نشكر بحرارة معهد الدراسات الأوروبية Nanovic، وبرنامج جلين يكرم أسرة، نوتردام مرفق التصوير المتكاملة (NDIIF) والصحة Carestream للدعم المالي لهذا المشروع. البحث عن التنمية الأرانب الجمجمة بدعم من NSF-1029149 BCS إلى MJR.

<ol>
	<li>Kazmer, D. O., Speight, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Injection+Molding+Technology+for+the+Next+Millennium.">Polymer Injection Molding Technology for the Next Millennium.</a> Journal of Injection Molding Technology. 1 (2), 81-90 (1997).</li><li>Bradshaw, S., Bowyer, A., Haufe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intellectual+property+implications+of+low-cost+3D+printing.">The intellectual property implications of low-cost 3D printing.</a> ScriptEd. 7 (1), 5-31 (2010).</li><li>Partridge, R., Conlisk, N., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-lab+three-dimensional+printing:+An+inexpensive+tool+for+experimentation+and+visualization+for+the+field+of+organogenesis.">In-lab three-dimensional printing: An inexpensive tool for experimentation and visualization for the field of organogenesis.</a> Organogenesis. 8 (1), 1-6 (2012).</li><li>Guillot, A., Champely, S., Batier, C., Thiriet, P., Collet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+spatial+abilities,+mental+rotation+and+functional+anatomy+learning.">Relationship between spatial abilities, mental rotation and functional anatomy learning.</a> Adv. Health Sci. Educ. Theory Pract. 12, 491-507 (2007).</li><li>Cignoni, P., Scopigno, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampled+3D+models+for+CH+applications:+a+viable+and+enabling+new+medium+or+just+a+technological+exercise.">Sampled 3D models for CH applications: a viable and enabling new medium or just a technological exercise.</a> Association for Computing Machinery Journal on Computing and Cultural. 1 (1), 1 (2008).</li><li>Symes, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+3D-printed+reactionware+for+chemical+synthesis+and+analysis.">Integrated 3D-printed reactionware for chemical synthesis and analysis.</a> Nature Chemistry. 4, 349-354 (2012).</li><li>Sheridan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabricating+consent:+three-dimensional+objects+as+rhetorical+compositions.">Fabricating consent: three-dimensional objects as rhetorical compositions.</a> Computers and Composition. 27, 249-265 (2010).</li><li>Windisch, G., Salaberger, D., Rosmarin, W., Kastner, J., Exner, G. U., Haldi-Brandle, V., Anderhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+for+Clubfood+Based+on+Micro-CT.">A Model for Clubfood Based on Micro-CT.</a> Data. J. Anat. 210, 761-766 (2007).</li></ol>

