In addition, we thank the cardiac surgeons at Heidelberg University for the provision of human atrial tissue and Claudia Liebetrau, Katrin Kupser and Ramona Nagel for their excellent technical support. Special thanks also to Andy W. Trafford for his helpful suggestions and advice during the establishment of the Ca2+ transient measurements. The authors wish to express their deepest gratitude to the members of the Department of Pharmacology and Toxicology (head: Ursula Ravens) of the Dresden University of Technology for the opportunity they offered us to learn basic techniques and skills in cellular electrophysiology and cardiomyocyte isolation.
The authors' research is supported by the German Research Foundation (Do769/1-1-3), the German Federal Ministry of Education and Research through the Atrial Fibrillation Competence Network (01Gi0204) and the German Centre for Cardiovascular Research, the European Union through the European Network for Translational Research in Atrial Fibrillation (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, large-scale integrating project, Proposal No. 261057) and the European-North American Atrial Fibrillation Research Alliance (ENAFRA) grant of Fondation Leducq (07CVD03).
The schematic overview shown in the video file was produced using Servier medical art.

تحتاج البروتوكولات التجريبية لتتم الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية وجميع المرضى الذين يحتاجون لإعطاء الموافقة المسبقة عن مكتوب. وقد وافق بحثنا من قبل لجنة أخلاقيات الطبية كلية مانهايم، جامعة هايدلبرغ (# 2011-216N-MA) وأجريت في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية من أجل رفاهية الإنسان. أعطى جميع المرضى الموافقة المسبقة عن مكتوب. 0. الحصول على الأنسجة الأذيني الإنسان خلال الإجراءات الروتينية القسطرة لدى المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح لتجاوز القلب التطعيم، وعادة ما يتم إزالة غيض من احقة الأذين الأيمن، ويمكن استخدامها لعزل العضلية الأذيني. بعد الختان يتم نقل عينات الأنسجة على الفور في أنبوب 50 مل الصقر العقيمة مع كا 2 + خالية حل النقل التي تحتوي على 2،3-butanedione monoxime (الجدول الأول؛ BDM، المانع مقلص، ومنع خلية عضلية جontracture). مع أوقات النقل بين 30 و 45 دقيقة، لم نكن ندرك ميزة واضحة من التبريد أو الأوكسجين فيما يتعلق بكل من عدد ونوعية العضلية الأذيني المعزول. في وسائل النقل العامة إلى المختبر يجب أن تكون سريعة قدر الإمكان. ومع ذلك، إذا لا يمكن تجنبها وقتا أطول والنقل، والنقل في 4 درجات مئوية في حل الاوكسيجين قد يكون من المفيد. 1. Prearrangements <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على thermocirculator، التي تسيطر على درجة حرارة الدورق تغلف (الجدول الثاني). تأكد من أن درجة الحرارة داخل الدورق يساوي 37 درجة مئوية. تغطية الكأس مع غطاء زجاجي للحفاظ على درجة حرارة ثابتة داخل الدورق في جميع مراحل عملية عزل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن كولاجيناز الأول والرابع والعشرون البروتياز إلى ثلاثة أكواب الزجاج وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. سوف تضعف الانزيمات فقط قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن 20 مل من كا 2 + حل الحرة في طبق بتري في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تخزين 250 مل من كا 2 + حل الحرة في حمام الماء عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. تنظيف الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات الأنسجة مع الحل النقل في طبق بتري (~ 10 سم القطر) وإزالة الأنسجة الدهنية تقريبا باستخدام مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن عينة الأنسجة. وتستخدم ما بين 200 و 600 ملغ لعزل الخلية. يمكن تجميد الأنسجة المتبقية في النيتروجين السائل لتحليل الكيمياء الحيوية في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينات الأنسجة في طبق بتري تحتوي على 20 مل كا 2 + حل مجانية في 4 ° C (انظر الخطوة 1.3) وختم عينة الأنسجة إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم 3 في الحجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية عند 37 درجة مئوية وتحت بالغاز المستمر مع 100٪ O 2. غيض ماصة يمكن وضعها على أنبوب الأكسجين لتجنب محتدما قوية وتوليد تدفق الهواء المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قطع الأنسجة جنبا إلى جنب مع كا 2 + خالية حل فيإلى الدورق تغلف ويحرك المزيج بعناية لمدة 3 دقائق مع التحريك المغناطيسي بار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف اثارة والسماح للقطع الأنسجة ليستقر لبضع ثوان. توتر بعناية طاف من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني). إعادة قطع الأنسجة ضبط النفس من شبكة إلى الدورق باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة ملء كوب مع كا 2 + حل حرة وكرر الخطوة غسل 2.4 و 2.5 مرتين. </li></ol> 3. الهضم الأنزيمي الأول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق قطع الأنسجة مع 20 مل إنزيم حل E1 (الجدول الأول) التي تحتوي على كولاجيناز والبروتيني ويقلب بعناية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل للحصول على تركيز النهائي من 20 ميكرومتر كا 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 35 دقيقة سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) بطريقة أن معظم قطع الأنسجة البقاء في الدورق. عودة بقيةأمطرت قطع الأنسجة من شبكة إلى الدورق. </li></ol> 4. الهضم الأنزيمي الثاني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وقطع الأنسجة مرة أخرى مع 20 مل انزيم حل E2 تحتوي على كولاجيناز أنا فقط (الجدول الأول). إضافة 40 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل على الفور للحصول على تركيز النهائي من 20 ميكرومتر كا 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء استخدام مقص الهضم الثاني إلى مزيد من جلطات ختم الأنسجة في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5 دقائق أخذ عينة باستخدام ماصة باستور للتحقق من تفكك الخلايا. كرر هذا كل 2-3 دقائق حتى تظهر على شكل قضيب، العضلية المخططة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف اثارة والسماح للقطع الأنسجة ليستقر لمدة 20-30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) إلى 50 مل أنبوب فالكون (أنبوب). إعادة قطع الأنسجة ضبط النفس من شبكة إلى الدورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق قطع الأنسجة في الدورق مع 20 مل ستوراحل شركة جنرال الكتريك (الجدول الأول) 10 وكذلك فصل الخلايا عن طريق سحن الميكانيكية لطيف باستخدام ماصة المصلية 20 مل مع موزع. في محاولة لتجنب تشكيل فقاعة فقاعات منذ تضر بقاء الخلية والجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة طاف بعناية من خلال شبكة من النايلون (200 ميكرون، الجدول الثاني) في أنبوب 50 مل الصقر (أنبوب B). </li></ol> 5. الإعداد النهائي والنهائي من التعديل كا 2 + تركيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لكلا فالكون أنابيب ألف وباء (انظر الخطوة 4.5 و 4.7) في 95 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من كل من الأنابيب بعناية من قبل الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق كل من الكريات في 1.5 مل من محلول التخزين (الجدول الأول) كل (درجة حرارة الغرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مرتين 7.5 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 حل كل فالكون ويقلب بعناية. احتضان لمدة 10 دقيقة بعد كل خطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">إضافة 15 ميكرولتر من 10 مم CaCl 2 الحل النهائي للحصول على الكالسيوم 2 + تركيز 0.2 ملم. </li></ol> 6. التحميل من Myocytes مع كا نيون 2 + مؤشر فلوو-3 AM (الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.5 مل من تعليق خلية (أنبوب A و / أو أنبوب B) في أنبوب microcentrifuge 2 مل (أنبوب إيبندورف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية في إطار النظر في الحساسية للضوء الفلورسنت من كا 2 + المؤشر فلوو-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 50 ميكروغرام من نفاذية الغشاء acetoxymethyl مشتقة استر من فلوو-3 (فلوو-3 صباحا، والجدول الثالث) في 44 ميكرولتر من بلورونيك F-127 (الجدول الثالث) حل سهم (20٪ W / V في DMSO اللامائية) للحصول على قطرها 1 مم فلوو-03:00 حل الأوراق المالية، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع على الأكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من فلوو-03:00 محلول المخزون إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 1.5 مل من تعليق خلية (انظر الخطوة 6.1) وتستنهض الهممبعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في مربع مبهمة بصريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في حوالي 6،000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من محلول حمام (الجدول الرابع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك تعليق خلية لمدة 30 دقيقة لإزالة الأسترة قبل البدء بالتجارب. </li></ol> 7. في وقت واحد التصحيح، المشبك وEpifluorescent كا 2 + قياسات منذ قياسات التصحيح، المشبك ليست هي الموضوع الرئيسي لهذا الاستعراض، ونحن إحالة القارئ المهتم إلى المنشورات الأخرى التي تقدم أكثر في وصف عمق هذه التقنية. 11-14 من اجل اكتمال نحن نقدم ملخصا موجزا لبروتوكول لقياس إمكانات العمل أو L-نوع كا 2 + التيارات، على حد سواء في وقت واحد جنبا إلى جنب مع كا 2 تسجيلات +-عابرة. خلال التجارب التي superfused myocytes عند 37 درجة مئوية مع حمام solutiفي (الجدول الرابع) باستخدام نظام نضح السريع (Octaflow IITM، ALA الأدوات العلمية، NY). للتجارب الجهد المشبك، يتم حظر K + التيارات بإضافة 4 امينوبيرين (5 ملمول / لتر) وبووتون 2 (0.1 مليمول / لتر) إلى حل حمام. وتستخدم microelectrodes الزجاج البورسليكات وينبغي أن يكون التسديد على المقاومة من 2-5 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة (الجدول V). بالإضافة إلى فلوو-3:00 التحميل من myocytes (راجع الخطوة 6)، يتم تضمين فلوو-3 أيضا في حل ماصة (الجدول V). هو متحمس مضان في 488 نانومتر والضوء المنبعث (&lt;520 نانومتر) تم تحويله إلى [كا 2 +] ط افتراض <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> حيث k د = ثابت التفكك لفلوو-3 (864 نM)، F = فلوو-3 مضان؛ F الحد الأقصى = كا 2 + مضان المشبعة التي تم الحصول عليها في نهاية كل تجربة 12 وتسجل كل الإشارات الكهربائية والكالسيوم 2 + إشارات epifluorescent في وقت واحد. يتم تحفيز إمكانات العمل عند 0.5 هرتز في الوضع الحالي، المشبك باستخدام 1 ميللي ثانية البقول الحالية من قوة عتبة 1.2X. L-نوع كا 2 + يتم قياس التيارات في وضع الجهد المشبك باستخدام المحتمل عقد -80 بالسيارات و100 ميللي ثانية منحدر النبض إلى -40 بالسيارات لإبطال نشاط نا سريع + المتداولة، يليه 100 ميللي ثانية نبض اختبار ل+10 بالسيارات عند 0.5 هرتز.

