يتم اعتماد العمل من قبل على جائزة معهد التنمية من مستشفى الاطفال في فيلادلفيا.

1. الكروماتين عبر الرابط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا في أطباق ثقافة خلية 100x20mm. ويمكن لكمية من الخلايا تتراوح 1-10 مليون خلية لكل طبق اعتمادا على نوع من الخلايا. ما يقرب من 2 مليون خلية كافية لمناعي واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا عبر الرابط في فورمالديهايد 1٪ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرواء عبر ربط بإضافة تركيز النهائي من 125 ملم جليسين واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين، صب PBS، ثم قم بإضافة 0.2 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا مع مكشطة الخلية البلاستيك في أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار خلايا في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف. Resuspend الخلايا في SDS تحلل العازلة (1٪ SDS، 10MM EDTA، 50MM تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.1) لخلية كاملة المحللة أو الاحتفاظ بها باعتبارها بيليه لاستخراج النووية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا يمكن حفظها في -80 درجة مئوية أو يمكن للمرء أن المضي قدما فوريااعل مع صوتنة. </li></ol> 2. إعداد النواة (انتقل إلى الخطوة 3.5 لالخلايا المحللة الجامعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة الاحتياطي تحلل الخلية (5 ملم أنابيب ودرجة الحموضة 8.0، 85 ملي بوكل، 0.5٪ NP-40) مع 1X بروتين المانع كل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend إذابة الخلية بيليه في ما يقرب من 10 أضعاف حجم بيليه مع العازلة تحلل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dounce-التجانس 10 مرات مع مدقة ثم احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لعينة في 4،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف، وحفظ بيليه النووية. </li></ol> 3. صوتنة * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء SDS الاحتياطي تحلل وكمية ملحق العازلة ليتم استخدامها مع المانع بروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه النووية في SDS تحلل العازلة (حوالي 0.5 مل من العازلة لكل 1-10٬000٬000 الخلايا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل aliquots من عينات لأنابيب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن على الجليد الرطب باستخدام Misonix sonicator مع 30 ثانية و 45 ثانية على وقبالة في بيئة السعة من 2. عدد دورات للحجم المثالي جزء يمكن تحديده من خلال محاولة الأول من دورة أعداد مختلفة (مثلا: 2، 4، 8، 12، 16، و 20 دورات أو أكثر). علامة تجارية مختلفة من sonicator يمكن استخدامها، ومع ذلك، سوف تختلف الظروف. يجب أن يتم التجريب مع عدد من الدورات ومقدار الوقت وإيقاف خارج من أجل تحديد الظروف المثالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 20 ميكرولتر من كل عينة للتحقق من النتائج صوتنة والقيام الكمي،. ويمكن تخزين ما تبقى من العينة عند -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع ميكرولتر من 20 عينة وذلك بإضافة 30 ميكرولتر من 0.1X TE العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج عينة مع 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز A عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم إضافة 1 ميكرولتر من بروتين K واحتضان عند 62 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل 20 ميكرولتر من العينة على 2٪ الاغاروز هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية المبلغ المتبقي من العينة مع QIAquick PCR عدة تنقية ثم قياس باستخدام معمل NanoDrop. </li></ol> * للحصول على تشي الأصليP، microccocal نوكلياز الهضم يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك إلى القص الحمض النووي. 4. كتلة الخرز الاغاروز * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم حظر حبات بالفعل، انتقل إلى الخطوة 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البروتين أو بروتين G الاغاروز. لمدة 5 immunoprecipitations (آي بي إس)، استخدم 600 ميكرولتر من 50٪ حبة الطين (300 ميكرولتر حبة بيليه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الخرز، وتدور عليهم في 800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. إضافة ما يزيد قليلا عن 2 مل الشذرة العازلة تخفيف (0.01٪ SDS، 1.2 ملي EDTA، 167 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.1٪ تريتون X-100، 16.7 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.1) وتخلط بواسطة ببطء قلب الأنبوب 10X. تدور باستمرار مرة أخرى في 800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. تكرار غسل 2 مرات أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع حبات من خلال تناوب على 4 درجات مئوية خلال الليل في عرقلة الحل. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لوصفة عرقلة الحل. </li></ol> 5. الكروماتين قبل اضحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد sonicated لونين على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 12،000 دورة في الدقيقة وأو 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ثم وضع على الجليد على الفور لإزالة SDS (أبيض بيليه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف، وتجاهل بيليه، والجمع بين عينات إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج المبالغ اللازمة للتجربة مبنية على حسابات (1-10 ميكروغرام من لونين لكل IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع لونين 10X في العازلة تخفيف الشذرة تستكمل مع مثبط بروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الخرز سدت في IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. </li></ol> 6. مناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 800 دورة في الدقيقة العينات لمدة 1 دقيقة وطاف لنقل أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار طاف في 800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة، ونقل إلى أنبوب نظيف آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفر 20 ميكرولتر من طاف، لتكون بمثابة مراقبة المدخلات، في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة لونين لعدد من البرامج المتكاملة ينبغي القيام به في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكروغرام من الأجسام المضادة في المرحلة 1-10 من لونين إلى كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها 4 ° C مع التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الخرز حظر على كل عينة IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية مع التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه حبات من قبل الغزل أسفل في 800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة وتجاهل قدر من طاف ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مرة واحدة مع منخفض الملح المناعي غسل العازلة مجمع. إضافة 1 مل من العازلة لكل أنبوب؛ تناوب في درجة حرارة الغرفة ل5-8 دقيقة، تدور باستمرار في 800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة، ثم تجاهل طاف. كرر يغسل مرة واحدة مع الملح العالية العازلة يغسل مجمع المناعي وLiCl المناعي غسل العازلة مجمع ومرتين مع TE العازلة لما مجموعه 5 يغسل (الجدول 2). </li></ol> 7. شطف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب عينات المدخلات من اليوم السابق لتتم معالجتها مع eluants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شطف العازلة الطازجة (الجدول 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مزيج ماجستير في المخزن ما يكفي شطف اللازمة لعينات البرامج المتكاملة ومراقبة المدخلات زائد 1-2 عينات اضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر العازلة شطف IP لكل عينة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ساعةفي مع التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة ثم أضيفي طاف لأنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العازلة شطف آخر إلى كل أنبوب من الخرز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع التناوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة لمدة 15 ثانية بعد مرور فترة الحضانة؛ تدور باستمرار في 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة، ثم الجمع بين طاف مع طاف من شطف الأولى. (تأكد من عدم وجود خلفها حبات في supernatants. إذا لم تكن متأكدا، وتدور باستمرار طاف مرة أخرى في 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة وجمع طاف في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 180 ميكرولتر من الاحتياطي شطف إلى 20 ميكرولتر من عينات مراقبة المدخلات. </li></ol> 8. عكس الصليب الارتباط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لميكرولتر 200 من eluants وضوابط المدخلات، وإضافة 8 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب ختم مع parafilm واحتضان في حمام الماء عند 65 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> 9. تنقية الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج كل عينة مع 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز A لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 μl من 0.5 M EDTA، 8 ميكرولتر 1M تريس، حمض الهيدروكلوريك، المزيج، ثم إضافة 1 ميكرولتر من بروتين كاف لكل عينة واحتضان عند 45 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية العينات باستخدام PCR QIAquick عدة تنقية. العينات يمكن حفظها عند درجة حرارة -20 ° C PCR ويمكنك التحقق من ذلك في وقت لاحق. </li></ol> * وبدلا من ذلك، ورقاقة الصف حبات مغناطيسية يمكن استخدامها في مكان الاغاروز للجزء مناعي. 10. PCR الاختيار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من PCR، استخدم الاشعال للمناطق المعروفة على الالتزام بروتين من الفائدة. أيضا، استخدم الاشعال للمناطق غير ملزم كما ضوابط السلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج الكواشف للتفاعل. تمييع عينة الإدخال في 1:100 (الجدول 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل رد فعل. PCR البرنامج: </li></ol> الخطوة 1: 94 ° C 3 دقائق خطوة 2: 94 ° C و 20 ثانية 59 ° C 30 ثانية 72 ° C 30 ثانية (كرر الخطوة 2 لمدة 30 على الأقل الجسم الهدبيES) الخطوة 3: 72 ° C 2 دقيقة <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل العينات على agarose هلام 1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا أن تحدد كميا تخصيب في الوقت الحقيقي مع PCR. </li></ol>

