القانون النموذجي للتحكيم، حرس السواحل، ويتم دعم MRS من قبل NIA (R00AG033176 وR01AG040081) ومختبر البحوث الموجهة والتنمية، وزارة الطاقة عقد # DE-AC02-05CH11231.

1. معالجة الأنسجة والهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الأنسجة الثديية الإنسان كمادة تجاهل من العمليات الجراحية. يمكن الحد من mammoplasties توفير الخلايا الطبيعية أو حميدة؛ fibroadenomas وgynecomastias توفير خلايا حميدة؛ أنسجة الثدي غير السرطانية (الطرفية أو المقابل إلى وجود ورم، أو تحت الجلد) توفير الخلايا التي قد تتراوح من الطبيعي أن تحتوي على حميدة لmicrotumors. ضمان حسن موافقة IRB موجود قبل الحصول على المواد تجاهل. ينبغي أن يعامل جميع المواد بموجب لوائح الممرض ينقلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المواد في حاويات معقمة مكان يحتوي المخزن المؤقت أو وسائل الإعلام (على سبيل المثال متوسطة في 01:01 Dulbecco معدلة النسر وهام في F-12) تستكمل مع 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 5 ميكروغرام / مل Fungizone، 50U/ml بوليميكسين B، و 10٪ مصل بقري جنيني، والنقل إلى المختبر في 4 درجات مئوية ويمكن تخزين الأنسجة رأب الثدي أو الحد من شحنها في C ° 4 لمدة 72 ساعة دون أن يؤثر ذلك بشكل كبير سوbsequent الخلية قدرتها على البقاء. قد قطع صغيرة من الأنسجة غير رأب الثدي الحد تتطلب معالجة أكثر الأوامر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل المناطق الظهارية من المصفوفة اللحمية من الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة والأوعية الدموية باستخدام مزيج من معقمة الملقط، مشرط ومقص. قطع قطعة من النسيج مع مقص ومكان في صحن زجاجي كبير معقم (على سبيل المثال، 150 مم). تشريح بلطف من المناطق الظهارية، والتي تبدو وكأنها خيوط بيضاء جزءا لا يتجزأ من مصفوفة اللحمية اصفرارا، وذلك باستخدام ملقط لعقد المادية ومشرط لكشط بعيدا عن المواد الدهنية بشكل صارخ. لتسهيل عملية الهضم، وقطع الأنسجة الطلائية إلى أجزاء أصغر من 3-4 مم باستخدام المشارط ~ معارضة ومكان في أنبوب اختبار 50 مل. إذا يتم معالجتها كميات كبيرة من الأنسجة، قد تكون هناك حاجة شفرات المشرط الطازجة. إزالة المواد الدهنية من الطبق للتخلص منها وفقا للقواعد المؤسسية. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأنسجة الليفية بشكل كبير (على سبيل المثال، ماس تحت الجلدtectomies مع المرض الشديد فيبروكيستيك)، سيكون هناك أكثر صلابة بيضاء، غير الظهارية المادية. قد يكون من الصعب تشريح خارج الخلايا الظهارية من المصفوفات ليفية من هذا القبيل. ويمكن خفض قطعة كبيرة من المواد الليفية إلى أجزاء أصغر التي هي ~ مم مربع 1-3 في المنطقة وهضمها بشكل منفصل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنسجة الظهارية تشريح في أنبوب الطرد المركزي المخروطية (50 مل أو 15 مل) مع الأنسجة التي تضم ما لا يزيد عن ثلث حجم الأنبوب. جعل أنبوب يصل إلى حجم كامل، ولم يتبق سوى مساحة صغيرة للسماح الهواء لخلط أثناء التناوب، وذلك باستخدام خليط الهضم الأنسجة (أو ما يعادلها DME/F-12، 10 ميكروغرام / مل الانسولين والمضادات الحيوية على النحو الوارد أعلاه، وتركيز النهائي من 10 FCS٪، 200 كولاجيناز الخام U / مل و 100 هيالورونيداز U / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب مكان على محور دوار HulaMixer أنبوب وتدوير 360 درجة بين عشية وضحاها في 8 دورة في الدقيقة في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 600 XG أنابيب لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف الدهون والمتوسطة في الوفاق التخلصجي لأنظمة المؤسسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من وجود الانتهاء من عملية الهضم من خلال تمييع قسامة صغيرة من بيليه في المتوسط. الهضم عند اكتمال الفحص المجهري يظهر كتل من الخلايا (organoids) مع الهياكل التي تظهر على نحو سلس الأقنية، السنخية، أو الأقنية السنخية خالية من سدى المرفقة (الشكل 1A). سوف الأنسجة رأب الثدي الحد من عادة لا تزال تظهر سدى المرفقة بعد الهضم ليلة وضحاها، وسوف تحتاج الى مزيد من الوقت الهضم. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه هضمها بشكل غير كامل في الأنسجة الطازجة خليط الهضم وإعادة احتضان-C مع التناوب في ° 37 لمدة ساعة 4-12. كرر الخطوات 1.6 و 1.7. إذا ما زالت غير مكتملة الهضم، إضافة مرة أخرى إلى خليط الهضم بيليه وإعادة احتضان-مع دوران في 37 درجة مئوية خلال الليل. وربما يتم تخفيض تركيز الانزيمات لمنع الإفراط في الهضم بين عشية وضحاها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما اكتمال عملية الهضم، أجهزة الطرد المركزي في 600 XG أنابيب لمدة 5 دقائق، نضح الملخصأيون المزيج، إعادة تعليق بيليه في المتوسط ​​بالإضافة إلى المضادات الحيوية في أنبوب مل حوالي 15 ml/50، 5 مل أنبوب ml/15. </li></ol> 2. الترشيح وتجميد المواد إستيعاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مأخوذة من بيليه معلق على مصفاة معقمة أكثر من 100 ميكرومتر أنبوب 50 مل العقيمة. السماح للاستنزاف المتوسطة في أنبوب، ثم rewash organoids على 1-2X مرات أعلى مع 2-3 مل من المتوسط. تكرار حتى يتم نقل كل من بيليه معلق. إذا كان هناك عدد كبير جدا من organoids على مرشح والمتوسطة لم تعد المصارف بسهولة، استخدم فلتر جديد ل المواد المتبقية. الوجه بعناية إعداد (إعدادات) على رأس أنبوب آخر معقمة وغسل organoids في أنبوب مع أكثر المتوسط. هذا هو عضي 100 ميكرومتر حمام السباحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ المواد التي استنزفت في أنبوب 50 مل الأصلي وتكرار هذه العملية من 2.1 ميكرون باستخدام مصفاة 40، للحصول على عضي ميكرون 40 بركة، الذي يحتوي على هياكل السنخية في الغالب. المواد التي استنزفت في اله أنبوب يشكل تجمع الترشيح، الذي يحتوي على كتل واحد / صغيرة من الخلايا الظهارية الوسيطة وقطع صغيرة من والأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه للميكرومتر 100، ميكرومتر 40، وبرك الترشيح في 600 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، إعادة كل أنبوب في CPM II (DME/F-12 أو ما يعادلها مع FCS 44٪ وبنسبة 6٪ DMSO) باستخدام حوالي 1 مل من CPMII في 0.1 مل من بيليه معبأة. الحفاظ على C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور طبق اختبار للتجمعات 2 عضي عن طريق وضع 0.1 مل من المواد معلق في زراعة الأنسجة 35 مم قطرة قطرة طبق من البلاستيك كما في 3.2 أدناه. يمكن تجمع الترشيح المصنف مباشرة على البلاستيك زراعة الأنسجة الليفية المتوسطة مع (DME/F-12 أو ما يعادلها مع 10 ميكروغرام / مل الأنسولين و 10٪ FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة المواد المتبقية معلق في نونك أمبولات تجميد نوع (1 مل / 2 أمبولة مل). بين عشية وضحاها في تجميد C ° -80 ثم نقل على وجه السرعة إلى وحدة التخزين في النيتروجين السائل. نحن لم تلاحظ وجود أية خسائر كبيرة في البقاءفي أمبولات لدينا الأصلي تخزين المجمدة منذ اواخر عام 1970. </li></ol> 3. بذر Organoids مثلجة وثقافة ثانوية الثقافات الابتدائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بسرعة أمبولة تحتوي على organoids المجمدة في حمام ماء C ° 37. البذور وorganoids إلى 2 إلى 10 (عادة ~ 6) أطباق 60 ملم، أو أطباق مم 1-3 100، اعتمادا على تقدير البصرية لعدد organoids في أمبولة. organoids 20-40 تقريبا المصنف في صحن 60 ملم هو الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع بعناية organoids إذابة، قطرة قطرة، على سطح الطبق مع ماصة 1 مل ماصة باستور أو لتوزيع حتى organoids. وضعت قريبة من بعضها البعض سوف Organoids لديك مساحة محدودة للثمرة، مما أدى إلى عدد أقل من الخلايا للثقافة فرعية أو التجميد. تجنب خدش سطح الطبق (خلايا لا تميل للنمو الماضية السطوح خدش). انتظر دقيقة 1-2 للسماح للorganoids إرفاق ببطء ثم قم بإضافة المتوسطة النمو لتجنب طرد لorganoids (على سبيل المثال 2-3 مم طبق ml/60). أناncubate في 37 ° C في CO 2 حاضنة مرطب. هذه هي الثقافات الأساسية. نستخدم حاليا M87A + الأوكسيتوسين (X) المتوسطة للنمو وHMEC أقوى (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 يوم، تأكد من أن يتم إرفاق organoids. إضافة متوسطة إضافية (على سبيل المثال 2-3 مم طبق ml/60). ينبغي