<ol>
	<li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation.">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li><li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein+&#946;3-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents.">G-Protein &#946;3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK,ACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+IK,ACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation.">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-gated+potassium+current+IK,ACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation.">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li><li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes.">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li><li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes:+properties+and+consequences.">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK,ACh+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li><li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2++buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li><li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts:+review+of+the+literature+and+description+of+a+method.">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li><li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li><li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart.">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li><li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure.">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li><li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution.">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li><li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+"KB+medium".">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li><li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li><li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Enzyme Manual. , (1993).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-specific+effects+of+the+IKur/Ito/IK,ACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation.">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K++current+IK,ACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation:+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK,ACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials.">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li><li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes.">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li><li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance.">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

ورثينجتون بيوكيميائية كورب دعم هذا المنشور من خلال تغطية تكاليف الإنتاج من ملف الفيديو. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو إعداد المخطوطة.

هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان من الزوائد الأذيني حق الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح. من اجل استخدام هذه myocytes لقياس عصاري خلوي كا 2 + نحن تكييفها طريقة التي سبق وصفها 4-11 بحذف EGTA من حلول التخزين. بالفعل في عام 1970 لوحظ أنه على الرغم من myocytes فصل في وجود الكالسيوم 2 + أثناء عملية الهضم، كل منهم في انكماش وغير قابلة للحياة. 16،17 لذلك، يتم تنفيذ عزل خلية في كا 2 + خالية حل. ومع ذلك، فإن إعادة إدخال تركيزات الفسيولوجية للكا 2 + أسفرت السريع كا 2 + تدفق وموت الخلايا. وقد وصفت ذلك بأنه كا 2 + ظاهرة التناقض الذي لوحظ أصلا في قلوب perfused بواسطة زيمرمان وهولسمان 18 تعديلات من وسائل الإعلام بما في ذلك الحد من عزلة الرقم الهيدروجيني إلى 7.0، &lt;سوب&gt; 19 إضافة taurin 20 أو كميات صغيرة من الكالسيوم 2 + (راجع الخطوة 3.2 و 4.1)، 21 فضلا عن تخزين myocytes معزولة في EGTA تحتوي على تخزين حل 22 وقد اقترحت لمنع كا 2 + المفارقة 17 ومع ذلك، فمن المعروف جيدا أن كا 2 + التخزين المؤقت من خلال EGTA يقلل من السعة من نوع L-كا 2 + الحالية التي يسببها كا 2 + سعة عابرة والنتائج في الاضمحلال ثنائي الطور من كا 2 + العابرين. 23 ولذلك، فإننا حذفت EGTA في جميع مراحل عملية عزل كامل من أجل الحصول على كا 2 + العابرين مع الخصائص النموذجية، ويضمحل حيد الطور. لحماية الخلايا من كا 2 + المفارقة رفعنا النهائي كا 2 + تركيز المحلول التخزين بطريقة تدريجية حتى 0.2 ملم. اختيار كولاجيناز هو على الارجح الخطوة الأكثر أهمية لنجاح العزلة خلية عضلية. كول التقليديةagenases استعدادات الخام تم الحصول عليها من نسج كلوستريديوم وتحتوي على كولاجيناز بالإضافة إلى عدد من proteinases، polysaccharidases والليباز الأخرى. استنادا على collagenases تكوين عامة تنقسم إلى أنواع مختلفة. رثينجتون 24 أنواع كولاجيناز الأول والثاني استخدمت بنجاح لعزل myocytes الأذيني الإنسان. 4-10،15،25-30 في بروتوكول موضح لدينا في الوقت الحاضر نحن نوصي باستخدام كولاجيناز النوع الأول، على الرغم من أننا كنا أيضا قادرة على الحصول على كميات مقبولة من خلايا قابلة للحياة باستخدام كولاجيناز من النوع الثاني. ومع ذلك، وحتى داخل نوع واحد كولاجيناز هناك تباين كبير دفعة إلى دفعة فيما يتعلق بأنشطة الانزيم. تتطلب هذه الاختلافات حذرا اختيار دفعة واختبار مختلف دفعات لتحسين إجراء العزل. وتتوفر أداة دفعة الاختيار على الانترنت من رثينجتون بيوكيميائية شركة ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php) يمكن استخدامها للعثور على دفعات المتاحة مع التشكيل التي قد تظهر لتكون مناسبة للعزلة myocytes الأذيني الإنسان. حاليا نحن نستخدم كولاجيناز النوع الأول مع 250 U / ملغ كولاجيناز النشاط، 345 U / ملغ النشاط caseinase، 2.16 U / ملغ النشاط clostripain و 0.48 U / ملغ النشاط زيتية (الكثير # 49H11338). الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء الموضح في هذه المخطوطة يمكن أن تستخدم في غضون 8 الموارد البشرية لدراسات التصحيح، المشبك، كا 2 + قياسات عابرة ومزيج من الاثنين معا. 15 وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الخلايا القياسات من الانكماش الخلوية في استجابة لتحفيز الحقل الكهربائي أو التحفيز الكهربائي باستخدام ماصة التصحيح، المشبك (الملاحظات غير منشورة).

