الكتاب أود أن أشكر: السيدة أليكسيا سوندرز والسيدة ميشيل McPhedran للمساعدة التجريبية، والسيدة هيلين فنغ لتصنيع الكهربائي، والدكتور بيني ألين والدكتور جوناثان يوه للحصول على المساعدة الجراحية؛ أركان العين الفيكتوري الملكي ومستشفى الأذن والبيولوجي مركز البحوث للرعاية الحيوان؛ البروفيسور روب الراعي لتوجيهات عامة في جميع أنحاء، والدكتور بريوني Nayagam والسيد رونالد ليونج للتعليق الحرجة على شكل مسودة للمخطوطة. تم تنفيذ هذا العمل في معهد الإلكترونيات الحيوية ومستشفى سانت فنسنت في ملبورن. تم توفير التمويل من قبل مؤسسة إيان بوتر، جون ريد T الجمعيات الخيرية، ومجلس البحوث الأسترالي من خلال مبادرة خاصة للبحوث في بيونيك الرؤية العلوم والتكنولوجيا منحة لبيونيك الرؤية أستراليا (BVA). يعترف معهد الإلكترونيات الحيوية الدعم الذي تتلقاه من حكومة فيكتوريا من خلال برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية.

1. قلع وبعد التثبيت يفترض هذا البروتوكول أن الموضوع قد تم زرعها من طرف واحد مع مجموعة القطب suprachoroidal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول POSTFIX في زجاج زجاجات شوت. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل ديفيدسون تثبيتي، 2X 100 مل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مل الفورمالين (37٪ فورمالدهيد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 مل حمض الخليك الجليدي (99.7٪) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 مل ايثانول (98٪) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 53 مل من الماء المقطر </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50٪ من الإيثانول، 2X 100 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70٪ من الإيثانول، 2X 100 مل </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي Transcardially الموضوع مع دافئ (37 درجة مئوية) المالحة heparinized تليها الباردة (4 ° C) محايدة مخزنة الفورمالين (10٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الغرز في حوف متفوقة (أو موقع غير بعيد من مجموعة suprachoroidal) من كلتا العينين - تماشيا مع العضلات المستقيمة، لتكون بمثابة علامة فارقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عيون استأصل، والحفاظ على أي خيوط الخارجية من العين مزروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مجموعة شرق افريقياح العين في 100 مل من محلول ديفيدسون تثبيتي، وترك لمرحلة ما بعد الإصلاح في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 18 - 36 ساعة في تثبيتي ديفيدسون، ونقل إلى الإيثانول 50٪ (درجة حرارة الغرفة) ل6-8 ساعة، ثم أخيرا إلى الإيثانول 70٪ (درجة حرارة الغرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بردت العينات في 4 درجات مئوية وتخزينها حتى تشريح. </li></ol> وقد تم تخزين الكرات العين سليمة والضغط بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 3 أشهر دون أن يؤثر ذلك سلبا على الأنسجة الناتجة. 2. تحديد ورسم الخرائط الأنسجة بروتوكول تثبيت أعلاه (الخطوة 1) قد أصدرت شفافة الصلبة ومجموعة مرئيا الآن - بما في ذلك مواقع القطب فرد (الشكل 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العالم مزروع من الإيثانول وتقليم بعناية بعيدا الأنسجة الزائدة، بما في ذلك الملتحمة وكبسولة تينون. تقليم العصب البصري إلى 2-3 مم طول (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام النسيجي صبغ ماركينز مخطط، والتسمية الأقطاب مع رمز اللون محددة مسبقا، مع الحرص على عدم طخة الصبغة. </li></ol><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخترنا جناح المتاحة تجاريا من صبغ النسيجية المتخصصة (يرجى الرجوع إلى التذييل). تم تطبيق كميات صغيرة من الصبغة بعناية مع غرامة الرؤوس فرشاة الطلاء (Roymac حجم 00) إلى الأنسجة ويسمح للهواء الجاف لمدة تصل إلى 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأغراضنا، اخترنا: الأخضر للالقطب النشط (ق) التي كان (كانت) حفز الحد الأقصى، على المستويات suprathreshold، لمدة الدراسة؛ الأحمر لأقطاب نشطة أخرى؛ الصفراء لأقطاب أكبر العودة قطر، و الأزرق للأدلة إضافية و / أو علامات مسافة التشريحية (أرقام 3B و3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعض التجربة والخطأ قد تكون هناك حاجة لإيجاد الصبغة التي هي مستقرة في جميع أنحاء الخطوات اللاحقة. على سبيل المثال، في الشكل (4)، يمكن أن ينظر إليه من أن الصبغة الخضراء كان أكثر مرونة من الصبغة الحمراء. تمييع الصبغة في الايثانول 70٪ يساعد على تحسين penet الدهونالتموينية وطلاء الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن المفيد رسم أو صورة فوتوغرافية في العالم مصبوغ لتكون مرجعا في المستقبل. </li></ul><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى 70٪ من الإيثانول إلى يذوى الصبغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.1 لمراقبة العالم unimplanted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الخيوط الجراحية من الخطوة 1.3، محاذاة العين تحكم والعين مزروع كزوج لها نسخ متطابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قالب سيليكون (مع نفس الأبعاد بوصفها مجموعة الكهربائي) في الموقع معكوسة على العين السيطرة حيث يقع على زرع العين مزروع (NB الصلبة العينية شفافة وعلامات صبغ من الخطوة 2.2 سماح التصور استعداد لموقف مجموعة مزروع ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات 2.2 و 2.3 للعين التحكم، بحيث يكون كل موقع القطب المزروع لديه زوج التحكم في موقع مشابه تشريحيا (أي مرآة مطابقة ما يعادلها). </li></ol> 3. تشريح وتضمينها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مجموعة من زرع العين وإزالة الجزء الأمامي من العين(بما في ذلك القرنية، القزحية والعدسة). إزالة السائل الزجاجي من كأس العين المتبقية (الغرفة الخلفية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح العين مزروع إلى شرائح متعددة ممثل (~ 2 مم سماكة) تحتوي كل منها على مجموعة فرعية من المناطق صبغ ملحوظ (الشكل 3D). لاحظ أن التوجه للشرائط يجب أن يكون محددا للمساعدة في تقييم الجوانب المختلفة للاستجابة الأنسجة لزرع 7. </li></ol> ومن المفيد، لتكون مرجعا في المستقبل، لجعل رقما قياسيا من المناطق التي صبغ موجودة على كل قطاع ومواقعها النسبية (والألوان). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريط على جانبها في بركة ضحلة من أجار المسال (4٪؛ 80-90 ° C) مع الجانب لا بد من تخفيض نزولا تواجه أول (الشكل 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد وضعت آغار، قطع حول العينة ومكان في شريط الأنسجة التي تدعمها إدراج رغوة (الشكل 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،3 للعين التحكم - تاكالرعاية جي لتشريح مرآة مطابقة شرائط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة كافة أشرطة عبر البارافين تقنية قياسية (الآلي بين عشية وضحاها) وتجهيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الأنسجة المصنعة في البارافين مع الجانب لا بد من تخفيض نزولا تواجه أول. </li></ol> 4. قطع وتلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كتل البارافين إلى 5 أقسام ميكرون اشارة منتظمة إلى الملاحظات من الخطوات 2 و 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المقاطع من كل منطقة من المناطق المصبوغة وجبل على الشرائح. </li></ol> المنطقة المتاخمة فورا إلى كل بقعة من مصبوغ الصلبة ويمكن الآن أن تقيم مع الثقة أنه كان في القرب الاقرب الى القطب المقابل في مجموعة (الشكل 4). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار أو أداء المناعي كما تريد. البقع سبيل المثال والمناعية هو مبين في الشكل (5) هي: H والتقييم؛ Luxol سريع الأزرق (LFB)؛ البنفسجي الكريزيل؛ ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء؛ الدوري حمض شيف (PAS)؛ بيرلز زرقة بروسيا ستافي؛ مخلقة مكافحة الجلوتامين (GS)؛ بروتين مضاد للخيط عصبي (NF)؛ المضادة للالدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) و 4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole (دابي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجريت البقع القياسية والخاصة على النحو المفصل: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إجراء H &amp; E تلطيخ وفقا لبروتوكول تقدمها لايكا multistainer حمام مجموعة ST5020 (لايكا النظم البيولوجية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البنفسجي LFB والكريزيل (معدلة من 11): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax في 3 تغييرات الزيلين (3X 2 دقيقة) و 2 تغييرات من الإيثانول (100٪، 100٪) (2X 1 دقيقة)، وشطف في ماء الصنبور (45 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام هيدرات إلى 95٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان في حل LFB 11 في 37-42 درجة مئوية (بين عشية وضحاها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الزائدة وصمة عار مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في كربونات الليثيوم المخففة (8٪) (بضع ثوان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفريق في الايثانول 70٪ (بضع ثوان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4.4.2.6 إلى 4.4.2.8، إذا لزم الأمر، حتى بackground هو عديم اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في الكريزيل البنفسجي خلات حل العاملة عند 37 ° C (10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يغسل في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى في 3 تغييرات من الكحول المطلق (1X 30 ثانية، 20 ثانية 2X) و 3 تغييرات الزيلين (1X 1 دقيقة و 30 ثانية، 2X 1 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل وساترة مع DPX. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء (معدلة من 11): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax حسب 4.4.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب المقاطع على المياه (2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على النوى باستخدام الحديد haematoxylin بحسب فايغرت (2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل في ماء الصنبور، وشطف في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار في Biebrich القرمزي الحمضية حل فوكسين (5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفريق في حمض الفسفومولبديك-الفسفوتنغستيك حتى الكولاجين وردي شاحب (6 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين في زرقة الأنيلين (1 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا في حامض الخليك 1٪ (1 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى، وجبل ساترة كما عإيه 4.4.2.12 4.4.2.13 و. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PAS (معدلة من 11): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax حسب 4.4.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسدة حامض في الدوري 1٪ (15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في المياه الجارية الماء ثم المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار في كاشف شيف (15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في الماء (5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين مع هاريس haematoxylin (1 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لفترة وجيزة في مياه الحنفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفريق في 0.5٪ كحول حامض (1 مجمع دبي للاستثمار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا في ماء الصنبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأزرق في مياه الحنفية سكوت (1 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى، وجبل ساترة وفقا 4.4.2.12 4.4.2.13 و. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرلز البروسي الأزرق وصمة عار كما هو موضح في 11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تنفيذ تلطيخ المناعي كما هو مفصل: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dewax حسب 4.4.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر (2X 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء استرجاع مستضد باستخدام 0.01٪ العازلة سيترات، ودرجة الحموضة 6 في 75 - 80 درجة مئوية (20 دقيقة) علىد السماح لتبرد في 0.01٪ سيترات حل العازلة (20 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المقاطع في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (2X 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize غشاء الخلية في غسل حل العازلة (10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حل كتلة المصل (2 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع في الأجسام المضادة الأولية مخففة في واحد مخفف الأضداد (10٪ عادي الماعز serum/0.1٪ تريتون X-100/PBS) (بين عشية وضحاها في الثلاجة). يظهر عيار من كل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، ويغسل المقاطع في غسل حل العازلة (5X 3 دقيقة). من هذه النقطة، والحفاظ على المقاطع في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع في الضد الثانوية المقابلة في عيار 1:500 لمدة محددة (انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المقاطع في غسل حل العازلة (3X 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع في دابي (1:25،000 / PBS) (30 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المقاطع في غسل حل العازلة (3X 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل وساترة باستخدام فلورةوسائل الاعلام تركيب NT. </li></ol></li></ol> عينات الاختبار وعينات مراقبة مستعدون للمقارنة البشرى.