W. ماثيو Leevy هو مستشار للتصوير الجزيئي Carestream. بريان Stamile هو مهندس الدعم للصناعات MakerBot.

الأشعة السينية CT مجموعات البيانات من الفئران ويستار Lobund-المعيشة واستخدمت سابق الجسم الحي الجديد الأرنب الأبيض نيوزيلندا الجمجمة لبيان جدوى الإنتاج كائن 3D من ما قبل السريرية البيانات البيولوجية. تم إنشاؤها باستخدام نماذج مصادر الفرق الثلاثة: 1) وحدة النسخ المتماثل Makerbot شعبية، 2) وطرف ثالث شركة Shapeways المؤتمر الوطني العراقي، و 3) وعالية الجودة HD التجارية PROJET 3000. كان كل طابعة قادرة على توليد الكائنات التي اقتنعت الهدف مبدأ التصور البيانات المحسنة. خلال عملية طباعة البيانات ما قبل السريرية CT، كانت مزايا وعيوب كل طريقة الطباعة والتأكد تلخيص للمستخدم النهائي. المكرر MakerBot هو غير مكلفة الأعلى مقاعد البدلاء ($ 1،750) الحل الذي هو في متناول أي مختبر تقريبا في جميع أنحاء العالم. ويمكن طباعة ألوان متعددة في المدخلات غير مكلفة مع (أ CT الفئران مع الرئتين عن استخدام البلاستيك في 3،50 $). ومع ذلك، يقتصر Makerbot بموجب القرار،وبالتالي فإن بعض النماذج لا بد من توسيع للقذف والتصور السليم للهيكل المقصود. Shapeways شركة توفر عدد من الاختيارات المتميزة فيما يتعلق الألوان والمواد. النماذج هي ارتفاع القرار، وقوية. بينما أسعارها حوالي 10 أضعاف أعلى من MakerBot على أساس وحدة في (أ CT الفئران مع الرئتين كان 41،61 $)، يمكن للمستخدم تنفيذ عدد محدود من فرص العمل وتجنب تكاليف مقدما لشراء طابعة. المهلة لمدة أسبوعين من Shapeways هو وضع غير مؤات طفيفة. قدمت HD 3000 PROJET النماذج المتميزة من حيث القرار والقوة. كنا محظوظين بما فيه الكفاية للتعاقد على طباعة الأجسام دينا على 3000 HD PROJET في حديقة الابتكار في جامعة نوتردام (حوالي 30 دولارا للCT الفئران مع الرئتين عن العمل والمواد). قد يكون لدى المستخدمين صعوبة في الوصول إلى هذا النوع من المعدات، وتسعيرها في حدود 80،000 دولار، وأنه هو مرهقة للطباعة مع ألوان متعددة أيضا. منذ كل صك / الصانعيوفر متري مختلفة لوصف القرار للطباعة الكائن (الحد الأدنى من التفاصيل Shapeways = 0.2 ملم، والحد الأدنى = سمك الجدار 0.7 مم، 5 = سمك شريحة MakerBot 0،2-0،3 ملم مع 0،4 مم فوهة، 6 PROJET HD 3000 = 656 DPI X 656 × 800 مع دقة ،025-0،05 مم)، والتقييم النوعي لقرارات النسبية بين كل نظام على حد سواء تشير إلى أن Shapeways ونظام HD PROJET يمكن طباعة بالتفصيل الأعلى إلى النطاق، في حين يجب توسيع بعض الكائنات للاستخدام الناجح لل وMakerBot. بشكل جماعي، جميع الطرق الثلاث هي صديقة للبيئة وتوفر وسيلة مريحة لتحقيق الإنتاج السهل مفصلة للغاية من ما قبل السريرية نماذج CT الأشعة السينية. اختتام تدريجيا، أصبحت تكنولوجيا الطباعة 3D للوصول بشكل أفضل حيث تم التقليل من التكاليف والتعقيد. 8 و 9 والآن، حرفيا أي شخص قد طباعة عالية الدقة ثلاثية الأبعاد الكائنات من حفرملفات ITAL. يمكن لهذه مفصلة ثلاثية الأبعاد كائنات يمكن أن تكون أدوات مفيدة لكلا المربين والباحثين على حد سواء. وعلاوة على ذلك، لأنها توفر وسيلة للاتصال البصرية التي تساعد في تحقيق فهم أوضح 10 على سبيل المثال، يمكن استخدام الباحثين في مجال الطب عينة أو نماذج محددة المريض على حد سواء لتحسين الاتصال والفهم مع زملائهم المرضى و11 على الرغم من أن التمثيل على شاشات 2D لديه قطعنا شوطا طويلا، ليست هناك اي بديل للتجربة البصرية والحسية عقد الهدف الحقيقي هو أن تتمكن من المقرر عقده، استدارة، وانتقل فحص حولها. نموذج يقترن تمثيل البيانات الإلكترونية هو أكثر قوة لأنها تسمح للباحثين لدراسة الشيء المادي للمناطق ذات الاهتمام، وإيجاد تلك المناطق على نموذج على الحاسوب لمزيد من التحليل الكمي. مع جمع البيانات المناسبة، وجعلها السطح، وتحرير التصوير النحتي المجسم، فمن الممكن أن تنتج بسرعة مفصلة، ​​relatiنماذج من البيانات غير مكلفة vely CT الأشعة السينية. هنا، ونحن نقدم تفصيلا، وخطوة خطوة طريقة لإنتاج نموذج ثلاثي الأبعاد من بيانات ما قبل السريرية الحيوانات الصغيرة التي تم جمعها مع CT-X الصغرى السينية. حصلنا لدينا في الجسم الحي وخارج الجسم الحي باستخدام مجموعات البيانات CT محطة صورة البيرة، وإجراء معالجة لاحقة مع PMOD، يماغيج، وحزم البرمجيات Meshlab Netfabb. وأخيرا، ونحن نقدم تعليمات مفصلة لتمكين الطباعة ثلاثية الأبعاد مع نموذج مجموعة من الحلول التجارية. في كل حالة، والنتيجة النهائية هي النموذج الذي يوفر فريدة من نوعها، باليد، مظهر مادي للتصوير الشعاعي الطبقي البيانات المكتسبة التي عادة ما يتم يقتصر على شاشة الكمبيوتر.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> برامج المطلوبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيرة صورة المشترى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PMOD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يماغيج </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Meshlab </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Netfabb </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ReplicatorG </li></ol></td></tr></tbody></table>

