatus (דגם # 800A) להר אנכי אמבטית איבר רקמה </td></tr><tr><td> בתוכנת בדיקת תפקוד שרירי מבחנה </td><td></td><td></td><td> שריר שליטת תוכנה דינמית (DMC) וניתוח נתוני שליטה בשרירים דינמי (DMA) תוכנה </td></tr><tr><td> קוקטייל הרדמה מאוסה מעורב ב0.9% NaCl </td><td> עיין בהנחיות המוסדיות </td><td></td><td> קטמין (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל), xylazine (2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) וacepromazine (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל). לאורך כל ההליך כירורגי, תוספת של 10% מהמינון ההתחלתי עשויה להיות נחוצה כדי לשמור על בעלי חיים תחת הרדמה. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> מכשיר דיוק העולם </td><td> חתול # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> קרש חיתוך פרספקס מחוייט </td><td> בבית תוכנן </td><td></td><td> עיין באיור 1 </td></tr><tr><td> מנורת חימום </td><td> חברת תאורה מותחת,בוסטון, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב </td><td></td><td> מנורת 15 ואט כדי לשמור על חם במהלך נתיחת העכבר </td></tr><tr><td> המאגר של רינגר </td><td> כימיקלים נרכשים מפישר סיינטיפיק, Waltham, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב </td><td></td><td> רכב במ&quot;מ: 1.2 nah 2 PO 4 (חתול # S369), 1 MgSO 4 (חתול # M63), 4.83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (מק&quot;ט 217), 24 3 NaHCO (Cat # S233), 2 CaCl 2 (החתול # C79) וגלוקוז 10 (מק&quot;ט D16). ממס כימיקלים בנפרד ולערבב לפי הסדר הרשום לעיל. לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ לנתח סטריאו </td><td> ניקון, מלוויל, ניו יורק, ארה&quot;ב </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כלי נתיחה </td><td> כלי מדע פיין, הפוסטר סיטי, קליפורניה, ארה&quot;ב </td><td></td><td> מלקחיים גסים, מספריים גסים, מלקחיים עדינים (סטרייט וזווית של 45 °) </td></tr><tr><td> תפר משי קלוע # 4-0 </td><td> SofSilk USSC סוtures, Norwalk, CT, ארה&quot;ב </td><td> חתול # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> וו נירוסטה בהזמנה אישית </td><td> חלקים קטנים, Inc </td><td></td><td> 2&#39;&#39; ארוך S / S 304V (0.18&#39;&#39; קוטר) למתמר הכח 305C או 2.5&#39;&#39; הארוך S / S 304V (0.012&#39;&#39; קוטר) למתמר 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> במערכת assay תפקוד שרירי אתר </td><td> אורורה המדעית, אורורה, ON, קנדה </td><td></td><td> המערכת (809B, במנגנון עכבר אתר) מורכבת ממערכת מנוף מצב הכפול (דגם # 305C) ממריץ (דגם # 701B), ממשק אות (דגם # 604A) ומנגנון אדן מבוקר תרם (דגם # 809A ) </td></tr><tr><td> בתוכנת בדיקת תפקוד שרירי מבחנה </td><td> אורורה המדעית, אורורה, ON, קנדה </td><td></td><td> שריר שליטת תוכנה דינמית (DMC) וניתוח נתוני שליטה בשרירים דינמי (DMA) תוכנה </td></tr><tr><td> פלטפורמת חית מחוייט ת&quot;א assay </td><td> בבית תוכנן </td><td></td><td> עיין באיור 2 </td></tr><tr><td> וו נירוסטה בהזמנה אישית </td><td> חלקים קטנים, Inc </td><td> החתול # ASTM A313 </td><td> 0.5&#39;&#39; הארוך S / S 304V (0.18&#39;&#39; קוטר) </td></tr><tr><td> אלקטרודות פלטינת 25G מחוייט </td><td> Enterprises Chalgren, גילרוי, קליפורניה </td><td></td><td> הלחמת 2 0.016&#39;&#39; חוטי פלטינה עבה לשני 24G חוטי חשמל </td></tr></tbody></table> טבלת 1. חומרים וציוד.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

