عزل myocytes الأذينية لاستخدامها في التجارب التصحيح المشبك قد تقدمت إلى حد كبير معرفتنا وفهم الجزيئات الأذينية في كل من المستويين الخلوي والجزيئي. النهج الذي نستخدمه يؤدي بشكل فعال إلى أعداد كبيرة من الخلايا الأذينية المعزولة التي يمكن استخدامها للتحقيق في علم الفيزيولوجيا الكهربائية الأذينية الخلوية وتولد عدم انتظام الإصابة في مجموعة واسعة من النماذج والظروف التجريبية. لقد اعتمدنا نهج الهضم الجذع لعزل myocytes الأذينية.
وميزة هذا النهج هي أنه يسمح للباحث باختيار المنطقة المحددة التي يرغب في التحقيق فيها. ابدأ هذا الإجراء بإعداد المعدات والحلول كما هو موضح في بروتوكول النص. وضع لوحة تشريح، تشريح الأدوات، ماصة باستور، والماصات النار مصقول.
يمكن تنفيذ هذا البروتوكول على الفئران من النوع البري ذكر أو أنثى، الفئران التي تحمل الطفرات الوراثية، ونماذج الماوس من المرض. بعد القتل الرحيم الماوس كما هو موضح في بروتوكول النص، ضع الماوس على منشفة ورقية أو لوحة فلينة وشريط الكفوف إلى أسفل لعقد الماوس في مكان. الرطب في صدر الماوس مع 70٪ الإيثانول.
إزالة الفراء والجلد الذي يغطي الصدر باستخدام مقص منحني. المقبل استخدام الجرذ ملقط الأسنان لرفع القص ومن ثم قطع الحجاب الحاجز على طول حافة الأضلاع. إزالة القفص الصدري بأكمله باستخدام مقص منحني لفضح القلب.
لإزالة الملحق الأذيني، رفع بلطف الملحق باستخدام ملقط تشريح غرامة وقطع بها مع مقص الربيع. نقل على الفور الملحق الأذيني إلى طبق تشريح مغلفة السيليكون تحتوي على 20 ملليلتر من محلول تايرود المعدلة درجة حرارة 7.4. ضع دبوسًا واحدًا في الأعلى ودبوسًا واحدًا في أسفل فتح الزوائد الأذينية.
باستخدام ماصة باستور، قم بمسح الأذين مع محلول تايرود المعدلة 7.4 لإزالة الدم. فتح الملحق الأذيني عن طريق قطع على طول على حافة أعلى وأسفل. المقبل، دبوس زوايا الملحق الأذيني وصولا الى خلق قطعة مستطيلة مسطحة من الأنسجة.
قطع الزوائد الأذينية إلى ما يقرب من ثمانية إلى 10 شرائط متساوية الحجم باستخدام مقص الربيع والملقط غرامة. لاحظ أن الشرائط العقد مرة واحدة يتم قطع خالية من قطعة رئيسية من الأنسجة. باستخدام ماصة صغيرة مشتعلة النار مصقول، نقل شرائح الأنسجة في أنبوب الأول الذي يحتوي على حرارة معدلة حل تيرود 6.9 درجة حُر.
انتظر خمس دقائق الآن، استخدام متوسطة تحمل النار الماصات المصقولة لنقل شرائط الأنسجة إلى أنبوب أسفل الجولة الثانية التي تحتوي على تعديل حل تايرود درجة ص ف 6.9. لغسل شرائط الأنسجة، قبعة أنبوب سفلي جولة خمسة ملليلتر وعكس بلطف الأنبوب ثلاث مرات.
اسمحوا شرائط الأنسجة تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب قبل نقل شرائط الأنسجة إلى أنبوب ثالث باستخدام المتوسطة النار تحمل الماصات المصقولة. غسل الشرائط مرة أخرى عن طريق عكس. ثم, نقل شرائط الأنسجة في محلول الانزيم باستخدام المتوسطة النار المواص المصقولة واحتضان لمدة 30 دقيقة.
دوامة الأنبوب كل ثلاث إلى خمس دقائق لمنع شرائط الأنسجة من التمسك معا. في بداية الهضم الأنزيمي ، تستقر شرائط الأنسجة بسرعة بعد الدوران. في حوالي 20 دقيقة من الهضم ، تبدأ شرائط الأنسجة في الطفو في محلول الأنزيمي بعد الدوران.