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li><li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+STAT+nuclear+traffic.">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li><li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors.">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li><li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages.">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li><li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+message+across,+STAT!+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit.">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li><li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stats:+multifaceted+regulators+of+transcription.">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li><li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+re-sequencing.">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 16, 545-552 (2006).</li><li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+of+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes.">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li><li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes.">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14,000+cases+of+seven+common+diseases+and+3,000+shared+controls.">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li><li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels.">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li><li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes.">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li><li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations:+The+DiaGen+Consortium.">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li><li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCF7L2:+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA.">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li><li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+TCF7L2.">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li><li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+suspect:+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk.">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li><li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells.">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li><li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+the+TCF-4+gene+(TCF7L2)+to+human+chromosome+band+10q25.3.">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li><li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

فمن الممكن الآن لإجراء الشخصي الجينوم واسعة من جمعية تفاعلات البروتين DNA باستخدام رقاقة وما يليها، كما ثبت مؤخرا جدا مع عوامل النسخ الأخرى 2،3. المفتاح إلى نتيجة ناجحة التسلسل هو الجيل من قالب عالية الجودة لونين مناعي الحمض النووي. <p class="jove_content" style=";text-align:right;di...

لسنوات عديدة كانت هناك الحاجة غير الملباة لتحديد مجموعة من الجينات ملزمة والتي تنظمها معين من البروتين واسعة الجينوم، ولا سيما في فئة عامل النسخ. أودوم وآخرون. 1 تستخدم لونين مناعي (رقاقة) جنبا إلى جنب مع ميكروأرس المروج لتحديد منهجية الجينات التي تحتلها المنظمين النسخي محددة سلفا في كبد الإنسان والجزيرات البنكرياسية. وفي وقت لاحق، وضعت جونسون وآخرون. 2 على نطاق واسع لونين فحص مناعي يعتمد على المباشر فائقة تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها) من أجل تعيين شامل تفاعلات البروتين DNA عبر الجينوم بأكمله الثدييات. كحالة اختبار، فإنها تعيينها في الجسم الحي الربط عامل كاتم الصوت الخلايا العصبية المقيدة (NRSF) إلى عام 1946 موقعا في الجينوم البشري. عرض البيانات قرار حاد من موقف ملزم (+ 50 أزواج القاعدة)، التي سهلت كل من أناتحلول من الزخارف وتحديد الزخارف NRSF ملزم. وكان لهذه البيانات رقاقة وما يليها أيضا حساسية عالية وخصوصية وثقة إحصائية (P &lt;10 -4)، والخصائص التي تعتبر مهمة لاستنتاج التفاعلات مرشحا جديدا. روبرتسون وآخرون. 3 تستخدم أيضا الشذرة وما يليها من أجل تعيين STAT1 أهداف في انترفيرون γ (الإنترفيرون γ) في حفز وunstimulated الخلايا S3 هيلا البشرية في الجسم الحي. بواسطة Chip وما يليها، وذلك باستخدام 15.1 و 12.9 مليون تسلسل تعيين فريد يقرأ، ومعدل اكتشاف كاذبة المقدرة أقل من 0.001، وحددوا 41582 و11،004 المناطق STAT1 ملزم المفترضة في الخلايا حفز وunstimulated، على التوالي. من 34 مواضع معروفة لاحتواء STAT1 انترفيرون استجابة ملزم 4-8 المواقع، وجدت الشذرة وما يليها 24 (71٪). وقد أثرى أهداف الشذرة وما يليها في تسلسل مماثل ليعرف STAT1 زخارف ملزمة. مقارنات مع اثنين من بيانات الشريحة-PCR القائمة يحدد اقترحوكان أن حساسية رقاقة وما يليها ما بين 70٪ و 92٪، وكان التحديد لا يقل عن 95٪. بالإضافة إلى ذلك، كان من الواضح أن الشذرة وما يليها يقدم كل من التعقيد والحساسية التحليلية المنخفضة التي تزيد مع العمق التسلسل. كما توفر تقنيات التسلسل مثل، &quot;الجيل القادم&quot; الجينوم 1-2 أوامر من زيادة حجم في كمية تسلسل التي يمكن أن تكون فعالية من حيث التكلفة ولدت أكثر من التقنيات القديمة 9. ولذلك أساليب الشذرة وما يليها توفير تغطية مباشرة لكامل الجينوم التنميط فعالة من الثدييات تفاعلات البروتين DNA 3. في عام 2006، تم اكتشاف وجود ارتباط قوي من المتغيرات في عامل النسخ 7-2 مثل (TCF7L2) الجينات مع مرض السكري من النوع 2 10. وقد محققين آخرين بالفعل تكرارها بشكل مستقل هذه النتيجة في أعراق مختلفة و، ومن المثير للاهتمام، من الجينوم واسعة جمعية دراسات الأول من مرض السكري من النوع 2 نشرت في مجلة نيتشر 11،12 </sتصل&gt;، العلوم 13-15 وغيرها 16،17، وكان أقوى رابطة في الواقع مع TCF7L2، وهذا يعتبر الآن هذا الاكتشاف الجيني الأكثر أهمية في مرض السكري من النوع 2 حتى الآن 18-20. وبالإضافة إلى ذلك، وقد تم ربط TCF7L2 لمخاطر سرطان 21،22، بل أصبح هذا الصدد أكثر وضوحا عندما تبين أن موضع 8q24 التي كشفت عنها الجينوم واسعة جمعية دراسات لعدد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم، أن ذلك يعود إلى المنبع المدقع عنصر TCF7L2 ملزم القيادة نسخ من MYC 23،24. على هذا النحو، وهناك اهتمام كبير في تحديد الجينات المصب التي ينظمها هذا عامل النسخ مفتاح. على أساس الخبرة مع TCF7L2 كمثال على المنهجية، وتحدد هذه الورقة كيفية توليد قالب DNA الشذرة ذات جودة عالية. وقد أجريت الشذرة خارج القولون والمستقيم في خط خلية سرطان، HCT116، لتسلسل اللاحقة من أجل بناء-RESOL عاليةخريطة ution من الجينات ملزمة TCF7L2 25 في مسعى لانتاج مزيد من التبصر في لدورها الرئيسي في التسبب في الصفات المعقدة.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