<ol>
	<li>Santos, A., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Villalobos, J., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+approach+for+a+wide-view+suprachoroidal+retinal+prosthesis:+evaluation+of+implantation+trauma.">Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).</li><li>Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+testes+and+eyes+using+a+modified+Davidson's+fluid:+comparison+with+Bouin's+fluid+and+conventional+Davidson's+fluid.">Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid.</a> Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).</li><li>Agrawal, R. N., He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+proliferative+vitreoretinopathy.">In vivo models of proliferative vitreoretinopathy.</a> Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Horobin, R. W., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Troubleshooting histology stains. , (1998).</li><li>Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamante+in+some+retinal+neurons+is+derived+solely+from+glia.">Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia.</a> Neuroscience. 60, 355-366 (1994).</li><li>Lewis, S. E., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phosphorylated+variants+of+the+high+molecular+mass+subunit+of+neurofilaments+in+axons+of+retinal+cell+neurons:+characterization+and+evidence+for+their+differential+association+with+stationary+and+moving+neurofilaments.">Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments.</a> J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).</li><li>Ruiz-Ederra, J., Garc&#237;a, M., Hicks, D., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+three+neurofilament+subunits+within+pig+and+human+retinal+ganglion+cells.">Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells.</a> Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).</li><li>Bringmann, A., Pannicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).</li><li>Seo, J. M., Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+polyimide+microelectrode+array+for+retinal+stimulation.">Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).</li><li>Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+implantation+of+epiretinal+retina+implants+(EPI-RET)+with+an+IOL-type+receiver+unit.">Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit.</a> J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).</li><li>Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Pardue, M. T., Stubbs, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+studies+of+the+retina+following+long-term+implantation+with+subretinal+microphotodiode+arrays.">Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays.</a> Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).</li><li>Gekeler, F., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+subretinal+prostheses+with+extra-ocular+parts+designed+for+human+trials:+successful+long-term+implantation+in+pigs.">Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Ray, A., Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+retinal+neurons+under+electrical+stimulation.">Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation.</a> Brain Res. 1255, 89-97 (2009).</li><li>Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+suprachoroidal-transretinal+stimulation+current+resulting+in+retinal+damage+in+rabbits.">Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits.</a> J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).</li><li>Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+chronically+stimulated+platinum+intracochlear+electrodes.">Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes.</a> Biomaterials. 6, 237-242 (1985).</li><li>Villalobos Villa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pre-Clinical+Model+for+Chronic+Electrical+Stimulation+of+the+Retina+via+Suprachoroidal+Electrodes.">A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes.</a> , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis+is+Safe+in+a+Chronic+Implantation+Model.">A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model.</a> in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. , (2011).</li><li>Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+cortex+responses+to+suprachoroidal+electrical+stimulation+of+the+retina:+effects+of+electrode+return+configuration.">Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration.</a> J. Neural Eng. 9, 036009 (2012).</li><li>Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+implantable+microelectrode+arrays+by+laser+cutting+of+silicone+rubber+and+platinum+foil.">Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil.</a> J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li><li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs.">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li><li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wolff's anatomy of the eye and orbit. , (2001).</li><li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina.">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li><li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis.">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تقييم سلامة زرع هو الاعتبار الأول للدراسات ما قبل السريرية. قبل بدلة الشبكية يمكن زرعها في البشر فمن الضروري للتحقق من أنه لن يسبب أي ضرر. هذا يتطلب تقييما من كل من توافق مع الحياة زرع 17-23 وكذلك أي ضرر المحتملة التي يمكن أن تسببها التحفيز الكهربائي المزمنة 24-26. تجربة مع الأطراف الاصطناعية العصبية مماثلة، مثل زرع قوقعة الأذن، يوفر نظرة ثاقبة على مجموعة واسعة من التحفيز، والمادية، والمعلمات التي لا تتسبب في تلف الأنسجة 27. ومع ذلك، فإن شبكية العين لديه خصائص مختلفة إلى مواقع أخرى، وغرس حدود السلامة بالتالي دقيقة (مثل كثافة الشحنة الأقصى) لا يمكن افتراض من الدراسات السابقة في أنظمة أخرى. الكثافات التهمة هي أعلى في مواقع القطب بالموقع وهذا يتوافق مع أعظم احتمال حدوث ضرر. ولذلك وسيلة لإضفاء الطابع المحلي على الأنسجة المجاورة مباشرةإلى الأقطاب النشطة الفردية من شأنه أن يزيد كثيرا من فائدة هذه الدراسات. النسيج المجاور لمناطق معينة من زرع ويمكن أيضا أن أبرز لتوثيق التفتيش. يسمح هذا النهج استهدفت أقسام أقل ليتم تحليلها، مع الإبقاء ثقته بأن &quot;السيناريو الأسوأ&quot; تم فحص. طريقة التعريب صبغ الصلبة وصفها هنا وقد تم اختبار على نطاق واسع مع ناحية الشكل ومصبوب سيليكون / صفائف الكهربائي حزب العمال 28-30. وقد تم استخدامه مع الأغشية الرقيقة صفائف مادة البولي أميد 7،31 وأيضا الأغشية الرقيقة سيليكون / حزب العمال صفائف 32. بعض الدراسات بدلة الشبكية المستخدمة &quot;رصاصة على شكل&quot; الأقطاب الكهربائية مع زرع داخل الصلبة 33. وينبغي أن تكون هذه التقنية موجودة فعالة لتقييم هذا النوع من المصفوفات القطب. عيون القطط مع الصلبة رقيقة (سمك في القطب الخلفي 90-200 ميكرون) يسمح التصور من الأقطاب الكهربائية الفردية في صفيف. ومع ذلك، حتى لو الكهربائية الفرديةدي كانت غير مرئية، مواقفها يمكن الاستدلال بسهولة باستخدام قالب سيليكون عندما الخطوط العريضة للمجموعة ويمكن رؤية (مماثلة لتلك المستخدمة في الخطوة 2.6). يحد من رسم الخرائط صبغ الحاجة إلى الحصول على أقسام الأنسجة غير ذات الصلة كما يتم الحصول على المقاطع فقط مع الحاضر صبغ. القدرة على الاستدلال بدقة موقف القطب يسمح ليس فقط تحليل الأنسجة ذات الصلة وزيادة القوة الإحصائية، ولكن لديه تأثير كبير على الوقت وإدارة التكاليف من خلال تقليل كمية من الشرائح وريش المستخدمة فضلا عن تكلفة اليد العاملة. استخدام الصبغة التي هي ملتصقة ويمكن أن تحمل معالجة الأنسجة في حين يجري أيضا واضحة في أقسام الأنسجة غير ملوثين من الاعتبارات الأولية الهامة. معرفة مكان وجود صبغة واتجاه النسيج في تشريح وخلال تضمين يساعد عملية التقطيع. وهذا يشمل orientating كتلة لتحقيق المقطع الذي لم يتم قطع بشكل غير مباشر بشكل صحيح ويعطي representati كاملعلى من الأنسجة. ولذا فمن المهم أن الشخص الذي يؤدي القطع موجودا في ذلك الوقت من تطبيق صبغ، تشريح والتضمين. بروتوكول العام هو قوية لتعديلات طفيفة، خاصة مع توقيت التثبيت. ومع ذلك، فإن تشريح العين وخطوات وضع العلامات صبغة والإجراءات الدقيقة التي تستفيد من البراعة اليدوية جيدة لتجنب إتلاف العينة. في حين أثبت تثبيتي ديفيدسون فعالة للحد من مفرزة مصطنعة من شبكية العين بالقرب من زرع، فإنه لا يمنع التلف الميكانيكي المباشر أثناء تشريح. وكان تثبيتي ديفيدسون غير متوافق بسهولة مع بعض الإجراءات النسيجية والمناعية الخاصة. ولذلك كانت هناك حاجة لتعديل / تحسين هذه الخطوات على النحو المفصل أعلاه. تم إجراء تغييرات تدريجية في أوقات تلطيخ وتركيزات حتى تم تحقيق النتيجة المثلى - لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى المواد التكميلية. الكمي لشبكية العينعلم الأنسجة ما زالت تشكل معضلة. شبكية العين هي غير متجانسة وكلا من سماكة وتغير كثافة الخلية مع زيادة المسافة من الباحة المركزية 34،35. ولذلك، الأنسجة المجاورة داخل العين مزروع لا يمكن استخدامها لإجراء مقارنات ويعمل على العين السيطرة بدلا من ذلك. البشرى مطابقة من كل قسم مع العين سيطرة يعطينا المقارنة الإحصائية أكثر قوة من التغيرات المرضية، ويتم تقييم النتائج فعالية وسلامة مع الأطراف الاصطناعية الشبكية أفضل عند مقارنة عيون الزميل في 36 موضوع. يجب إيلاء عناية خاصة لتقليل القطع المائل وهذا من شأنه أن يؤثر على التقدير الكمي. وباختصار، فإن الأساليب المذكورة أعلاه قد تحسنت بشكل ملحوظ تحليلنا التشريحية المرضية، والذي بدوره أدى إلى سير العمل قبل السريرية أكثر كفاءة. أدت نتائج الدراسات قبل السريرية باستخدام هذه الطرق مباشرة لتجربة سريرية في المرضى RP 3 التي تم زرعها بأمان مع suprachoroiالدال الأطراف الاصطناعية في شبكية العين. هذه الأساليب هي ذات الصلة على حد سواء إلى التحفيز والتشجيع الشبكية ويزرع العينية الأخرى حيث يحتاج استجابة مرضية لزرع المدى الطويل التي سيتم تقييمها. قدمت هذا الأسلوب مزايا جديرة بالاهتمام للمحافظة على التهندس الخلوي وتسجيل علم الأمراض إلى مناطق الفائدة على الزرع. على الرغم من عدم اختباره بوجه خاص، على تعديل هذه الإجراءات يمكن أن تستخدم في الأنواع الأخرى والمواقع التشريحية الأخرى، ولا سيما حيث يتم زرع مجموعة بشكل سطحي.

