تم تنفيذ هذا العمل في جزء في مركز نظم النانومترية الحجم (CNS)، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية (NNIN)، وهو مدعوم من قبل مؤسسة العلوم الوطنية NSF تحت أي جائزة. ECS-0335765. CNS هو جزء من جامعة هارفارد.

ويمكن تقسيم البروتوكول لتوليد الانحياز الأنسجة عضلة القلب وظيفية إلى ثلاثة أجزاء رئيسية. لا يعتبر تصنيع سيد micropatterned باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة جزء من بروتوكول التالية ولكن يمكن أن تكون مصنوعة على أساس طريقة إنشاء 6. 1. طباعة Microcontact من [فيبرونكتين] على ركائز PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج Sylgard 184 الاستومر PDMS (داو كورنينج) في قاعدة 10:1 إلى نسبة علاج وكيل وديغا الجمعية باستخدام مجفف للقضاء على أي فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج PDMS ضد سيد ملفقة من قبل مع 20 ميكرون واسعة و 2 ميكرون طويل القامة التلال، مفصولة تباعد ميكرومتر (20) ليوم 2 إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 في ساعة 65 ° C للحصول على طوابع microtextured PDMS. </li></ol> ينصح بشدة * علاج داخل مجفف للقضاء على أي فقاعات الهواء. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور معطف PDMS على تغطية زلات الزجاج (على سبيل المثال22x22 ملم) في 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة باستخدام المغطي سبين زمن التقاطر لإنتاج رقيقة وحتى PDMS ركائز سمك ميكرومتر 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الطوابع مع الايثانول 70٪ لإزالة الغبار والجسيمات الترابية. السماح لهم الهواء الجاف. </li></ol> * يمكن استخدام طوابع عدة مرات، ومع ذلك، تجديد الطوابع PDMS على أساس منتظم ويوصى بسبب تآكل السطح مع مرور الوقت. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طوابع مكان في البلازما البلازما الأنظف الإعدادية SPI II وعملية لمدة 1 دقيقة إلى 275 mTorr لتقديم السطوح PDMS ماء. </li></ol> يجب أن يشاهد * العلاج البلازما الأكسجين. يمكن معالجة أوقات أطول يؤدي إلى تشقق المطاط الصناعي. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الطوابع مع الايثانول 70٪ لمدة 1 دقيقة. يجف بسرعة مع الهواء المضغوط. </li></ol> * يجب أن يتم تنفيذ خطوات أخرى في خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على العقم. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الأسطح مع القضاء Fibronectin الحل (50 ميكروغرام / مل في DDH 2 O). كثف السماح لها على الأقل 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من حل [فيبرونكتين] من الطوابع وتجف بسرعة مع الهواء المضغوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اقامة اتصال بين امتثالي الطوابع وركائز PDMS لمدة 2 دقيقة ثم اضغط بشدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع ركائز micropatterned DDH 2 O. تخزينها في DDH 2 O لمدة أقصاها 2 أسابيع في 4 درجات مئوية ما لم يستخدم في البداية. متجر PDMS الطوابع في DDH 2 O. </li></ol> 2. صيانة المعدلة وراثيا الجنينية مزدوجة خطوط الخلايا الجذعية الأولى، وإعداد وسائل الإعلام التالية للخلايا ES الماوس زراعة: الماوس الجنينية الخلايا الليفية (MEF)-المتوسطة: Dulbecco في معدلة النسر متوسطة (DMEM)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ES التمايز الخلوي أو الصف، 1٪ البنسلين الستربتوميسين-(P / S) الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)-المتوسطة: DMEM، 15٪ FBS ES خلية في الصف،1٪ لغير الأحماض الأمينية الأساسية (NEAA)، و 0.5٪ P / S، 0.2٪ عامل المثبطة اللوكيميا (LIF)، 0،0007٪ 2-المركابتويثانول (2-ME) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف 6 وحات جيدة مع الجيلاتين 0.1٪ العقيمة في DDH 2 O والسماح لها كثف 15 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة MEFs من قسامة إذابة لPBS مل 50 في أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لهم في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق MEFs في MEF المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد امتصاص الجيلاتين الرشفة، وMEFs الزائدة إضافة إلى الآبار. تسمح MEFs 1 يوم تعلق. </li></ol> * وقسامة من يكفي MEFs 10 ملايين لوحات 6 جيدا 3. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما MEFs يوليان، إضافة خلايا ES قسامة من إذابة لPBS مل 50 في أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لهم في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. خلايا ES resuspend في ESC المتوسطة وإضافتها إلى الآبار التي تحتوي على MEFs. خلايا ES الثقافة في ESC متوسطة حتى يتم التوصل إلى نقطة التقاء. </li></ol> * عندما وصلت خلايا ES التقاء، والركض REQUلتجنب فرط IRED والحفاظ على المستعمرات الخلية ES. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الجذعية الجنينية لالركض. الرشفة ESC المتوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBS وإضافة 500 ميكرولتر من التربسين. عملية 3،5 دقيقة في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الحل التربسين صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر المستعمرات الخلية ES وتحييده مع 500 ميكرولتر من ESC المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا ES مرور وفقا لنسبة تريدها، على سبيل المثال نقل 33 ميكرولتر إلى أخرى بشكل جيد مع سبق إعدادها MEFs لمرور 1/30. الحفاظ على خلايا ES ESC في المتوسط. </li></ol> * A نسبة مرور 30/1 يسمح خلايا ES للوصول إلى التقاء في غضون 3 أيام. خلايا ES مرور وفقا لجدول زمني الخاص في تمايز المختبر. 