3d printing of preclinical x-ray computed tomographic data sets

الطباعة ثلاثية الأبعاد يسمح لإنتاج الأجسام مفصلة للغاية من خلال عملية تعرف باسم التصنيع المضافة. التقليدية، والعفن حقن طرق لخلق نماذج أو أجزاء على قيود عدة، وأهمها هو صعوبة في صنع منتجات معقدة للغاية في الوقت المناسب فعالة من حيث التكلفة. 1 إلا أن التحسن التدريجي في تكنولوجيا الطباعة ثلاثية الأبعاد أدت في كل من الصكوك الراقية والاقتصاد التي أصبحت الآن متاحة لإنتاج نماذج مخصصة السهل .. 2 هذه الطابعات لديها القدرة على قذف الأجسام عالية الدقة مع ما يكفي من التفاصيل لتمثيل الصور بدقة في الجسم الحي ولدت من ماسح ضوئي قبل السريرية CT الأشعة السينية . مع جمع البيانات المناسبة، وجعلها السطح، والتصوير النحتي المجسم التحرير، أصبح من الممكن الآن وغير مكلفة لإنتاج هياكل الأنسجة بسرعة مفصلة الهيكل العظمي وميسرة من البيانات CT الأشعة السينية. حتى في المراحل المبكرة من تطويرمنة، ونماذج تشريحية التي تنتجها نداء الطباعة ثلاثية الأبعاد على كل من المربين والباحثين الذين يمكن الاستفادة من التكنولوجيا لتحسين الكفاءة التصور. 3، 4 الفوائد الحقيقية من هذه النتيجة طريقة من تجربة ملموسة يمكن الباحث يكون مع البيانات التي لا يمكن أن تكون نقل بشكل كاف من خلال شاشة الكمبيوتر. ترجمة ما قبل السريرية بيانات 3D إلى كائن المادية التي هي نسخة طبق الأصل من هذا الموضوع هو اختبار أداة قوية لرؤية والاتصالات، وخاصة لربط البحوث للطلاب التصوير، أو تلك الموجودة في الحقول الأخرى. هنا، ونحن نقدم طريقة مفصلة لطباعة نماذج بلاستيكية للعظام وهياكل الجهاز المستمدة من الأشعة السينية CT بفحص استخدام نظام البيرة CT الأشعة السينية بالتعاون مع PMOD، يماغيج، Meshlab، Netfabb، وحزم البرمجيات ReplicatorG.