תנועות גוף ניתנות בעיקר על ידי תפקוד מכאני של שריר השלד. שרירי שלד מורכבים מצרורות רבות של myofibers המכוסים ברקמות חיבור תוך שרירית. כל myofiber מכיל הרבה myofibrils הפועל longitudinally לאורך myofiber. Myofibrils הם מנגנון ההתכווצות של שריר והם מורכבים מיחידות חוזרות המכונות התכווצות sarcomeres. יחידת sarcomere מכילה סיבית יקטין ומיוזין שהם מרווחים על ידי דיסקי Z וחלבון titin. תפקוד מכאני של שריר השלד מוגדר על ידי מאפייני התכווצות ופסיביים של שרירים. מאפייני ההתכווצות משמשים כדי לאפיין את כמות הכח שנוצרה במהלך התכווצות שרירים, שעת יצירת כוח והזמן של הרפיית שרירים. כל גורם המשפיע על התכווצות שרירים (כגון אינטראקציה בין סיבי מיוזין, הומאוסטזיס של סידן, יחס ATP / ADP, וכו &#39;ותקטין) משפיע על נכס כויץrties. המאפיינים הפסיביים מתייחסים לתכונות האלסטיות וצמיגות (נוקשות וצמיגות) של השריר בהעדר ההתכווצות. נכסים אלו נקבעים על ידי תאיים והרכיבים המבניים התאיים (כגון titin) ורקמות חיבור (בעיקר קולגן) 1-2. מאפייני ההתכווצות ופסיביים הם שני היבטים בלתי נפרדים מתפקוד שרירים. לדוגמה, כיפוף מרפק מושג על ידי התכווצות של שרירים בתא הקדמי של הזרוע העליונה ומתיחה פסיבית של שרירים בתא האחורי של הזרוע העליונה. כדי להבין באמת תפקוד שרירים, שני מאפייני ההתכווצות פסיביים וצריכים ללמוד. התכונות המכאניות ההתכווצות ו / או פסיביות של שרירים לעתים קרובות נפגעים במחל שרירים. דוגמה טובה היא ניוון שרירים דושנו (DMD), שרירים חמורים מבזבזים את המחלה הנגרמת על ידי המחסור בדיסטרופין 3. הדיסטרופין הוא prote cytoskeletalשבמייצב את קרום תא השריר (sarcolemma) במהלך 4 התכווצות שרירים. בהעדר דיסטרופין, sarcolemma ניזוק על ידי כוח הגזירה שנוצר במהלך העברת כוח. קרום זה קורע יוזם תגובת שרשרת שמובילה למוות ואובדן של מכונות התכווצות תאי שריר. כתוצאה מכך, כוח השרירים מצטמצם וmyofibers המת מוחלפים על ידי רקמות fibrotic 5. שינוי זה מגדיל מאוחר נוקשות שרירים 6. מדידה מדויקת של שינויים אלה מספקת מדריך חשוב להעריך את התקדמות מחלה ולקבוע את היעילות טיפולית של גן הרומן / תא / התערבויות תרופתיות. כאן, אנו מציגים שתי שיטות להערכה של שתי התכונות מכאניות וההתכווצות פסיביות של longus extensor digitorum (אדי) שריר ואת מאפייני ההתכווצות של שריר tibialis הקדמי (ת&quot;א).