3. في التمايز المختبر المحورة جينيا الجنينية مزدوجة خطوط الخلايا الجذعية وعزل والبذر من الأسلاف القلب أولا، إعداد followiوسائل الإعلام نانوغرام اللازمة لتمايز الخلايا في المختبر ES: التكيف المتوسطة: متوسط ​​Iscove في Dulbecco معدلة ل(IMDM)، 15٪ FBS ES خلية في الصف، 1٪ NEAA، 0.5٪ P / S، 0.2٪ LIF، 0،0007٪ 2-ME تمايز المتوسطة: IMDM، 15٪ FBS التمايز في الصف. 1 NEAA٪، 0.5٪ P / S، 0.35٪ من حامض الاسكوربيك 0.1M، 0،0007٪ 2-ME <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ في التمايز المختبر عندما خلايا ES وصلت التقاء. معطف الثقافة أطباق 10 سم مع الجيلاتين 0.1٪ العقيمة في DDH 2 O والسماح لها كثف 15 دقيقة عند 37 ° C. </li></ol> * كن على علم مدة عملية التمايز في المختبر. يستغرق 8 أيام حتى يمكن عزل الأسلاف القلب. خطة التجارب وفقا لذلك. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا ES الحصاد كما كان من قبل. بعد امتصاص الجيلاتين الرشفة، الزائدة وإضافة ما يقرب من 1/3-1/2 ES التعليق الخلية لثقافة المعدةالأطباق التي تحتوي على التكيف والمتوسط. الخلايا الثقافة لمدة 2 ايام. </li></ol> * اختر كمية الخلايا الجذعية الجنينية للتكيف وفقا لتجاربك. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد تكييف الخلايا الجذعية الجنينية في أنبوب 50 مل المخروطية التي تحتوي على PBS باستخدام 1. 5 مل من التربسين. أجهزة الطرد المركزي الخلايا ES فصل في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend لهم في متوسطة التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الهيئات مضغي الشكل (EBS) من الخلايا حوالي 1،000 انخفاض بنسبة 10 ميكرولتر في 15 سم الأطباق ثقافة استخدام ماصة متعدد القنوات. عكس لوحات والثقافة وEBS شنقا قطرات مقابل 2.5 أيام في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2.5 يوم، حمام سباحة EBS من 6-8 سم 15 طبق الثقافة في C. باستخدام التمايز المتوسطة والثقافة منهم لأيام أخرى 3،5 في 37 ° 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أيام 3،5، وجمع EBS في أنبوب مخروطي 50 مل والسماح لهم تنزل الى القاع لحوالي 5 دقائق. تملق طاف وغسل EBS مع PBS العقيمة. اسمحوا EBS تغرق مرة أخرى إلى أسفل لapproximately 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل EBS من معالجتها مع 2. 5 مل من التربسين لمدة 2 دقيقة في حمام مائي عند 37 ° C تهز أنبوب بهدوء. ثم، إضافة 2. 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى حل التربسين وماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 10 مل تقريبا المصلية 8-10 مرات لكسر كتل الخلايا. تحييد التربسين مع 10 مل من العازلة FACS تحتوي على 7.5٪ FBS الخلايا أو التمايز الصف ES-0.01٪ ودابي في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في فصل EBS 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend لهم في حوالي 1 مل من العازلة FACS. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 1 مل تقريبا 8-10 مرات لكسر كتل الخلايا. </li></ol> * إضافة FACS العازلة وفقا لكمية تقدر ب EBS فصلها. قد تتركز خلايا جدا جدا تسد خلال FACS والخلايا المركزة منخفضة جدا قد يطيل FACS الوقت دون داع. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب الجولة القاع العقيمة مع مصفاة الخلية 35 ميكرومتر للحصول علىتعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا ES نوع متباينة باستخدام قياس التدفق الخلوي FACSAria والحصول على تنقية سكان CVP. </li></ol> * وضعنا استراتيجية متعددة الخطوات النابضة لعزل الخلايا الملونة عالي النقاء. وباختصار، فإننا البوابة الأولى على السعة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) والسعة الجانب مبعثر (SSC-A) (الشكل 1A). وهذا يسمح لنا لفصل الخلايا من الحطام الخلوية كله. ونحن على بوابة FSC ثم-A-مبعثر إلى الأمام والعرض (FSC-W) (1B الشكل). وهذا يسمح لنا لعزل singlets خلية من الحلل والمجاميع الخلوية الأخرى. ونحن على بوابة SSC ثم-A-مبعثر والجانبية العرض (SSC-W) (الشكل 1C). هذا يزيد من نقاء singlets الخلية. ونحن على بوابة ثم تلوين دابي لعزل خلايا قابلة للحياة (دابي سلبية) غير قابلة للحياة من الخلايا (1D الشكل). ونحن على بوابة السعة ثم Phycoeryhthrin (PE-A) وPE-Cyanine صبغ 7 السعة (PE-Cy7-A) للحصول صحيح الحمراء الإيجابية (R + </سوب&gt;) وصحيح الحمراء السلبية (R - الخلايا) واستبعاد autofluorescent الحمراء السلبية الخلايا (الشكل 1E). R + R و- الخلايا هي بوابات ثم بشكل منفصل على السعة ثيوسيانات فلوريسئين (FITC-A) وPE-A لفرز صحيح الخضراء إيجابية (G +) وصحيح الخضراء السلبية (G -) + الخلايا داخل هؤلاء السكان (الشكل 1F 1G). هذه النتائج في 4 السكان من الخلايا كما يلي: R + G +، R + G -، R - G + R و- G - (الشكل 1H). <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف فاعلية micropatterned ركائز مع بلورونيك 1٪ F-127 في DDH 2 O لمدة 10 دقيقة. ثم، يغسل لهم 3x مع PBS العقيمة. </li></ol> * بلورونيك F-127 هو بالسطح أن خلية التصاق القطع. انها تؤيد الحبس من التصاق الخلية إلى منطقة micropatterned. <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جوانات إرفاق PDMS منقوشة في المنطقةواضغط بشدة. CVP ثم البذور، وعلى ركائز micropatterned [فيبرونكتين]. </li></ol>

