Este trabajo se llevó a cabo, en parte, en el Centro de Sistemas de nanoescala (SNC), miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura (NNIN), que es apoyada por la National Science Foundation NSF con la beca no. ECS-0.335.765. CNS es parte de la Universidad de Harvard.

El protocolo para generar alineado tejido miocárdico funcional se puede dividir en tres partes principales. La fabricación del maestro micropatterned utilizando técnicas litográficas blandas no se considera parte de la siguiente protocolo pero se puede hacer basado en el método establecido 6. 1. Microcontacto impresión de fibronectina en PDMS Sustratos <ol><li> Mezclar Sylgard 184 (Dow Corning) elastómero PDMS en una base de relación de 10:1 a curar agente y desgasificar el conjunto utilizando un desecador para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Curar PDMS contra un maestro previamente fabricado con 20 micras de ancho y 2 crestas altas mu m, separadas por espaciamiento 20 micras, ya sea para 2 días a temperatura ambiente o 4 hr a 65 ° C para obtener Microtexturados Sellos de PDMS. </li></ol> * El curado en un desecador es muy recomendable para eliminar las burbujas de aire. <ol start="3"><li> Girar capa PDMS sobre cubreobjetos de vidrio (por ejemplo,22x22 mm) a 5.000 rpm durante 2 min utilizando una recubridora de rotación Avanza para producir fina y uniforme PDMS sustratos de espesor 15 micras. </li><li> Limpie sellos con etanol al 70% para eliminar el polvo y las partículas de suciedad. Deje secar al aire. </li></ol> Sellos * Puede ser utilizado en varias ocasiones, sin embargo, la renovación de sellos de PDMS sobre una base regular es recomendado debido a una abrasión en la superficie con el tiempo. <ol start="5"><li> Sellos de lugar en un limpiador de plasma SPI-Prep II de plasma y un proceso para 1 min a 275 mTorr para hacer superficies de PDMS hidrófilo. </li></ol> * El oxígeno tratamiento de plasma deben ser observados. Los tiempos más largos de tratamiento puede dar lugar a la formación de grietas del elastómero. <ol start="6"><li> Sellos de esterilizar con 70% de etanol durante 1 min. Secar rápidamente con aire comprimido. </li></ol> * Otros pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad. <ol start="7"><li> Cubra las superficies de sello con Fibronectin solución (50 mg / ml en ddH 2 O). Dejar que se adsorben al menos 10 min. </li><li> Sacuda solución de fibronectina sellos y se secan rápidamente con el aire comprimido. </li><li> Establecer contacto conforme entre sellos y sustratos PDMS durante 2 minutos y presione firmemente. </li><li> Enjuague con sustratos micropatterned ddH 2 O. Guárdelos en ddH 2 O para un máximo de 2 semanas a 4 ° C, a menos inicialmente utilizado. Tienda PDMS sellos en ddH 2 O. </li></ol> 2. Mantenimiento de dobles transgénicos Líneas de células madre embrionarias Primero, prepare los siguientes medios para el cultivo de células madre embrionarias de ratón: Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)-Medio: Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% suero bovino fetal (FBS) de células ES-o diferenciación de grado, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) Células madre embrionarias (ESC)-Medio: DMEM, 15% FBS células ES-grado,1% no aminoácidos esenciales (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,0007% de 2-mercaptoetanol (2-ME) <ol><li> Capa 6-y las placas con gelatina estéril al 0,1% en ddH 2 O y se deja absorber 15 min a 37 ° C. </li><li> Añadir MEFs de una parte alícuota se descongeló a 50 ml de PBS en un tubo cónico y centrifugar de ellos a 1.000 rpm durante 5 min. Resuspender en MEFs MEF-medio plazo. </li><li> Después de la adsorción, aspirado exceso de gelatina y MEFs complemento en los pocillos. Permitir MEFs 1 día a adjuntar. </li></ol> * Una alícuota de 10 millones de MEFs suficiente para 3 placas de 6 pocillos. <ol start="4"><li> Cuando MEFs han unido, añadir las células ES a partir de una parte alícuota se descongeló a 50 ml de PBS en un tubo cónico y centrifugar de ellos a 1.000 rpm durante 5 min. Resuspender las células madre embrionarias en ESC-medio y agregar a los pocillos que contienen MEFs. Las células madre embrionarias en cultivo ESC-medio hasta que se alcanza la confluencia. </li></ol> * Una vez que las células madre embrionarias han alcanzado la confluencia, los pases se required para evitar el crecimiento excesivo y mantener colonias de células ES. <ol start="5"><li> Preparar las células madre embrionarias para pasajes. Aspirar ESC-medio y lavar una vez con PBS estéril. </li><li> Aspirar el PBS y se añaden 500 l de tripsina. Proceso de 3,5 min a 37 ° C. </li><li> Vierta la solución Tripsina arriba y abajo varias veces para romper las colonias de células ES y neutralizarla con 500 l de ESC-medio. </li><li> Passage células ES de acuerdo a su proporción deseada, por ejemplo, transferencia 33 l a otra así preparada previamente con MEFs paso a 1/30. Mantener las células madre embrionarias en ESC-Media. </li></ol> * Una relación de paso de 1/30 permite que las células ES para la confluencia en 3 días. Las células madre embrionarias Pasaje de acuerdo a su horario de diferenciación in vitro. 