את התוצאות הבאות הן ייצוג מהדוחות הקודמים שלנו 6,9. נתונים מוצגים כשגיאה מתכוון ± תקן של ממוצע. טבלה 3 מציגה את מאפייני מורפומטריות של שרירי האד בBL10 הנורמלי ועכברים דיסטרופין-לקויים (MDX) ב4 עד 6 חודשים של גיל. איור 4 מראה תכונות התכווצות פסיביות ומייצגות של שרירי edl מ BL10 וMDX עכברים. מאפייני ההתכווצות של שריר אדי מתוארים לתנאים הבאים כוללים (כוח המוחלט מחולק בCSA) הספציפי כוח העווית (איור 4 א), כוח tetanic מקסימאלי מסוים (איור 4 ב), וTPT ½ RT של כוח tetanic המקסימאלי המוחלט (האיור 4C ו-D). TPT ו½ RT ניתן גם לחשב מכוח העווית המוחלטת. פרופיל מתח המתח (4E איור) וSRR (4F איור)מחדש המשמש לתיאור המאפיינים הפסיביים של שרירי האד. היעדר דיסטרופין יש השפעה משמעותית על תכונות התכווצות ופסיביות של שריר אדי 6,9. עווית מסוימת וכוחות tetanic מופחתים באופן משמעותי בשריר אדי MDX. TPT הוא באופן משמעותי מהר יותר תוך ½ RT הוא איטי באופן משמעותי בשריר אדי MDX. פרופיל מתח המתח עולה כי קשיחותו גדלה באופן משמעותי בשריר אדי MDX. שרירי אדי MDX גם תשואות כוח התנגדות משמעותית הרבה יותר גבוה (מתח פסיבי) לפני שהגיע לשיא המתח, ואילו לחצים לאחר השיא לרדת הרבה יותר מהר. יתר על כן, SRR היה גבוה באופן משמעותי בשריר אדי MDX בהשוואה לזו של שריר אדי BL10. ניתוח סטטיסטי מובהקות סטטיסטיות בין שתי קבוצות מנותחות על ידי מבחן t סטודנטים. ליםמשמעות tatistical בקרב קבוצות מרובות, לכיוון אחד או ניתוח ANOVA דו כיוונית ואחרי ניתוח שלאחר הוק Bonferroni מומלצת באמצעות תוכנת SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC). הבדל נחשב משמעותי כאשר p &lt;0.05. טבלת 1. חומרים וציוד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> ניסיון </td><td class="jove_content_small"> מתח מנוחה (גרם) </td><td class="jove_content_small"> דופק תדר (רץ) </td><td class="jove_content_small"> רוחב פולס (ms) </td><td class="jove_content_small"> משך גירוי (ms) </td><td class="jove_content_small"> אורך למתוח </td><td class="jove_content_small"> למתוח משך (ms) </td><td class="jove_content_small"> שיעור למתוח </td><td class="jove_content_small"> תגובות </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. הערכה של נכסים והתכווצות פסיביים של השרירים vivo לשעבר אדי </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 מדידת תכונות ההתכווצות של שריר אדי </td></tr><tr><td> 1. להתחמם </td><td> 1.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> הנח את השרירים עבור 60 שניות בין כל גירוי. התכווצויות tetanic ראשוניות אלה לייצב את השרירים למדידות באות. </td></tr><tr><td> 2. אורך שריר אופטימלי (Lo) </td><td> 0.5, 1.0, 1.5 ו -2.0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> לאפשר לשריר לנוח למשך 30 שניות בין כל גירוי. מדוד את אורך השריר האופטימלי באמצעות קליפר דיגיטלי. </td></tr><tr><td> 3. טוויים יחידיםtch כוח (PT) </td><td> התאם מתח מנוחה ללו </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. כוח השרירים Tetanic </td><td> התאם מתח מנוחה ללו </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 ו 200 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> לאפשר לשריר לנוח לדקה 1 בין כל גירוי. לקבוע את התדירות שיוצרת tetanic הכח המוחלט המקסימאלי (פו). </td></tr><tr><td> 5. כיווץ אקסצנטרי </td><td> התאם מתח מנוחה ללו </td><td> השתמש בתדר שיוצר כוח tetanic המרבי (פו) </td><td> 0.2 </td><td> 700 </td><td> 10% Lo </td><td> אחרונות 200 מילישניות של משך הגירוי </td><td> 0.5 Lo / שני </td><td> חזור על הכיווץ האקסצנטרי במשך 10 מחזורים עם 2 דקות מנוחה בין המחזורים. </td></tr><tr><td> 6. CSA של שריר אדי </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (מסת שריר (ז) / [1.06 גר &#39;/ 3 סנטימטר (Lo x 0.44)]. 1.06 / סנטימטר גרם 3 הוא צפיפות השריר ו0.44 הם אורך סיבי שריר אדי ללו יחס. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 מדידת התכונות הפסיביות של שרירי אדי </td></tr><tr><td> 1. שישה צעד מתיחת פרוטוקול </td><td> התאם מתח מנוחה ללו </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 סנטימטר / שני </td><td> חזור על פרוטוקול מתיחות עם תוספת של 10% עד Lo Lo 160% הוא הגיע. Alow 1.5 שניות בין מחזורי מתיחה. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> התאם מתח מנוחה ללו </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 סנטימטר / שני </td><td> SSR מחושב על ידי חלוקת ההבדל במתח עם tIME חלף בין שתי נקודתי זמן במסגרת זמן. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2.3 מדידת תכונות ההתכווצות של שריר ת&quot;א </td></tr><tr><td> 1. להתחמם </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> הנח את השרירים עבור 60 שניות בין כל גירוי. </td></tr><tr><td> 2. אורך שריר אופטימלי (Lo) </td><td> 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 ו -7.0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> לאפשר לשריר לנוח למשך 30 שניות בין כל גירוי. מדוד את אורך השריר האופטימלי באמצעות קליפר דיגיטלי. </td></tr><tr><td> 3. CSA של שריר ת&quot;א </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (מסת שריר (ז) / [1.06 גר &#39;/ 3 סנטימטר (Lo x 0.6)]. 0.6 הם אורך סיבי שריר ת&quot;א לLo raTio. </td></tr></tbody></table> טבלת 2. פרמטרים להערכה של התכונות המכאניות של שרירי edl ות&quot;א. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> להתאמץ </td><td> גיל (חודש) </td><td> משקל גוף (ז) </td><td> אדי משקל (מ&quot;ג) </td><td> אדי Lo (מ&quot;מ) </td><td> אדי CSA (מ&quot;מ 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32.03 ± 0.57 </td><td> 13.90 ± 0.77 </td><td> 14.09 ± 0.04 </td><td> 2.12 ± 0.12 </td></tr><tr><td> MDX </td><td> 6 </td><td> 35.44 ± 0.42 * </td><td> 16.73 ± 0.42 * </td><td> 13.93 ± 0.05 * </td><td> 2.57 ± 0.07 * </td></tr></tbody></table> לוח 3. מאפייני מורפומטריות של שרירי האד. *, הערך בmdעכברי x הם שונים באופן משמעותי מזה של גיל המתאים-BL10 עכברים. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="איור 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> איור 1. תרשים סכמטי של קרש חיתוך עכבר מחוייט. קרש החיתוך עשוי מפרספקס עבה סנטימטר וחצי והיה מפוברק בחנות המוסדית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="איור 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; איור 2. סדרה של תמונות דיגיטליות המציגות את השלבים של קשירת קשר מרובע כפול אחרי קשר לולאה בMTJ. אסטריסק,<html> שרירי אד; חץ, הגיד הדיסטלי של שריר האד. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="איור 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; איור 3. תרשים סכמטי של הפלטפורמה אישית לבדיקת תפקוד שרירי ת&quot;א אתר. פלטפורמת חית פרספקס ובעל ברך הנירוסטה תוכננו לעלות על 809B במנגנון עכבר אתר. *, מוט נירוסטה (מק&quot;ט MPR-2.0 , Siskiyou, Pass מענקים, OR); # בעל, יוניברסל האלקטרודה (Cat # MXB, Siskiyou, Pass מענקים, OR); §, מוט מצורף האלקטרודה (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Pass מענקים, OR); ** Sylgard בלוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> ge = &quot;תמיד&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="איור 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; איור 4. תוצאות נציג למאפייני ההתכווצות ופסיביים של שריר האד. מאפייני ההתכווצות של שריר אדי מתאפיינים בכח הספציפי העווית (), כוח tetanic הספציפי (ב &#39;), הזמן למתח שיא (C) וזמן הרפית המחצית (ד&#39;). התכונות הפסיביות של שרירי אדי מוערכות על ידי פרופיל מתח המתח (E) וממסר. *, עכברי MDX שונים באופן משמעותי מגיל מתאים BL10 עכברים.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice at JoVE.com

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

שינויים בנכסים והתכווצות שרירי גפיים מכאניים פסיביים הם סמנים חשובים למחל שרירים. כתב יד זה מתאר מבחנים פיסיולוגיים למדידת נכסים אלה בlongus העכברי extensor digitorum ושרירים קדמיים tibialis.

הערכה של תפקוד שרירים של שריר extensor digitorum Longus<em&gt; גופיים</em&gt; ושריר קדמי tibialis<em&gt; באתר</em&gt; בעכברים

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

evaluation-muscle-function-extensor-digitorum-longus-muscle-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

41.8K Views.  University of Missouri. שינויים בנכסים והתכווצות שרירי גפיים מכאניים פסיביים הם סמנים חשובים למחל שרירים. כתב יד זה מתאר מבחנים פיסיולוגיים למדידת נכסים אלה בlongus העכברי extensor digitorum ושרירים קדמיים tibialis.

Video: Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

נהלים לעכברוש<em&gt; באתר</em&gt; מאפייני התכווצות שרירי שלד

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murine אבי העורקים למחוץ פגיעה: יעיל<em&gt; בויבו</em&gt; מודל של תאים שרירים חלקה תפוצת ו אנדותל פונקציה

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...