<ol>
	<li>Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+functional+heart+tissue+for+myocardial+repair.">Regenerating functional heart tissue for myocardial repair.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li><li>Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiogenesis+and+the+complex+biology+of+regenerative+cardiovascular+medicine.">Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine.</a> Science. 322, 1494-1497 (2008).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326, 426-429 (2009).</li><li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).</li><li>Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+aspects+of+cardiac+tissue+engineering.">Physiological aspects of cardiac tissue engineering.</a> Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).</li><li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices.">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li><li>Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+regulates+collagen+type+I+expression+in+human+tendon+fibroblasts.">Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).</li><li>Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+tissue+engineering:+microtextured+scaffold+templates+to+control+organization+of+vascular+smooth+muscle+cells+and+extracellular+matrix.">Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).</li><li>Isenberg, B. C., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+structure+into+engineered+tissues.">Building structure into engineered tissues.</a> Materials Today. 9, 54-60 (2006).</li><li>Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+biomechanics+in+tissue+engineering+of+bone.">Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).</li><li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+contractile+strength+of+engineered+cardiac+muscle+by+hierarchal+tissue+architecture.">Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture.</a> Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).</li><li>Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification.">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs.">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).</li><li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells.">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).</li><li>Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+approach+to+micropattern+cells+on+common+culture+substrates+by+tuning+substrate+wettability.">Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability.</a> Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).</li><li>Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+postnatal+growth+of+the+murine+heart.">Characterisation of postnatal growth of the murine heart.</a> Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).</li><li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development.">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+pathologic+cardiac+hypertrophy+in+adulthood+is+preceded+by+neonatal+cardiac+growth+restriction.">Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).</li><li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).</li><li>Ohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+of+the+transverse-axial+tubule+system+in+ventricular+cardiomyocytes+from+failing+and+non-failing+human+hearts.">Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts.</a> Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).</li><li>Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+cell+sheets+for+constructing+three-dimensional+tissue+with+well-organized+cell+orientation.">Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation.</a> Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).</li><li>Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stacking+of+aligned+cell+sheets+for+layer-by-layer+control+of+complex+tissue+structure.">Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure.</a> Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