<img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50250/50250fig1.jpg" /> الشكل 1. تم طبع نماذج 3D مطبوعة من الرئتين وميزات الهيكل العظمي للفأر X السينية CT مجموعة البيانات. كائنات باستخدام HD PROJET 3000 (اليسار)، وشركة Shapeways (مركز) أو المكرر Makerbot (يمين). شريط مقياس يدل على 2 سم. لاحظ أن شريط النطاق في لوحة C هو أصغر من A B والذي يعكس أنه في بعض الحالات، يجب Makerbot طباعة كائن الموسع من أجل التفاصيل خرج كافية. الشكل 1 يصور المنتجات النهائية لثلاث وسائل للطباعة نفسها في الجسم الحي مجموعة الفئران البيانات CT. جميع النماذج الثلاثة تتكون من هيكل العظمي والرئتين اقتصاص القابلة للإزالة التي طبعت بشكل مستقل وتجميعها معا. النموذج على اليسار هو نتيجة للطابعة HD عالية الدقة PROJET 3000، التي تم إنشاؤها باستخدام البلاستيك الشفاف الاكريليك. الكائن في مركزتم إنتاج شركة باستخدام طرف ثالث، Shapeways شركة، والذي تم طباعة الهيكل العظمي باستخدام النايلون 12 بلاستيكية بيضاء بينما كانت ملفقة هياكل الجهاز التنفسي في الأرجواني. وطبعت هذه النماذج الأولى والثانية لمقياس الفعلية، ومساحتها تقريبا 11 سم في الطول. وقدم الكائن في حق استخدام MakerBot. تم طباعة باستخدام الهيكل العظمي الطبيعية الملونة ABS (الأكريلونيتريل بوتادين ستايرين) البلاستيك والرئتين مع الجير الخضراء ABS. بسبب حدود قرار MakerBot، لا يمكن أن تكون مطبوعة هذا النموذج على نطاق دون تدهور هيكل غرامة مثل القفص الصدري. بدلا من ذلك، تم تحجيم النموذج من قبل 2X تقريبا باستخدام &quot;ملء الفضاء بناء&quot; الخيار للحصول على التفاصيل المطلوبة البصرية، مما أدى إلى وجوه 21 سم في الطول. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50250/50250fig2.jpg" /> الشكل 2. 3D نماذج مطبوعة من أحد SKU السابقين فيفو الأرانبليرة لبنانية البيانات المحددة. تم طبع الكائنات المعروضة باستخدام HD PROJET 3000 (يسار)، Shapeways شركة (مركز) وحدة النسخ المتماثل Makerbot (يمين). شريط مقياس يدل على 1 سم. ويبين الشكل 2 المنتجات النهائية من كل أسلوب الطباعة للأرنب فيفو السابقين الجمجمة مجموعة البيانات CT. النموذج على اليسار هو نتيجة من الطابعة HD عالية الدقة PROJET 3000 باستخدام البلاستيك الشفاف الاكريليك. تم طباعة نموذج في مركز في البلاستيك الأبيض nylon12 من خلال طباعة Shapeways. تمت طباعة الكائن في حق من البلاستيك الأبيض باستخدام MakerBot. وطبعت كافة الكائنات ثلاثة إلى توسيع نطاق وقياس حوالي 8.5 سم في الطول. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/50250/50250fig3.jpg" /> الشكل 3. تم طبع نماذج 3D مطبوعة من كامل الفئران للأشعة السينية CT مجموعة البيانات. كائنات باستخدام HD PROJET 3000 (اليسار)، وشركة Shapeways (يمين). مقياس بع يدل على 1 سم. يصور الشكل 3 المنتجات النهائية لطريقتين من طباعة البيانات كاملة في الجسم الحي CT مجموعة من الفئران. كلا النموذجين تتكون من هيكل العظمي الكامل (ناقص الذيل) والرئتين القابلة للإزالة. النموذج على اليسار هو الناتجة من طابعة ذات دقة عالية، وHD PROJET 3000، طبعت باستخدام البلاستيك الشفاف الاكريليك. تم طباعة النموذج على حق استخدام الطباعة Shapeways، مع بنية الهيكل العظمي التي تم إنشاؤها باستخدام الأبيض nylon12 البلاستيك والرئتين في الأرجواني. وطبعت هذين النموذجين لمقياس الفعلية، ومساحتها تقريبا 19 سم في الطول. بسبب التفاصيل الدقيقة المطلوبة، لا يمكن أن الهيكل العظمي الكامل سيتم طباعتها مع المكرر MakerBot. خلال استكشاف تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد، شوهد بعض المزايا والعيوب وترد في الجدول 1. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td><stroنانوغرام&gt; طريقة الطباعة </td><td> المزايا </td><td> عيوب </td></tr><tr><td> MakerBot </td><td> سريع للغاية، ومجموعة متنوعة من خيارات الألوان، وقادرة على الطباعة في لونين، وغير مكلفة للغاية </td><td> أدنى مستوى من التفاصيل. إزالة مواد الدعم بطيء (بناء على أمر من بضع ساعات). </td></tr><tr><td> Shapeways </td><td> متنوعة من خيارات الألوان، متنوعة من المواد للطباعة، ومستوى عال من التفاصيل، غير مكلفة نسبيا </td><td> لمدة أسبوعين مرة لمعالجة وتلقي أمر </td></tr><tr><td> PROJET HD 3000 </td><td> تحول سريع نسبيا، أعلى مستوى من التفصيل، إنتاجية عالية وسهلة لإزالة مواد الدعم (الشمع). </td><td> أغلى تكلفة في خط الهجوم، سوى خيار واحد اللون خلال الاستخدام العملي. </td></tr></tbody></table> الجدول 1. مقارنةمن تقنيات الطباعة 3D المتاحة لطباعة CT مجموعات البيانات.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets at JoVE.com