<html> دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف الخلوية كا 2 + تشوهات تتطلب معالجة العضلية معزولة. عادة ما يتم الحصول على هذه عقب التعرض في المختبر عينات من أنسجة القلب إلى الإنزيمات الهضمية (كولاجيناز، هيالورونيداز، ببتيداز الخ). منذ التقرير الأول للعزلة myocytes القلب قابلة للحياة في عام 1955 (2) وقد وضعت كمية كبيرة من البروتوكولات من أجل حصاد العضلية الأذيني البطيني واحد من الأنواع المختلفة بما في ذلك الماوس، الجرذان والأرانب والكلاب والخنازير الغينية والبشرية. في هذا الاستعراض ونحن نركز على عزلة myocytes الأذيني الإنسان. فيما يتعلق بإجراءات لعزل myocytes من الأنواع الأخرى التي تشير إلى &quot;ورثينجتون الأنسجة التفكك دليل&quot; التي تقدمها ورثينجتون بيوكيميائية كورب، الولايات المتحدة الأمريكية ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). = &quot;jove_content&quot;&gt; وتستمد الأذيني بروتوكولات العزلة خلية عضلية الإنسان عموما من الطريقة الموصوفة من قبل بوستامانتي، وآخرون. 3 هنا نقدم وصفا خطوة بخطوة من تقنية، والتي يتم تكييفها من أسلوب المنشورة سابقا، من أجل الحصول myocytes الأذيني مناسبة ليس فقط للتجارب التصحيح، المشبك ولكن أيضا لفي وقت واحد داخل الخلايا كا 2 + القياسات. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

دراسة الخصائص الكهربية من القنوات الأيونية القلب مع تقنية التصحيح، المشبك واستكشاف القلب الخلوية كا 2 + التعامل مع التشوهات العضلية يتطلب معزولة. وبالإضافة إلى ذلك، إمكانية للتحقيق myocytes من المرضى الذين يستخدمون هذه التقنيات هو شرط لا تقدر بثمن لتوضيح الأساس الجزيئي لأمراض القلب مثل الرجفان الأذيني (AF). 1 هنا نحن تصف طريقة لعزل myocytes الأذيني الإنسان والتي هي مناسبة لكلا دراسات التصحيح، المشبك والقياسات في وقت واحد من تركيزات + داخل الخلايا كا 2. أولا، يتم المفروم الزوائد الأذيني الحق تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب المفتوح إلى قطع الأنسجة الصغيرة (&quot;أسلوب قطعة&quot;) وغسلها في كا 2 + خالية حل. ثم يتم هضمها وقطع الأنسجة في كولاجيناز والبروتيني تحتوي على حلول مع 20 ميكرومتر كا 2 +. بعد ذلك، myocytes معزولة هي harveSTED عن طريق الترشيح والطرد المركزي لتعليق الأنسجة. وأخيرا، يتم ضبط كا 2 + التركيز في حل تخزين الخلايا متدرج إلى 0.2 ملم. نناقش بإيجاز معنى كا 2 + والكالسيوم 2 + التخزين المؤقت أثناء عملية العزل، وكذلك تقديم التسجيلات ممثل امكانات العمل والتيارات غشاء، على حد سواء في وقت واحد جنبا إلى جنب مع كا 2 + قياسات عابرة، التي أجريت في هذه myocytes معزولة.