3. Diferenciación in vitro de dobles transgénicos Líneas de células madre embrionarias y el aislamiento y siembra de células progenitoras cardíacas En primer lugar, preparar el followimedios ng necesario para la diferenciación in vitro de células ES: Adaptación-Medio: medio modificado de Dulbecco Iscove (IMDM), 15% FBS células ES de grado, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% de 2-ME Diferenciación-Medio: IMDM, el 15% de SFB Diferenciación grado. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% de ácido ascórbico 0,1 M, 0,0007% de 2-ME <ol><li> Iniciar la diferenciación in vitro cuando las células ES han llegado a la confluencia. Escudo 10 cm de platos de cultivo estéril con 0,1% de gelatina en ddH 2 O y se deja adsorber 15 min a 37 ° C. </li></ol> * Tenga en cuenta la duración del proceso de diferenciación in vitro en. Se tarda 8 días hasta progenitoras cardíacas pueden ser aislados. Planifique sus experimentos en consecuencia. <ol start="2"><li> Cosecha de células madre embrionarias como antes. Después de la adsorción, el exceso de aspirado de gelatina y añadir aproximadamente 1.3 a 1.2 de la suspensión de células ES para cultivo preparadoplatos que contienen Adaptación y medio plazo. Células de cultivo durante 2 días. </li></ol> * Seleccione la cantidad de células madre embrionarias para la adaptación de acuerdo a sus experimentos. <ol start="3"><li> Cosecha adaptado células ES en un tubo cónico de 50 ml que contenía PBS utilizando 1. 5 ml de tripsina. Centrifugar las células disociadas ES a 1.000 rpm durante 5 min y se resuspenden en ellos Diferenciación-medio. </li><li> Hacer cuerpos embrioides (EB) de aproximadamente 1.000 células por 10 l gota en 15 cm de platos de cultivo usando una pipeta multicanal. Invertir las placas y EBS cultura como colgar gotitas durante 2,5 días a 37 ° C. </li><li> Después de 2,5 días, la piscina de EBs de 6-8 15 cm de platos de cultivo en un medio de diferenciación por medio-y cultivarlos durante otros 3,5 días a 37 ° C. </li><li> Después de 3,5 días, recoger embrioides en un tubo cónico de 50 ml y dejar que se hunden al fondo durante aproximadamente 5 min. Aspirar el sobrenadante y lavar EBS con PBS estéril. Vamos EBS hundirse de nuevo a la parte inferior de aproxoximately 5 min. </li><li> Disociar EBS mediante el procesamiento de ellos con 2. 5 ml de tripsina durante 2 min en un baño de agua a 37 ° C agitando suavemente el tubo. A continuación, agregue 2. 5 ml de PBS estéril a la solución de tripsina y pipetear arriba y abajo con una pipeta de 10 ml serológica aproximadamente 8-10 veces para romper los grupos de células. Neutralizar la tripsina con 10 ml de tampón FACS que contenía 7,5% de FBS células ES o diferenciación de grado y 0,01% en PBS DAPI. </li><li> Centrifugar disociado de EBs a 1.000 rpm durante 5 min y resuspender ellos en aproximadamente 1 ml de tampón FACS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml aproximadamente 8-10 veces para romper grupos de células. </li></ol> * Añadir tampón FACS de acuerdo con la cantidad estimada de disociar EBS. Células demasiado concentrados pueden obstruir durante FACS y células concentradas demasiado bajas pueden prolongar el tiempo de FACS innecesariamente. <ol start="9"><li> Transferir las células a un recipiente estéril de fondo redondo de tubo con un filtro de células 35 micras para obteneruna suspensión de células individuales. </li><li> Clasificar las células diferenciadas ES utilizando un citómetro de flujo FACSAria y obtener poblaciones purificadas de CVP. </li></ol> * Se desarrolló una estrategia de puerta de varios pasos para aislar células altamente purificadas de colores. En resumen, primera puerta a la amplitud dispersión frontal (FSC-A) y la amplitud de dispersión lateral (SSC-A) (fig. 1A). Esto nos permite separar las células enteras a partir de los desechos celulares. A continuación, en la puerta de FSC-A y Forward Scatter-Ancho (FSC-W) (fig. 1B). Esto nos permite aislar células singletes de dobletes y otros agregados celulares. A continuación, en la puerta SSC-A y Side Scatter-Ancho (SSC-W) (Figura 1 C). Esto aumenta la pureza de singletes de células. A continuación, la puerta en la tinción DAPI para aislar células viables (DAPI-negativa) a partir de células no viables (Figura 1D). A continuación, la puerta en Phycoeryhthrin Amplitud (PE-A) y PE-colorante de cianina 7 Amplitud (PE-Cy7-A) para obtener cierto rojo-positivo (R + </sup&gt;) y verdaderos negativos en rojo (R - células) y para excluir autofluorescentes rojo-negativos células (Figura 1E). R + y R - células son luego cerrada por separado en amplitud con isotiocianato de fluoresceína (FITC-A) y PE-A para ordenar verdaderos verde-negativas (G -)-positivos verde (G +) y cierto células dentro de estas poblaciones (Figura 1F + 1G). Esto resulta en 4 poblaciones de células como sigue: R + G +, R + G -, R - G + y R - G - (Figura 1H). <ol start="11"><li> Pasivar micropatterned sustratos con 1% de Pluronic F-127 en ddH 2 O durante 10 min. Entonces, lávelos 3 veces con PBS estéril. </li></ol> * Pluronic F-127 es un tensioactivo que bloquea la adhesión celular. Es compatible con el confinamiento de la adhesión celular a la superficie microestructurada. <ol start="12"><li> Coloque juntas PDMS alrededor de la región modeladay presione firmemente. Entonces, las semillas de CVP en fibronectina sustratos micropatterned. </li></ol>