قد تصبح طرفا اصطناعيا الشبكية قريبا التدخلات السريرية مفيدة لعلاج مختلف أشكال فقدان البصر الشديد. ظروف معينة، مثل التهاب الشبكية الصباغي (RP)، نتيجة في انحطاط واسع النطاق للخلايا مستقبلة للضوء في العين، وهذه هي الخلايا المسؤولة عن transducing الضوء إلى إشارات العصبية. ومع ذلك، تظل بعض الخلايا في طبقات أخرى من شبكية العين وتكون أهدافا محتملة للالتحفيز الكهربائي مع الشبكية بدلة 1. النتائج في وقت مبكر من تجارب اكلينيكية على البشر واعدة للصفائف القطب مزروع في 2،3 فوق الشبكي، تحت الشبكية 4،5، وداخل الصلبة 6 مواقع. وتتكون هذه الأجهزة من مواد مختلفة ذات أشكال مختلفة، ولكن عليهم ان يستخدموا كل النبضات الكهربائية لتنشيط الخلايا العصبية قابلة للحياة المتبقية من الشبكية من أجل خلق رؤيتين البصرية. وقد وضعت لدينا مجموعة أوسع (بيونيك الرؤية أستراليا) زرع شبكية العين التي لديها بروخرسالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لدراسة تجريبية سريرية مع 3 مرضى RP مزروع مع صفائف القطب suprachoroidal (السريرية عدد المحاكمة: NCT01603576). الشكل 1A يظهر هذا النموذج suprachoroidal بدلة الشبكية. سلامة المريض أمر بالغ الأهمية في الدراسات السريرية، وبالتالي، قبل بدء التجارب على الانسان، أجرينا اختبار الحادة والمزمنة واسعة في نماذج ما قبل السريرية (1B الشكل). تقييم التشريحية المرضية ضرورية لتحسين العمليات الجراحية، يكرر من خلال تصميم الكهربائي، ووضع في نهاية المطاف سلامة زرع. للحفاظ على سير العمل بكفاءة تتوافق مع الممارسات الباثولوجيا الإكلينيكية القياسية، كان يعمل تقنية التضمين البارافين. كان من المستحسن أيضا للاستفادة من الإجراءات تلطيخ مقارنة مع المعايير السريرية، مثل haematoxylin ويوزين (H &amp; E)، التي يتم تفسيرها بسهولة من قبل الأطباء. أردنا أيضا تقنية التي يمكن تكييفها لتحليلات المناعى، فيبغية مواصلة تيسير تقييم الخلوي للأنسجة. توافق مع الحياة من المواد المستخدمة في زراعة، وسلامة التحفيز الكهربائي المزمنة، والحاجة إلى إجراء تقييم دقيق. من المهم أن تكون قادرة على دراسة التشريح المرضي للأنسجة العين المجاورة لتحفيز كهربائي فرد داخل مجموعة. ومع ذلك، فإن صفائف ثمة حاجة لإزالة قبل معالجة العينات بحيث يمكن اختبارها، ولأن مكوناتها المعدنية لا يمكن أن يكون مقطوع بسهولة. ونتيجة لذلك، لم إعداد لدينا الأنسجة راسخة لا تسمح التعريب ورسم الخرائط من الأنسجة فيما يتعلق أقطاب كهربائية مزروعة 7. بالإضافة إلى عدم وجود طريقة التعريب الأنسجة، ونتج عن تثبيت المستندة إلى الفورمالديهايد القياسية وتقنيات معالجة القطع الأثرية في نطاق واسع ومفرزة من شبكية العين بسبب إلى انكماش الفرق من مختلف الطبقات من العين (الشكل 2). ونظرا لعدم تجانس رانه شبكية العين، كان من الصعب إجراء مقارنات سليمة مع الأنسجة السيطرة، ولا سيما بالنسبة للقياسات الكمية. هذه القيود مجتمعة معقدة تقييمات دقيقة للأضرار المحتملة الناجمة عن صفائف لدينا مزروع. هنا نقدم تقنيات رواية للتغلب على هذه القيود. قمنا بتعديل التثبيت وتجهيز التقنيات العين 8-10 المتخصصة للحفاظ على التوافق مع الأنسجة المحتوية على البارافين. قمنا بتعديل البقع النسيجية والمناعية موحدة لتقديم نتائج قابلة للمقارنة، على أساس التغذية المرتدة من علم الأمراض السريرية. بعد جعل شفافة الأنسجة الصلبة، كان يعمل المستندة إلى صبغ لون رمز للاحتفال الأنسجة العين المجاورة لبعضها القطب الفردية، قبل إزالة مجموعة من الفضاء suprachoroidal. عن طريق وضع علامة مجموعة القطب والقطب المواقع الفردية، والعينات ويمكن جمع بدقة من المناطق المجاورة القطب. يمكن جمع عينات مطابقة من اله العين التحكم في النظام لتسهيل المقارنات البشرى.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