ويبين الشكل 2A ثلاثة أمثلة ممثل من myocytes الأذيني حق من حقوق الإنسان معزولة. لقياس العائد الخلية نحن ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية (الخطوة 5.5) على شريحة المجهر CellFinder ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). غلة خلية بلغ متوسط ​​في الشكل 2B تشير بوضوح إلى أن هناك اتجاها لانخفاض العوائد في الخلية AF المزمن (الكاف) عينات المرضى (أنبوب A: 16.5 ± 3.1 cells/10 ميكرولتر (ن = 29) مقابل 5.1 ± 2.3 ميكرولتر cells/10 (ن = 10) في SR والكاف، على التوالي، P &lt;0.05؛ أنبوب B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ميكرولتر (ن = 29) مقابل 5.9 ± 2.0 cells/10 ميكرولتر (ن = 9) في ريال وCAF، على التوالي، P = 0.107). وترد أمثلة ممثل قياسات العمل ذات الإمكانات والتسجيلات في وقت واحد من عصاري خلوي كا 2 + العابرين في الشكل 3. في حوالي 90٪ من الخلايا التحقيق، روقال انه عمل لإمكانيات أثار كا 2 + الإفراج يسبب تقلصات خلية واضحة ومنتظمة. كما ذكرت سابقا، فإن غشاء المحتملة يستريح، وهو مؤشر مقبول لسلامة الخلية، وبلغ متوسط ​​حوالي -73.9 ± 2.7 بالسيارات (ن = 23/10 myocytes / المرضى) و-77.7 ± 1.8 بالسيارات (ن = 19/8 myocytes / المرضى ) في SR والكاف على التوالي (P&gt; 0.05) يظهر 15 الشكل 4 التسجيلات في وقت واحد ممثل الجهد بوابات L-نوع كا 2 + التيارات وعصاري خلوي كا 2 + العابرين. تطبيق غير انتقائية إيزوبرينالين ناهض β-المستقبلات (1 ميكرومتر) يزيد سعة من كلا أنا كا، L وعصاري خلوي كا 2 + العابرين، مما يوحي سليمة β الأدرينالية إشارة تتالي تنبيغ. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figure 1. مخطط تدفق من myocytes فلوو-3:00 تحميل البروتوكول (راجع الخطوة 6،1-6،5). M / V والكتلة / الحجم. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> الشكل 2. A، معزولة myocytes الأذيني حق من حقوق الإنسان بعد ساعة واحدة في حلول التخزين. B، يعني ± SEM من العائد خلية تحسب في 10 ميكرولتر من الخلايا في حل التخزين (انظر الخطوة 5.5). ن يشير إلى عدد من الأعمال التحضيرية داخل كل مجموعة. * P &lt;0.05. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> الشكل (3). التسجيلات الممثل العمل لإمكانيات أثار كا 2 +-العابرين (CAT) في خلية عضلية الأذيني من إيقاع الجيوب الأنفية ومركز حقوق الإنساناونك مريض الرجفان الأذيني. الأعلى: المحقونة غشاء الحالية (I M) تستخدم لتحفيز (0.5 هرتز). أدناه: تسجيل في وقت واحد من غشاء المحتملة (V M)، واتفاقية مناهضة التعذيب أثار (القاع). (Replotted بإذن من فويت وآخرون. 2012) 15 <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> الشكل 4. تسجيلات ممثل (1 ميكرومتر) تأثير إيزوبرينالين على L-نوع كا 2 + الحالية، أثار كا 2 +-العابرين (CAT) في خلية عضلية الأذيني من إيقاع الجيوب الأنفية ومريض الرجفان الأذيني المزمن. الأعلى: الجهد المشبك بروتوكول (0.5 هرتز). أدناه: تسجيل في وقت واحد من مجموع غشاء الصافية الحالية (I M)، والتي تعكس في الغالب L-نوع كا 2 + القط الحالي (وسط) واثار (القاع). (Replotted بإذن من فويت،وآخرون 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="الجدول 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> الجدول I. حلول. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="الجدول 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> الجدول الثاني. معدات معينة. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="الجدول 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> الجدول الثالث. لتحميل المواد من myocytes مع فلوو-3 PM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="الجدول 4" fo:conteNT-العرض = &quot;2.5in&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; الجدول الرابع. حل نوم للالتصحيح، المشبك. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="الجدول 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> الجدول خامسا حل ماصة للالتصحيح، المشبك *.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents at JoVE.com

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

وصفنا عزلة myocytes الأذيني الإنسان والتي يمكن استخدامها لكا داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; القياسات في تركيبة مع دراسات التصحيح، المشبك الكهربية.

عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم<sup&gt; 2 +</sup&gt; العابرون والتيارات غشاء

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.3K Views.  University of Duisburg-Essen. وصفنا عزلة myocytes الأذيني الإنسان والتي يمكن استخدامها لكا داخل الخلايا 2 + القياسات في تركيبة مع دراسات التصحيح، المشبك الكهربية.

Video: Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

العزلة وتسجيلات قناة كيلو فولت في الفئران Cardiomyocytes الأذيني البطيني و

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

المتزامن لرسم الخرائط وكوانتيتاتيون من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي البشري

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...