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

باستخدام البثق البلاستيك الحديثة وتقنيات الطباعة، أصبح من الممكن الآن بسرعة وبتكاليف زهيدة إنتاج النماذج الفيزيائية للبيانات الأشعة السينية CT المتخذة في المختبر. طباعة ثلاثية الأبعاد للبيانات تصوير الشعاعي الطبقي هو التصور قوية، والبحوث، وأداة تعليمية يمكن الآن الوصول إليها من قبل المجتمع التصوير قبل السريرية.

3D الطباعة الأشعة السينية ما قبل السريرية البيانات المحسوبة تصوير الشعاعي الطبقي مجموعات

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

3d-printing-of-preclinical-x-ray-computed-tomographic-data-sets

Research

JoVE Journal

Biology

40.2K Views.  University of Notre Dame. باستخدام البثق البلاستيك الحديثة وتقنيات الطباعة، أصبح من الممكن الآن بسرعة وبتكاليف زهيدة إنتاج النماذج الفيزيائية للبيانات الأشعة السينية CT المتخذة في المختبر. طباعة ثلاثية الأبعاد للبيانات تصوير الشعاعي الطبقي هو التصور قوية، والبحوث، وأداة تعليمية يمكن ...

Video: 3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

غير الغازية مع التصور 3D - الفرعية ميكرون القرار باستخدام السنكروترون - X - أشعة التصوير المقطعي

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

الطبعة Microcontact من البروتينات لبيولوجيا الخلية

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

بقعة الأنسجة الصحيحة في كل مرة في كتل متعددة النسيج

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

إنتاج نوروفيروس الإبراز المجالات الإنسان في<em&gt; E. القولونية</em&gt; لأشعة البلورات

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and pharmacological similarities to that of the mammals. GI intolerance during clinical testing of drug candidates is common and may pose a serious threat to human health. Testing for GI toxicity in preclinical mammalian models can be expensive in terms of time, test compound, and labor. The high-throughput method presented here may be used to predict GI safety issues. Compared to mammalian models, this method allows for more expedient assessment of test compound effects on GI transit while using low quantities of compound. In this method, larval zebrafish (7 days post fertilization) are fed food containing a fluorescent label. After feeding, each larval fish is placed into a well of a 96-conical-bottom-well plate and dosed with test compound (dissolved in water) or the vehicle. As gut transit occurs, fecal matter accumulates on the bottom of the wells, and the rate at which this happens is monitored by measuring fluorescence from the bottom of the well repeatedly over time using a plate spectrophotometer. The fluorescence from larvae in a given treatment group are averaged and these values are graphed along with standard error, for each measurement time, yielding a curve representing average transit of food over time. Effects on gut transit time are identified by comparing the area under the curve for each treatment group to that of the vehicle-treated group. This method detected changes in zebrafish GI transit time induced by drugs with known clinical GI effects; it can be employed to interrogate dozens of treatments for GI effects per day. As such, safer compounds can be quickly prioritized for mammalian testing, which expedites discovery and proffers 3Rs advancement.

The goal of this protocol is to measure the transit time of fluorescently labeled food through the gut of larval zebrafish in a high throughput fashion.

قياس وقت عبور الأمعاء استخدام اليرقات الزرد الفائق

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

قياس الجرعات لإشعاع الخلايا باستخدام مرافق الأشعة السينية Orthovoltage (40-300 كيلو فولت)

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

وصف رسم الخرائط 3D للخلية بواسطة التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة Cryo

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...