مع التطورات الأخيرة في شبكية العين الاصطناعية، فمن المهم لتطوير تقنيات موثوق بها لتقييم سلامة هذه الأجهزة في الدراسات قبل السريرية. ومع ذلك، فإن تثبيت القياسية، وإعداد، والإجراءات الأنسجة الآلي ليست مثالية. نحن هنا وصف الإجراءات الجديدة لتقييم صحة شبكية العين المجاورة مباشرة إلى الزرع. الأطراف الاصطناعية الشبكية تحتوي صفائف الكهربائي في اتصال مع أنسجة العين. لم تكن الطرق السابقة قادرة على توطين مكانيا أنسجة العين المجاورة لأقطاب فرد داخل مجموعة. وبالإضافة إلى ذلك، وتجهيز النسيجية القياسية في كثير من الأحيان يؤدي إلى انفصال مصطنعة الإجمالي من طبقات شبكية العين عند تقييم عيون مزروع. وبناء على ذلك، فقد كان من الصعب تقييم الأضرار المحلية، إذا كان موجودا، والناجمة عن زرع والتحفيز من صفيف القطب المزروع. لذلك، قمنا بتطوير طريقة لتحديد وإضفاء الطابع المحلي على الأنسجة العين المجاورة له مزروعlectrodes باستخدام (مرمزة) صبغ مخطط وضع العلامات، ونحن المعدلة تقنية تثبيت العين للحد من انفصال الشبكية مصطنعة. كما أصدرت هذه الطريقة شفافة الصلبة، وتمكين التوطين من الأقطاب الكهربائية الفردية وأجزاء معينة من الزرع. أخيرا، استخدمنا عنصر تحكم مطابقة لزيادة قوة التقييمات التشريحية المرضية. في ملخص، تمكن هذه الطريقة التمييز موثوقة وفعالة وتقييم التهندس الخلوي الشبكية في العين مزروع.