(رقاقة وما يليها) طرق رقاقة تسلسل تقدم مباشرة تغطية كامل الجينوم، حيث الجمع بين لونين مناعي (رقاقة) ويمكن استخدامها على نطاق واسع التسلسل موازية للتعرف على ذخيرة من تسلسل الحمض النووي الثدييات ملزمة عوامل النسخ في الجسم الحي. &quot;الجيل التالي&quot; التكنولوجيات تسلسل الجينوم توفير 1-2 أوامر من زيادة حجم في كمية تسلسل التي يمكن أن تكون فعالية من حيث التكلفة ولدت أكثر من التقنيات القديمة وبالتالي السماح لأساليب الشذرة وما يليها مباشرة لتوفير تغطية كامل الجينوم لالتنميط فعالة من الثدييات تفاعلات البروتين DNA. لنهج الشذرة وما يليها ناجحة، يجب على المرء أن تولد قالب DNA الشذرة ذات جودة عالية للحصول على أفضل النتائج التسلسل. ويستند هذا الوصف حول تجربة مع المنتج البروتين من الجين متورط بشدة في التسبب في مرض السكري من النوع 2، وهما عامل عامل النسخ النسخ 7-2 مثل (TCF7L2). كما تم المتورطين هذا العامل في مختلف أنواع السرطان. المبين هو كيفية توليد قالب DNA عالية الجودة رقاقة المستمدة من القولون والمستقيم خط خلية سرطان، HCT116، من أجل بناء خريطة عالية الدقة من خلال التسلسل لتحديد الجينات ملزمة TCF7L2، وإعطاء مزيد من التبصر في لدورها الرئيسي في التسبب من الصفات المعقدة.

مرة واحدة وقد تم sonicated لونين وتم التعامل مع ريبونوكلياز وبروتين، ينبغي أن عينات تعمل على 2٪ الاغاروز هلام تقديم مسحة مع الجزء الأكبر من الحمض النووي في الحجم المطلوب. إذا تم اختبارها عدة دورات مختلفة، ينبغي أن ينظر إلى انخفاض تدريجي في حجم وعدد من زيادة دورات (الش?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq at JoVE.com

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

ويمكن الجمع بين لونين مناعي والتسلسل فائقة الإنتاجية (رقاقة وما يليها) تحديد ورسم خريطة التفاعلات البروتين DNA في نسيج أو خلية خط معين. المبين هو كيفية إنشاء قالب الشذرة ذات جودة عالية للتسلسل لاحقة، وذلك باستخدام الخبرة مع عامل TCF7L2 النسخ كمثال على ذلك.

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

24.3K Views.  Children's Hospital of Philadelphia Research Institute. ويمكن الجمع بين لونين مناعي والتسلسل فائقة الإنتاجية (رقاقة وما يليها) تحديد ورسم خريطة التفاعلات البروتين DNA في نسيج أو خلية خط معين. المبين هو كيفية إنشاء قالب الشذرة ذات جودة عالية للتسلسل لاحقة، وذلك باستخدام الخبرة مع عامل TCF7L2 النسخ كمثال على ذلك.

Video: Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

أساليب معدلة لتحميل عالية الإنتاجية ألواح استخراج الحمض النووي يقلل من احتمال التلوث

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...