<ol>
	<li>Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+functional+heart+tissue+for+myocardial+repair.">Regenerating functional heart tissue for myocardial repair.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li><li>Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiogenesis+and+the+complex+biology+of+regenerative+cardiovascular+medicine.">Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine.</a> Science. 322, 1494-1497 (2008).</li><li>Domian, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+ventricular+heart+muscle+from+mouse+ventricular+progenitor+cells.">Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells.</a> Science. 326, 426-429 (2009).</li><li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+in+tissue+engineering:+general+approaches+and+tissue-specific+considerations.">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).</li><li>Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+aspects+of+cardiac+tissue+engineering.">Physiological aspects of cardiac tissue engineering.</a> Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).</li><li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices.">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li><li>Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+regulates+collagen+type+I+expression+in+human+tendon+fibroblasts.">Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts.</a> Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).</li><li>Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+tissue+engineering:+microtextured+scaffold+templates+to+control+organization+of+vascular+smooth+muscle+cells+and+extracellular+matrix.">Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix.</a> Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).</li><li>Isenberg, B. C., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+structure+into+engineered+tissues.">Building structure into engineered tissues.</a> Materials Today. 9, 54-60 (2006).</li><li>Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+biomechanics+in+tissue+engineering+of+bone.">Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).</li><li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+contractile+strength+of+engineered+cardiac+muscle+by+hierarchal+tissue+architecture.">Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture.</a> Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).</li><li>Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification.">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs.">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).</li><li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells.">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).</li><li>Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+approach+to+micropattern+cells+on+common+culture+substrates+by+tuning+substrate+wettability.">Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability.</a> Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).</li><li>Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+postnatal+growth+of+the+murine+heart.">Characterisation of postnatal growth of the murine heart.</a> Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).</li><li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development.">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+pathologic+cardiac+hypertrophy+in+adulthood+is+preceded+by+neonatal+cardiac+growth+restriction.">Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).</li><li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).</li><li>Ohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+of+the+transverse-axial+tubule+system+in+ventricular+cardiomyocytes+from+failing+and+non-failing+human+hearts.">Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts.</a> Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).</li><li>Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+cell+sheets+for+constructing+three-dimensional+tissue+with+well-organized+cell+orientation.">Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation.</a> Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).</li><li>Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stacking+of+aligned+cell+sheets+for+layer-by-layer+control+of+complex+tissue+structure.">Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure.</a> Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

En este protocolo, hemos presentado un método para aislar poblaciones purificadas de células progenitoras cardiogénico y sembrar en ellos micropatterned sustratos fibronectina lo que les permite alinear y dar un miocito cardíaco-como forma de bastón. Organización celular normal es crítica para la función del tejido normal de 8,10, en particular para el tejido miocárdico. Los miocitos cardíacos se ha demostrado que desarrollar mecánica mejorada y propiedades electrofisiológicas 11,12 11,13</su...