ويبين الشكل 4 مقطع ممثل الحصول عليها من قطع العينة هو مبين في الشكل (3). تم قطع الجزء في سمك 5 ميكرون والملون مع H &amp; E وفقا للبروتوكولات الموصوفة أعلاه. هو الحفاظ على الشكل الإجمالي للقطاع عينة مع الحد الأدنى من القطع الأثرية الأنسجة الفرق (الشكل 4A). كانت كل علامات مرئية على صبغ الصلبة، على الرغم من أن الصبغة الخضراء كان أكثر مرونة من الأحمر (الشكل 4B). وكانت طبقات الشبكية لا فصل artifactually ويتم الاحتفاظ مورفولوجيا الشبكية (4C الشكل). الأنسجة الشبكية المجاورة للعلامات صبغ، والتي تتطابق مع الموقع من الأقطاب الكهربائية في الصفيف، يمكن التعرف بسهولة. ويبين الشكل 5 تلطيخ الممثل الخاص والمناعية من أقسام الأنسجة أعدت وفقا للبروتوكول الحالي. الرجوع إلى الشكل 5 captioن والتكميلية مواد لمزيد من التفاصيل على بقع محددة والتعديلات التي أدخلت على استخدامها. كانت مرحلة ما بعد التعديل، وهذه البقع والمناعية يعادل المعايير الموضوعة - كما تم التحقق منها من قبل الأطباء. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نوع من الأجسام المضادة الأولية وعيار (بين قوسين) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> نوع من الأجسام المضادة الثانوية وعيار (بين قوسين) </td><td> فلور اليكسا 594 </td><td> فلور اليكسا 488 </td><td> فلور اليكسا 488 </td></tr><tr><td> مدة الحضانة من الأجسام المضادة الثانوية </td><td> 1 ساعة </td><td> 2 ساعة </td><td> 45 دقيقة </td></tr></tbody></table> الجدول 1. نوع الأجسام المضادة، وعيار المدة من وصفها. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> الشكل 1. Suprachoroايدال النموذج الكهربائي صفيف. A) صورة ماكرو من الصف مجموعة مصبوب السريرية. B) صورة مجهرية من مجموعة قبل السريرية اليدوية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> الشكل 2. واستخدمت الأنسجة الشبكية السابق. الطرق القياسية النسيجي لإعداد هذه، H &amp; E الملون، أقسام العين مزروع مع مجموعة القطب suprachoroidal. أ) قسم متعامد من خلال تجويف مجموعة الكهربائي (يصور نجم). يتم فصل الشبكية من نسيج العين الخارجي. هذا واضح بشكل خاص تحت منطقة مزروع (السهم). فمن المستحيل لتحديد أي جزء من شبكية العين والمجاورة لبعضها القطب الفردية للمجموعة. Scalebar = 1 مم. ب) التكبير أعلى من المنطقة محاصر في لوحة A. هناك عدة، متباعدة بصورة منتظمة، والتحف في لاي الشبكيةRS (السهام)، وكذلك مفرزة كبيرة من الطبقة بساطي (طبقة عاكسة في عيون القطط). Scalebar = 100 ميكرون. C) التكبير أعلى من المنطقة محاصر في لوحة B. وأشارت سهم القطاعات الخارجية للخلايا مستقبلة للضوء، وكذلك ظهارة مخضب، والتي لا تزال سليمة، مما يدل على أن مفرزة كان من الآثار الجانبية مصطنعة للتجهيز، بدلا من ان يكون سببها في الجسم الحي صدمة أو أمراض. Scalebar = 20 ميكرون. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> الشكل (3). توطين وتشريح الكهربائي متجاورة الأنسجة. م) مجموعة ديناميكية عالية والصور، الماكرو من العين منزوعة النواة، مع مجموعة والقطب suprachoroidal في الموقع. أ) وظيفة ثابتة مع تثبيتي ديفيدسون، وقبل إزالة مجموعة، والصلبة شفافة تمكن من التصوريتم استخدام أقطاب الفردية في مجموعة (يشار مثال واحد مع السهم). B) يتم وضع علامة على الأقطاب مع لون صبغة محددة مسبقا. C) علامات صبغ في تباعد العادية من المعالم التشريحية للحفاظ على التناسق عبر التجارب. د) لدى وإزالة صفيف، يتم تشريح العين باليد إلى شرائح العينة. السهام الملونة تشير إلى اثنين من المواقع المتاخمة القطب على الصلبة. أصفر خط متقطع يدل طائرة من باجتزاء. E) الكلي صورة من قطاع عينة جزءا لا يتجزأ من داخل كتلة آغار. F) صورة ماكرو من قطاع عينة أجار محتوى غير مناسب من لوحة E، قطع ووضعها في كاسيت التضمين بدعم من رغوة منصات خزعة لتقليل حركة المقطع أثناء معالجة. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> الشكل 4. علم الأنسجة الشبكية الجديدة. </s<html> ترونج&gt; الشريط العينة أعلاه (من الشكل 3D)، الذي يحتوي على جيب القطب، وكان البارافين جزءا لا يتجزأ، مقطوع في 5 ميكرومتر والملون مع H &amp; E. A) الخضراء والمناطق مصبوغ الأحمر (المشار إليها السهام، نفس الشكل 3D) واضحة في قسم المتخذة على مستوى خط أصفر متقطع في 3D الشكل. شريط مقياس = 1،000 ميكرومتر. لا يتم فصل شبكية العين، لا تحت جيب مجموعة ولا عن بعد. B) منطقة محاصر من لوحة A مع مرئية صبغ أحمر وأخضر يتبين من السهام، وشبكية العين سليمة في جميع أنحاء. شريط النطاق = 500 ميكرومتر. C) منطقة محاصر من لوحة B، والتي تبين سليمة، المرفقة، شبكية العين المتاخمة للالصبغة الخضراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. مع العلم أن موقع الصبغة يشير إلى موقف من إلكترود، يمكننا تقييم بثقة أنسجة الشبكية المجاورة عن الأضرار، إن وجدت، والناجمة عن التحفيز الكهربائي. ve_content &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> الشكل 5. أمثلة من cytohistochemistry الشبكية تعديلها باستخدام البقع الخاصة والمناعي. استخدام مثبت ديفيدسون، بدلا من التقنيات القياسية الفورمالين التثبيت، والتعديلات المطلوبة لالبروتوكولات تلطيخ المعتادة، على النحو المبين في نص البروتوكول الرئيسي. وقد أكد الطب الشرعى أن هذه التعديلات أدت إلى تلطيخ ما يعادلها. A) H والتقييم؛ haematoxylin البقع الخلية نواة باللون الأرجواني بينما يوزين البقع السيتوبلازم الخلية، والكولاجين والأنسجة الداعمة ظلال مختلفة من اللون الوردي. B) LFB البقع الزرقاء المايلين في حين أن مباين البنفسجي الكريزيل يمكن استخدامها ل . تحديد الخلايا العقدية التي كتبها تلطيخ أجسام نيسل في الزرقاء حوائط النواة وتسليط الضوء على الخلايا الأقمار الصناعية المحيطة خلايا C) ثلاثي الألوان ماسون في الزرقاء، وBiebrich القرمزي الحمضية فوكسين حل البقع العضلات فايBERS الأحمر، في حين أن البقع الزرقاء الأنيلين الكولاجين، في هذه الحالة الصلبة، الأزرق D) PAS؛. مكونات بروتين سكري من الغشاء القاعدي ومكونات النسيج الضام هي ملطخة الأرجواني، في حين أن haematoxylin counterstains الخلية نواة الأرجواني E) بيرلز زرقة بروسيا.؛ في موقع النزف، وتشكيل haemosiderin من تدهور خلايا الدم الحمراء وإطلاق مجمعات الحديد ينتج اللون الأرجواني بينما إضافة محايدة الألوان وصمة عار أحمر أحمر الجسيمات الحالة F) GS؛. هذا الناقل العصبي انزيم المهينة وجدت في خلايا مولر 13 (الأخضر )، يمكن أن ينظر تمتد في كلا الاتجاهين مع أجسام الخلايا مولر في الطبقة النووية الداخلية ومولر endfeet الخلية تشكيل تحد من الغشاء الداخلي G) NF-200؛. هذه السلسلة الثقيلة البروتين هيكل الخلية (الخضراء) وجدت في سوما الخلية والعمليات ، crosslinks مع neurofilaments أخرى للحفاظ على بنية الخلايا العصبية 14،15. عقدةويمكن رؤية الخلايا والمحاور العصبية في طبقة الخلايا العقدية وطبقة من الألياف العصبية، في حين يتم تسليط الضوء أيضا محاور عصبية من الخلايا الأفقية الموجودة في الحدود الخارجية للطبقة النووية الداخلية في شبكية العين القطط،. Counterstaining مع دابي (الأزرق) يسمح التصور من طبقات الشبكية H) GFAP؛. هذا البروتين هيكل الخلية (الحمراء) انتشرت في خلايا مولر والخلايا النجمية خلال دباق 16، ويمكن رؤية بطانة طبقة الألياف العصبية مع الخلايا مولر تشكيل ملحقات رقيقة من خلال الداخلية ل طبقات الشبكية الخارجي. Counterstaining مع دابي (الأزرق) يسمح لتصور من طبقات الشبكية. شريط النطاق = 50 ميكرومتر في كل اللوحات. يظهر الشبكية الداخلية في أعلى كل صورة؛ يظهر شبكية العين الخارجي في أسفل كل صورة، باستثناء لوحة E، مما يدل على تفاعل subscleral.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis at JoVE.com