في هذا البروتوكول، قدمنا ​​طريقة لعزل السكان تنقيته من الأسلاف قلبية والبذور منها على ركائز [فيبرونكتين] micropatterned ما يسمح لهم التوفيق واتخاذ شكل قضيب خلية عضلية قلبية مثل. منظمة الخلوية العادية أمر بالغ الأهمية من أجل وظيفة الأنسجة الطبيعية 8،10، ولا سيما بالنس...

على الرغم من التطورات الحديثة في العلاج الطبي، قصور القلب المتقدمة لا يزال السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في العالم المتقدم. متلازمة سريرية تنشأ من فقدان أنسجة عضلة القلب الوظيفية وبعد ذلك عدم قدرة القلب فشلها في تلبية مطالب الأيضية للأفراد المتضررين. منذ القلب لديه قدرة محدودة التجدد، ذاتي زرع القلب هو العلاج الوحيد الحالي قبلت سريريا تهدف بصورة مباشرة إلى تجديد أنسجة القلب فقدت وظيفية. عيوب كبيرة زرع القلب، بما في ذلك عدد محدود من قلوب المانحة والحاجة إلى المعالجة طويلة المدى مناعة يحول دون انتشار واسع لاستخدام هذا العلاج. ونتيجة لذلك، كان العلاج الطبي الدعامة الأساسية لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض القلب. ومن التحديات الرئيسية في تطوير العقاقير هو تحديد المقايسات الخلوية التي تلخص بدقة عضلة القلب الفيزيولوجيا العادية والمريضة في المختبر. <html> التقارب الأخير لبيولوجيا الخلية الجذعية والأنسجة تكنولوجيا الهندسة يثير سبل جديدة واعدة لتجديد القلب. وتوليد الأنسجة القلبية وظيفية من مصدر المريض محددة قابلة للتجديد تكون تقدما كبيرا في هذا المجال. هذا من شأنه أن يسمح لتطوير فحوصات الأمراض الخلوية محددة لتطوير العقاقير واكتشاف وسوف يضع الأساس للطب التجديدي القلب. الإنسان الجذعية الجنينية (ES) والخلايا، بشكل ملحوظ أكثر من ذلك، الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها الخلايا (آي بي إس) تمثل المتجددة يحتمل المريض محددة مصدر الخلايا الاصلية البطين والبطين myocytes ناضجة. الجمع بين علم الأحياء الخلايا الجذعية وهندسة الأنسجة استراتيجيات تعالج هذه المشكلة عن طريق توليد أنسجة القلب وظيفية في المختبر والتي يمكن استخدامها في تطوير المقايسات الخلوية لاكتشاف المخدرات أو في النهج التجديدي القلب لعلاج قصور القلب المتقدمة. _content &quot;&gt; قد يشكل تحديا رئيسيا في تجديد القلب تحديد نوع الخلية المثلى. وقد تم دراسة مجموعة واسعة من A الخلايا 1، لكن حتى الآن، على الرغم من أن تم اكتشاف مختلف السلائف قلبية متعددة القدرات من مصادر مختلفة، وتحديد خلية المصدر الذي يلبي متطلبات الأساسية مثل الالتزام مصير الخلية عضلي، وقد ثبت صيانة القدرة على التوسع في الجسم الحي أو في المختبر، وتكوين الأنسجة وإلى عضلة القلب وظيفية مشكلة المركزية 2. لقد سبق وصفها نظام مزدوج الفئران المعدلة وراثيا تمكن من عزل عالي النقاء من السكان الأسلاف البطين الملتزمين (CVP) من خلايا ES التفريق في المختبر، ونحن ولدت رواية الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن ضعف البروتين الحمراء الفلورسنت dsRed تحت سيطرة محسن Isl1 التي تعتمد على الجينات وMEF2c وتعزيز بروتين الفلورية الخضراء الخاضعة لسيطرةوالقلب محددة Nkx2.5 محسن. بناء على هذا النظام لمدة الملونة مراسل الفلورسنت، والأولى والثانية من القلب الأسلاف مجال الخلايا الجذعية الجنينية النامية يمكن أن تكون معزولة عن طريق الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS) وفقا لتعبيره من MEF2c والجينات Nkx2.5. CVP تشبه myocytes القلب استنادا إلى أنماط التعبير عن علامات عضلة القلب والصفات الهيكلية والوظيفية 3، ما يقدم وعدا كبيرا لأغراض التجدد القلب الأنسجة. وإن كانت هناك العديد من التطورات في مجال هندسة الأنسجة، ومحاكاة العمارة الخلوية المحلية لا يزال يشكل تحديا رئيسيا. الأساليب التقليدية لمواجهة هذا التحدي وتشمل البذر السقالات البيولوجية أو الاصطناعية مع خلايا في المختبر. بسبب وجود عدد من العيوب من السقالات، بما في ذلك تدهور السريع، ومحدودية الاستقرار الفيزيائية والميكانيكية وانخفاض كثافة الخلايا 1،4،5، حاولنا لهندسة الأنسجة سقالة أقل. ALTهوغ خلايا القلب يمكن تعديل