A pesar de los recientes avances en el tratamiento médico, la insuficiencia cardíaca avanzada sigue siendo una causa importante de mortalidad y morbilidad en los países desarrollados. El síndrome clínico surge de una pérdida de tejido funcional del miocardio y, posteriormente, la incapacidad del corazón insuficiente para satisfacer las demandas metabólicas de los individuos afectados. Puesto que el corazón tiene una capacidad regenerativa limitada, el trasplante autólogo de corazón es el único tratamiento actual clínicamente aceptado directamente dirigidas a la reposición de tejido perdido corazón funcional. Inconvenientes significativos de trasplante de corazón, incluyendo un número limitado de corazones de donantes y la necesidad de que a largo plazo la terapia inmunosupresora, impide el uso generalizado de esta terapia. Como resultado, la terapia médica ha sido el pilar del tratamiento para los pacientes con enfermedades del corazón. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que precisa recapitular fisiología del miocardio normal y enfermo in vitro. <html> La convergencia reciente de la biología de células madre y la tecnología de la ingeniería de tejidos plantea nuevas vías prometedoras para la regeneración cardiaca. Generación de tejido miocárdico funcional de un renovable específica del paciente fuente, sería un avance importante en el campo. Esto permitiría el desarrollo de enfermedades específicas ensayos celulares para el desarrollo y descubrimiento de fármacos y podría establecer las bases para la medicina regenerativa cardíaca. Humanos madre embrionarias (ES) de células y, significativamente más, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) representan una potencialmente renovable específica del paciente fuente de células progenitoras y los miocitos ventriculares maduros ventriculares. La combinación de la biología de células madre y la ingeniería de tejidos aborda este problema mediante la generación de tejido cardiaco funcional in vitro que se pueden utilizar en el desarrollo de ensayos celulares para el descubrimiento de medicamentos o en cardíacos enfoques regenerativos para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca avanzada. _content &quot;&gt; Un reto fundamental en la regeneración cardiaca ha sido la identificación de un tipo celular óptimo. Una amplia variedad de células han sido estudiados 1, sin embargo hasta la fecha, a pesar de diferentes precursores multipotenciales cardiogénicas de diversas fuentes han sido descubiertos, la identificación de una célula fuente que cumpla con los requisitos críticos tales como el compromiso con el destino de la célula miogénica, el mantenimiento de la capacidad de expandir in vivo o in vitro y la composición a un tejido miocárdico funcional ha demostrado ser un problema central 2. Hemos descrito previamente un doble sistema murino transgénico que permite el aislamiento de poblaciones altamente purificadas de células progenitoras comprometidas ventriculares (CVP) de la diferenciación de células ES in vitro. Hemos generado un nuevo ratón doble transgénico que expresa la proteína fluorescente roja DsRed bajo el control de un potenciador dependiente de ISL1 del gen y MEF2C el aumento de proteína verde fluorescente bajo el control deel específico del corazón Nkx2.5 potenciador. Sobre la base de este sistema reportero fluorescente de dos colores, progenitores corazón primero y segundo de campo de las células ES en desarrollo pueden ser aislados por medio de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de acuerdo con su expresión de genes y MEF2C Nkx2.5. CVP se asemejan a los miocitos cardíacos basados ​​en los patrones de expresión de marcadores miocárdicos y cualidades estructurales y funcionales de 3, lo que ofrece una gran promesa para los propósitos de tejidos cardíacos regenerativas. Aunque ha habido muchos avances en el campo de la ingeniería de tejidos, imitando la arquitectura celular natal sigue siendo un desafío clave. Los métodos convencionales para hacer frente a este reto incluyen la siembra andamios biológicos o sintéticos con células in vitro. Debido a un número de desventajas de los andamios, incluyendo una rápida degradación, la estabilidad física y mecánica limitada y baja densidad celular 1,4,5, hemos intentado diseñar andamios menos tejido. AltHough células cardiacas pueden modificar su microentorno local por la secreción de proteínas de matriz extracelular, que tienen una capacidad más limitada para organizarse a la varilla miocitos cardiacos con forma en la ausencia de señales extracelulares. Por lo tanto, una plantilla que proporciona células apropiadas señales espaciales y biológicos para componer el tejido miocárdico funcional se requiere. La impresión por microcontacto aborda este reto proporcionando una técnica sencilla y barata para controlar con precisión la forma celular, la organización y función 6-8, todos los cuales son cruciales para la generación de alineado tejido miocárdico funcional. Comprende el uso de Microtexturados polidimetilsiloxano (PDMS) sellos con tamaños de las características que van a 2 micras 9 que permiten la deposición de proteínas de matriz extracelular sobre sustratos de PDMS en patrones precisos y por lo tanto afectar a la adhesión celular espacialmente. En este documento, se propone combinar la tecnología de bioingeniería de tejidos con tallo cell biología para generar anisotrópico tejido miocárdico funcional. En consecuencia, aquí demuestran nuestro enfoque publicado recientemente por el siguiente: (1) la generación de superficies de las proteínas microestructurada en PDMS sustratos por impresión por microcontacto para la generación de un modelo de tejido de miocardio alineados, (2) el aislamiento de alta pureza a partir de progenitores cardíacos diferenciación de células ES in vitro, y (3) la combinación de ambas técnicas para generar alineado tejido miocárdico funcional.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> L-ácido ascórbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> Preparar una solución 0,1 M en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Desecador de vacío de 10 pulgadas </td><td> Nova-Tech International, Inc. </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) </td><td> Life Technologies </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modificado Medio Eagle </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Suero Bovino FetalDe células ES de grado </td><td> Gemini Bio-Productos </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Suero Fetal Bovino Diferenciación de grado </td><td> Gemini Bio-Productos </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectina de plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4759 </td><td> Solubilizar a 1 mg / ml en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest premium cubierta del cristal 22x22mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 a 548-B </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina de piel porcina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Preparar 0,1% de solución en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Avanza recubridora de rotación </td><td> Avanza la investigación, Inc. </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Medio modificado de Iscove Dulbecco </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> Factor inhibidor de leucemia </td><td> Yo-Preparó a partir de líneas celulares secretoras de LIF- </td><td></td><td> Preparar una solución madre 500 veces </td></tr><tr><td> MEM no aminoácidos esenciales </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Los fibroblastos de embriones de ratón </td><td> Cosechado a partir de embriones de ratón 12-15 días </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2443 </td><td> Preparar solución al 1% en ddH 2 O </td></tr><tr><td> Tubo de fondo redondo con 35 micras filtro de células </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner </td><td> SPI Supplies </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> SylgardKit de elastómero de silicona 184 </td><td> Dow Corning </td><td> 184 SIL ELAST KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuum Gauge </td><td> SPI Supplies </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