خلال هذا الوقت، وشرائط الأنسجة الأذينية أيضا تغيير في المظهر من الوردي الشاحب إلى الأبيض كما يتم هضمها. بعد الهضم الأنزيمي، قم بإجراء ثلاثة غسلات باستخدام 2.5 ملليلتر من محلول كيلوبايت في أنابيب القاع المستديرة الخمسة المُعدة. لكل غسل، عكس بلطف الأنبوب ثلاث مرات قبل نقل الأنسجة إلى الأنبوب التالي باستخدام متوسطة تحمل ماصة مصقول النار.
بعد الغسيل النهائي، قم بنقل الشرائط إلى أنبوب 14 ملليلتر مستدير القاع يحتوي على 2.5 ملليلتر من حل كيلوبايت. انتظر خمس دقائق ثلاثية بلطف الأنسجة لمدة 7.5 دقائق باستخدام ماصة النار واسعة تتحمل مصقول.
هذا سوف تفكيك ميكانيكيا شرائط الأنسجة وأسفرت عن حل غائم مليئة myocytes الأذينية الفردية. يجب أن تكون مصممة الأولى من التثاب لتسفر عن عدد كبير من الخلايا دون تلف الخلايا. النظر في عوامل مثل عمر الفئران وحالة المرض.
تخصيص قوة التثاقل لعزلة الفرد عن طريق تغيير كل من التردد والسرعة لطرد شرائط الأنسجة من على نطاق واسع النار المصاة المصقولة. نتائج التثاقل اللطيف في انخفاض غلة الخلية ، في حين أن التثاقل القاسي سوف ينتج العديد من الخلايا الميتة. ملء 14 ملليلتر جولة أنبوب القاع التي تحتوي على شرائط الأنسجة ثلاثية الترور مع حل كيلوبايت إلى حجم النهائي من سبعة إلى 10 ملليلتر اعتمادا على الكثافة المطلوبة من الخلايا للاستخدام التجريبي.
ضع هذا الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد فترة الحضانة هذه، يمكن استخدام الخلايا لمجموعة متنوعة من التجارب لمدة تصل إلى سبع ساعات. تظهر هنا أمثلة على الخلايا الأذينية المعزولة من الفئران العادية.
يتم عادةً على ترتيب 100 ميكرون في الطول و 10 ميكرون في العرض مع التصدعات واضحة. السعة من myocytes الأذينية المعزولة عادة 40 إلى 70 picofarads. مثال على احتمالية إجراء myocyte الأذينية المسجلة باستخدام تقنية مثقبة التصحيح المشبك في وضع المشبك الحالي.
تم تسجيل عائلة تمثيلية من تيارات الصوديوم في تكوين الخلية بأكملها من تقنية التصحيح المشبك. تم تسجيل هذه التيارات باستخدام 50 ملي ثانية الجهد المشبك الخطوات بين السلبية 100 والإيجابية 10 millivolts من احتمال عقد من 120 ملليفولت سالبة. ويرد ملخص الصوديوم الحالي العلاقة الجهد هنا.
تم تسجيل عائلة تمثيلية من تيارات الكالسيوم باستخدام 250 ملي ثانية خطوات المشبك الجهد بين السلبية 60 والإيجابية 80 millivolts من احتمال عقد 70 ملليفولت سالبة. يتم عرض ملخص الكالسيوم الحالي العلاقة الجهد هنا. تم تسجيل عائلة تمثيلية من تيارات البوتاسيوم من احتمال عقد 80 ميليفولت سالب باستخدام 500 ميلي ثانية الجهد المشبك الخطوات بين السلبية 120 millivolts و 80 ملليفولت إيجابية.
هنا يظهر ملخص العلاقة التيار الجهد لمجموع البوتاسيوم الحالية. من المهم أن نتذكر أن عزل الأذيني الأذيني الناجح يعتمد على كل من الهضم الأنزيمي المناسب وكذلك الانفصال الميكانيكي للخلايا أثناء التثاب. مرة واحدة معزولة، myocytes الأذينية يمكن استخدامها في التجارب التصحيح المشبك لقياسات العمل المورفولوجيا المحتملة والتيارات الأيونية، مثل التيارات الصوديوم، التيارات الكالسيوم، والتيارات البوتاسيوم.
وكان التحقيق في التغيرات في الفيزيولوجيا الكهربائية الأذينية ضرورية لتحديد الأساس الخلوي والجزيئي لاضطران نظم الأذينية التي تهدد الحياة، ولتطوير واختبار المركبات المضادة للاضطران لعدم انتظام ضربات القلب.