المكروية المحلية من إفراز البروتينات المصفوفة خارج الخلية، لديهم قدرة محدودة أكثر على تنظيم أنفسهم لmyocytes قضيب على شكل القلب في حالة عدم وجود إشارات خارج الخلية. وبالتالي، لا بد من القالب الذي يقدم العظة المكانية المناسبة الخلايا والبيولوجية لتكوين الأنسجة عضلة القلب وظيفية. الطباعة Microcontact يتناول هذا التحدي من خلال توفير تقنية بسيطة وغير مكلفة للسيطرة على وجه التحديد شكل الخلية، والتنظيم، وظيفة 6-8، وكلها حاسمة بالنسبة لجيل من الأنسجة الانحياز عضلة القلب وظيفية. ويضم استخدام الطوابع microtextured (PDMS) Polydimethylsiloxane مع أحجام تتراوح ميزة أسفل إلى 2 ميكرون 9 أن تمكين ترسب البروتينات المصفوفة خارج الخلية على ركائز PDMS في أنماط دقيقة وبالتالي تؤثر على التصاق الخلايا مكانيا. هنا، نقترح الجمع بين الأنسجة تكنولوجيا الهندسة الحيوية مع سل الجذعيةL البيولوجيا لتوليد أنسجة عضلة القلب متباين الخواص الوظيفية. وفقا لذلك، علينا أن نبرهن هنا نهجنا نشرت مؤخرا ما يلي: (1) توليد الأسطح البروتين micropatterned على ركائز PDMS من الطباعة microcontact لتوليد نموذج للالأنسجة الانحياز عضلة القلب، (2) عزل عالي النقاء الأسلاف من القلب خلايا ES التفريق في المختبر، و (3) الجمع بين كل من التقنيات لتوليد الانحياز الأنسجة عضلة القلب وظيفية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> L-حمض الأسكوربيك </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A4544 </td><td> إعداد 0.1M الحل في DDH 2 O </td></tr><tr><td> مجفف، فراغ 10 بوصة </td><td> نوفا للتكنولوجيا الدولية، وشركة </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;،6-Diamidino-2-Phenylindole، هيدروكلوريد (دابي) </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco في معدلة النسر متوسطة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria عداد الكريات II تدفق </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنينES خلية في الصف </td><td> الجوزاء الحيوية المنتجات </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين التمايز الصف </td><td> الجوزاء الحيوية المنتجات </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> فبرونيكتين من البلازما البقري </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F4759 </td><td> ذوبان إلى 1 ملغ / مل في DDH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest ممتاز غطاء زجاج 22x22mm </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> الجيلاتين من جلد الخنزير </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G1890 </td><td> إعداد الحل 0.1٪ في DDH 2 O </td></tr><tr><td> تقدم سبين المغطي </td><td> تقدم البحوث، وشركة </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove في Dulbecco معدلة للمتوسطة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> العامل المثبط للسرطان الدم </td><td> النفسواستعدادا من خطوط الخلايا المفرزة للLIF </td><td></td><td> إعداد محلول المخزون 500X </td></tr><tr><td> MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> الخلايا الليفية الماوس الجنينية </td><td> حصاد اليوم من أجنة الفأر 12-15 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> بلورونيك F-127 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P2443 </td><td> إعداد الحل 1٪ في DDH 2 O </td></tr><tr><td> ذهابا وأسفل الأنبوب مع 35 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI البلازما الأنظف الإعدادية II البلازما </td><td> وازم SPI </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard184 كيت سيليكون إلاستومر </td><td> داو كورنينج </td><td> 184 SIL المرانة KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0.25٪ التربسين EDTA- </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> فراغ مقياس </td><td> وازم SPI </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