La insuficiencia cardíaca avanzada representa un importante desafío clínico insatisfecha, derivada de la pérdida de células musculares viables y / o funcional totalmente cardíacas. A pesar de la terapia óptima del fármaco, la insuficiencia cardiaca es una causa principal de mortalidad y morbilidad en el mundo desarrollado. Un reto importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de ensayos celulares que recapitulan precisión normal y enfermo fisiología humana miocardio in vitro. Del mismo modo, los principales retos de la biología regenerativa cardíaca giran en torno a la identificación y el aislamiento de pacientes específicos de células progenitoras cardiacas en cantidades clínicamente relevantes. Estas células tienen que luego se ensamblan en tejido funcional que se asemeja a la arquitectura del tejido del corazón nativo. Impresión por microcontacto permite la creación de formas precisas que se asemejan a proteínas micropatterned organización estructural del corazón, proporcionando así señales geométricas para controlar la adhesión celular espacialmente. En estadescribimos nuestro enfoque para el aislamiento de las células del miocardio altamente purificada a partir de células madre pluripotentes de diferenciación in vitro, la generación de superficies de crecimiento de células micropatterned con proteínas de matriz extracelular, y el conjunto de las células madre derivadas de células del músculo cardiaco en el tejido de miocardio anisotrópico.

FACS-purificación de células in vitro ES diferenciadas reveló cuatro poblaciones distintas de células progenitoras (Figura 1). La presencia de fibronectina microestructurada se confirmó por microscopía de inmunofluorescencia que muestra una transferencia completa de líneas continuas de fibronectina (Figura 2). Revestimiento de FACS-progenitores aislados en micropatrones fibronectina resultó en la alineación de la R + G + y parte de la R <...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing at JoVE.com

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

generation-aligned-functional-myocardial-tissue-through-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K vistas.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional....

Video: Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Investigación

Bioingeniería

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

El cartílago humano Tissue Fabrication Usando tridimensional Tecnología de impresión inyección de tinta

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Andamios de impresión de núcleo/concha para la ingeniería de tejidos de estructuras tubulares

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

Generación y caracterización cuantitativa de quistes epiteliales biliares funcionales y polarizados

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...