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

تقنيات لتصور التهندس الخلوي الشبكية المجاورة مباشرة لأقطاب الفردية داخل مشجعا في شبكية العين.

تقنيات لمعالجة العيون تزرع لهم تعويضات الشبكية لتحليل المرضية المترجمة

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K Views.  Bionics Institute. تقنيات لتصور التهندس الخلوي الشبكية المجاورة مباشرة لأقطاب الفردية داخل مشجعا في شبكية العين.

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

كيفية قياس الطي القشرية من صور MR : برنامج تعليمي خطوة بخطوة لحساب الرقم القياسي المحلي Gyrification

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

تجهيز رأب الثدي لحد من استئصال الثدي والأنسجة البشرية للثقافة الخليوي

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

تقنيات لمعالجة عيون مزروع مع الشبكية الأطراف الاصطناعية للالمترجمة تحليل المرضية: الجزء 2 فوق الشبكي يزرع مع الشبكية المسامير

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

خطوة بالبروتوكول الخطوة لجراحة تحت الشبكية في الأرانب

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

نموذج الحاد الشبكية لتقييم الدم الشبكية الحاجز خرق والمحتملة أدوية لعلاج

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

منهجية الاستقراء البصاق وتجهيز المختبرات

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

دراسة "مرض السكر من خلال عيون" من الأسماك: ميكروديسيكتيون، والتصور، وتحليل tg(fli:EGFP) الكبار "الزرد الشبكية المفرج"

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Customizing a Cryolite Glass Prosthetic Eye

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present manuscript demonstrates this long-forgotten technique in detail. This manuscript shows some major advantages of manufacturing prosthetic eyes using cryolite glass in comparison to poly(methyl methacrylate) (PMMA). These advantages include a lighter weight of the prosthesis, higher levels of patient satisfaction, and only one appointment necessary for the customized manufacturing. Potential risk of breakage seems not to be a critical disadvantage for glass prosthetic eye wearers. However, in some patients, manufacturing a well-fitting prosthetic eye is not possible or reasonable due to anophthalmic socket complications such as post nucleation socket syndrome, scarred fornices, or an orbital implant exposure. This article gives ophthalmologists a better insight into ocularistic care in order to improve the essential interprofessional collaboration between ocularists and ophthalmologists.

This manuscript shows each step of customizing a cryolite glass prosthetic eye including some major advantages of the use of cryolite glass for manufacturing an eye prosthesis compared to poly(methyl methacrylate). In addition, this manuscript gives ophthalmologists better insight into the ocularistic care that could improve interprofessional collaboration.

تخصيص العين الاصطناعية الزجاج Cryolite

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

زرع ظهارة صبغة الشبكية في نموذج الرئيسيات غير البشرية لأمراض الشبكية التنكسية

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

طريقة لتحسين عملية Zanba-Stir-Fried Tiebangchui

Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in northwest China. However, many cases of poisoning have occurred because of TBC's intense toxicity and because its therapeutic and toxic doses are similar. Therefore, finding a safe and effective method to reduce its toxicity is an urgent task. A search through the Tibetan medicine classics shows that the processing method of TBC stir-fried with Zanba was recorded in the "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)". However, the specific processing parameters are not yet clear. Thus, this study aims to optimize and standardize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC.
First, a single-factor experiment was conducted on four factors: the slice thickness of TBC, amount of Zanba, processing temperature, and time. With monoester and diester alkaloid contents in Zanba-stir-fried TBC as indexes, CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method was used to optimize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC. The optimized processing conditions of Zanba-stir-fried TBC were a TBC slice thickness of 2 cm, three times more Zanba than TBC, a processing temperature of 125 &#176;C, and 60 min of stir-frying. This study determined the optimized and standard processing conditions for the usage of Zanba-stir-fried TBC, thus providing an experimental basis for the safe clinical use and industrial production of Zanba-stir-fried TBC.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين تقنية المعالجة ل Tiebangchui مع Zanba استنادا إلى CRITIC جنبا إلى جنب مع طريقة سطح استجابة Box-Behnken  

The present protocol describes an efficient and standard detoxification processing method for Zanba-stir-fried Tiebangchui using CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method.

تحسين تقنية المعالجة ل Tiebangchui مع Zanba على أساس CRITIC جنبا إلى جنب مع طريقة سطح استجابة Box-Behnken

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in ...