قصور القلب المتقدمة يمثل أحد أكبر التحديات التي لم تلب السريرية، والتي تنشأ من فقدان قابلة للحياة و / أو وظيفية بالكامل خلايا عضلة القلب. على الرغم من العلاج الدوائي الأمثل، وفشل القلب تمثل السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في العالم المتقدم. ومن التحديات الرئيسية في تطوير العقاقير هو تحديد المقايسات الخلوية التي تلخص بدقة الطبيعي وعلم وظائف الأعضاء المريضة عضلة القلب الإنسان في المختبر. وبالمثل، فإن التحديات الرئيسية في مجال البيولوجيا القلب التجدد تدور حول تحديد وعزل المريض محددة الأسلاف القلب بكميات ذات الصلة سريريا. هذه الخلايا ثم يجب أن يتم تجميعها في الأنسجة الوظيفية التي تمثل العمارة المحلية أنسجة القلب. الطباعة Microcontact يسمح لإنشاء الأشكال الدقيقة البروتين micropatterned التي تشبه التنظيم الهيكلي للقلب، وبالتالي توفير العظة الهندسية للسيطرة على التصاق الخلايا مكانيا. هناوصفنا نهجنا لعزل خلايا عضلة القلب عالي النقاء من الخلايا الجذعية المحفزة التفريق في المختبر، وتوليد السطوح نمو الخلايا micropatterned مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية، والجمعية من الخلايا الجذعية المستمدة من خلايا عضلة القلب إلى نسيج عضلة القلب متباين الخواص.

كشفت FACS لتنقية الخلايا من في المختبر ES متباينة 4 السكان متميزة من الأسلاف (الشكل 1). وأكد وجود [فيبرونكتين] micropatterned بواسطة المجهر المناعي أن عرض كاملة من خطوط نقل [فيبرونكتين] مستمرة (الشكل 2). أدى الطلاء من FACS معزولة الأسلاف على micropatterns [فيبرونكتين...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing at JoVE.com

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

توليد الأنسجة عضلة القلب الانحياز هو مطلب رئيسي لتكييف التطورات الحديثة في بيولوجيا الخلايا الجذعية لأغراض مفيدة سريريا. هنا نحن تصف نهج الطباعة microcontact لمراقبة دقيقة من شكل الخلية ووظيفتها. استخدام عالي النقاء السكان من الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة الأسلاف القلب، ونحن توليد الأنسجة عضلة القلب ثم متباين الخواص الوظيفية.

توليد الأنسجة الانحياز عضلة القلب من خلال طباعة وظيفية Microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

generation-aligned-functional-myocardial-tissue-through-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. توليد الأنسجة عضلة القلب الانحياز هو مطلب رئيسي لتكييف التطورات الحديثة في بيولوجيا الخلايا الجذعية لأغراض مفيدة سريريا. هنا نحن تصف نهج الطباعة microcontact لمراقبة دقيقة من شكل الخلية ووظيفتها. استخدام عالي النقاء السكان من الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة الأس?...

Video: Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

تصنيع مواد حقن المشتقة بيولوجيا للهندسة الأنسجة عضلة القلب

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

افتعال ركائز الثقافة معقدة باستخدام الروبوتية Microcontact الطباعة (R-μCP) وتبديل أليف النواة متسلسل

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

جيل ومسمار سفن الهندسة الأنسجة في نموذج الفأر

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

ثلاثي الأبعاد الأنسجة المهندسة الانحياز شبكات Astrocyte الخص الآليات الإنمائية وتيسير التجدد العصبي

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

الاساسيه/شل السقالات الطباعة للهندسة الانسجه من الهياكل أنبوبي

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

التوصيف الكمي واللثي للأكياس الظهارية الظهارية الوظيفية والمستقطبة

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...