الاستنشاق انها تستخدم لأداء فعالية ChIP التسلسل من كل من استر وغير استر البروتينات في الأنسجة الدهنية البني معزولة عن الماوس. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البروتوكول قد تم تحسينه من أجل الاعتيمة الفعالة للمجمع المرتبط بالكروماتين من الأنسجة الدهنية. قبل شق، رش الماوس القتل الرحيم مع الإيثانول 70٪.
وضع الماوس مع ظهره تواجه ما يصل، ثم جعل شق على طول الرقبة. بعد ذلك، تقع BAT مباشرة تحت الجلد بين الكتفين وإزالة بعناية طبقة رقيقة من الدهون البيضاء. عبر ربط كل لوحة BAT في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 1٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد 15 دقيقة، إرواء عبر ربط بإضافة 2.5 جليسين المولر إلى BAT، مما أدى إلى تركيز النهائي من 125 ملليمولار. ضعه على شاكر لمدة خمس دقائق، وتناوب على 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي وقت لاحق، نقل لوحة BAT إلى 500 ميكرولترات من العازلة التحلل تحلل lytonic وإضافة اثنين من الخرز الفولاذ المقاوم للصدأ لكل لوحة BAT.
ثم، استخدام التجانس الأنسجة القائمة على حبة لتمزيق الأنسجة. تبدأ مع خمس دقائق في السلطة القصوى. إذا لزم الأمر، تمديد الوقت حتى يتم تجانس الأنسجة ويتم فصل الخلايا الفردية.
نقل العينة إلى أنبوب جديد، والطرد المركزي في أربع درجات مئوية في 16،000 G لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق، نقل ناظر في أنبوب جديد والحفاظ على بيليه الخلية على الجليد. جهاز طرد مركزي في 4 درجات مئوية في 16، 000 G لمدة 10 دقائق لمنع فقدان الخلايا العائمة.
ثم، والتخلص من عظمى النهائي وإعادة تعليق كل من الكريات الخلية معا في 300 ميكرولترات من المخزن المؤقت SDS تحلل مع مثبطات protease مرة واحدة. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. المقبل، sonicate lysates لتوليد شظايا الحمض النووي 200 إلى 500 أزواج قاعدة طويلة.
بعد صوتنة، وإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 16، 000 G في أربع درجات مئوية. لأداء المناعي، والحفاظ على 1٪ من حل كروماتين جانبا كمدخلات ChIP والحفاظ على المدخلات بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك، إضافة الجسم المضاد ChIP إلى ملليلتر واحد من محلول الكروماتين وأداء المناعي الموازي مع IgG قبل المناعة المقابلة أو IgG العادية من نفس النوع.
بدلا من ذلك، حفظ ملليلتر واحد من محلول الكروماتين لمراقبة أي الأجسام المضادة. احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع التناوب. لجمع المجمعات المناعية، إضافة 50 ميكرولترات من البروتين أ agarose 50٪ الطين إلى المجمعات المناعية واحتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية مع دوران في 150 دورة في الدقيقة.
بعد ساعة، بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 1000 مرات G في أربع درجات مئوية. تنفيذ عمليات غسل متتابعة من الخرز على 0.45 ميكرومتر PVDF أعمدة تصفية الطرد المركزي مع المخازن المؤقتة من زيادة الصرامة عن طريق نقل أولا الخرز في الأعمدة مع 500 ميكرولترات من انخفاض الملح غسل العازلة. ثم، بيليه الخرز في الأعمدة لمدة ثلاث دقائق في G.Discard 2500 تدفق من خلال.
كرر الغسيل مع ارتفاع الملح غسل العازلة وفقا لإجراءات غسل الملح منخفضة. ثم، كرر الإجراءات مع كلوريد الليثيوم وأخيرا مع مرة واحدة TE. بعد الانتهاء من يغسل، elute المجمعات المناعية عن طريق إضافة 300 ميكرولترات من عازلة elution إلى الخرز بيليه في الأعمدة. احتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر في 400 دورة في الدقيقة.
في وقت لاحق، وجمع elute عن طريق الغزل أسفل الأعمدة لمدة ثلاث دقائق في 2500 G في أنبوب جديد. عكس الروابط المتقاطعة عن طريق احتضان elute والمدخلات التي تم جمعها في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لاستعادة الحمض النووي، إضافة 300 ميكرولترات من الفينول الكلوروفورم IAA إلى elute والمدخلات بمعدل واحد إلى واحد ودوامة لمدة 10 ثوان.
بعد ذلك، تدور أسفل في 21،000 G في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. الحفاظ على بيليه وتجاهل افر. غسل بيليه مع ملليلتر واحد من الإيثانول البارد 70٪.
ثم تدور أسفل في 21،000 G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل افرا والهواء الجافة بيليه. إعادة تعليق بيليه في 70 ميكرولترات من المياه الخالية من DNAse لمزيد من الإجراءات.
هنا مثال على ChIP Q PCR باستخدام BAT معزولة عن النمط البري أو فئران خروج المغلوب GPS2-A. وبما أن النظام العالمي لتحديد المواقع العالمي (GPS2) قد وجد أنه لازم للتعبير عن جينات الميتوكوندريا المشفرة نووياً في مختلف خطوط الخلايا، فقد تم اختبار توظيف نظام تحديد المواقع العالمي لتحديد المواقع (GPS2) على جينين محددين من جينات الميتوكوندريا المشفرة النووية. NDUFV1 و TOMM20 في BAT من الفئران كأمثلة على الأنسجة الغنية للغاية في الميتوكوندريا.
تم مقارنة إشغال المروج GPS2 في فئران خروج المغلوب GPS2-A والاصحاب رسالة نوع البرية. ولوحظ انخفاض متوقع في نظام تحديد المواقع العالمي (GPS2) الملزم على جينات مستهدفة انتقائية في BAT من فئران خروج المغلوب GPS2-A. باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، تم تسجيل زيادة الربط من البوليميراز RNA اثنين وعلامة histone القمعية ، H3K9ME3 ، في BAT من فئران خروج المغلوب GPS2 -A مقارنة بالزملاء رسالة نوع البرية.
وتؤكد هذه النتائج توظيف نظام تحديد المواقع العالمي (GPS2) على جينات ميتوكوندريا المشفرة النووية المختارة، وتبين أن النظام العالمي لتحديد المواقع (GPS2) مطلوب لمنع تراكم H3K9ME3، وبالتالي مطلوب لتعطيل النشاط النسخي للأعمدة اثنين على المروجين المستهدفين. البروتوكول الموصوف هنا، حتى لو كان الأمثل على وجه التحديد للأنسجة الدهنية البنية، يمثل أداة قيمة لأداء ChIP من مورين الأخرى والأنسجة البشرية. لا ننسى أن العمل مع الفينوكلوروفورم يمكن أن تكون خطرة للغاية.
لذلك، من المهم للغاية أن تعمل دائما تحت غطاء محرك الدخان أثناء استخدام هذا الكاشف.