الهجرة الخلية من organoids تكون مرئية من قبل 24-48 ساعة، وثمرة من 48-72 ساعة الإنقسامية بعد البذر (1B الشكل، C). في بعض الأحيان المرفق الفقراء بعد 24 ساعة، وخاصة إذا تصفيح organoids overdigested أو organoids من كبار السن من النساء، ولكن معظم الاستعدادات سوف نعلق في غضون 72 ساعة. قد قطع صغيرة من الأوعية الدموية وإرفاق تؤدي إلى الخلية الليفية ثمرة (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الثقافات لا يقل عن 3 مرات في الأسبوع. خلايا نمت في وسائل الإعلام من نوع M87A تنمو لالتقاء بالقرب من داخل 5-8 يوم، وهذا يتوقف كثافة البذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هناك نموا كبيرا الخلايا الليفية، Trypsinization التفاضلية (DT)، استنادا إلىوهناك حاجة مفرزة من الخلايا الليفية السريع من البلاستيك السطح، لإزالة الخلايا الليفية. عندما تصبح كبيرة بقع الظهارية، ووسائل الإعلام الرشفة، صحن غسيل (على سبيل المثال، 1-2 ml/60 طبق مم) مع STE (المالحة، التربسين 0.05٪، 0.02٪ EDTA)، الرشفة، إضافة جديدة STE مل 0.5 و ترك في درجة حرارة الغرفة لحوالي 1 دقيقة مع ملاحظة مجهرية المستمر. عندما الخلايا الليفية ولكن فصل الخلايا الظهارية لا تزال ملتصقة، ولكن بلطف يطرق بشدة على جانب الطبق ضد سطح صلب لإزاحة الخلايا الليفية ونضح ثم بسرعة. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ونضح مرة أخرى. قد الثقافات الملوثة بشكل كبير مع الخلايا الليفية في حاجة الى DT إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية الثقافات الأساسية عند بقع كبيرة الظهارية موجودة، ولكن قبل التقاء. فإن كثافة البذر وعضي مرفق التأثير على الوقت اللازم. الإبقاء على الثقافة الابتدائية والثانوية لتوليد الثقافات المتعددة، متباعدة على مر الزمن، ونحن أداء Trypsinizations الجزئي (PT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرشفة سائل الإعلام، وغسل صحن 60 ملم مع STE مل 1-2، إضافة 0.5 مل STE جديدة لطبق. مراقبة مفرزة الخلية تحت المجهر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-5 دقيقة، مع يطرق لطيف للطبق لتعزيز مفرزة الخلية. يجب أن تتوقف عند Trypsinization ~ 50٪ من الخلايا وفصل. وعادة ما يكون في وقت مبكر PTS السريع مفرزة الخلية. لPTS في وقت لاحق، يمكن وضع الخلايا في C ° 37 مفرزة لسرعة، مع رصد دقيق، حيث أن جميع الخلايا قد تؤتي ثمارها بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من مصل المحتوية على وسائل الإعلام إلى الطبق، repipette لغسل، ونقل إلى أنبوب 15 مل العقيمة. تكرار 2X مع وسائط أخرى ~ مل 1-2، إضافة إلى غسل الأنبوب. الطبق الرئيسي Refeed والعودة إلى الحاضنة. عد الخلايا في الأنبوب مع haemocytometer. ويمكن تكرار PTS حوالي 4 إلى 8 مرات مع إعادة نمو الخلايا جيدة في الأطباق الرئيسية ويعادل نمو طويل الأجل من المرتبات الثانية subcultured أو المجمدة (وتسمى الخلايا المقطع الثاني المرتبات الثانية؛ subcultured مرة واحدة، توجد الخلايا الصغرىnger التمهيدية). مرة واحدة المواد عضي لم يعد موجودا في الثقافات الأولية، المرتبات الثانية subcultured تبين انخفاضا في عدد السكان على المدى الطويل المحتملة مضاعفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لثقافة فرعية لالمرتبات الثانية، وخلايا البذور مباشرة من الأنبوب إلى الأطباق. والبذر من 1-2 X 10 5 مم طبق cells/100 في وسط قوي مثل M87A + X يؤدي إلى التقاء في 4-7 أيام. نضيف بكتيريا الكوليرا إلى المتوسطة في المقطع الثاني لزيادة إمكانات التكاثري، تم حذف ذيفان الكوليرا في الثقافة الأولية لأنه يؤدي إلى ثمرة الخلية متعددة المستويات من organoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجميد المرتبات الثانية و، بيليه في 600 XG أنبوب لمدة 5 دقائق، و resuspend في CPMII ذات الكثافة النهائية من الخلايا 6 10 / مل. قسامة معلق الخلايا في نونك أمبولات تجميد النوع، بين عشية وضحاها في تجميد -80 درجة مئوية ثم نقل على وجه السرعة والتخزين لفي النيتروجين السائل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المستحسن لتجميد الخلايا من PT الأول لحفظها، واستخدام الخلايا من PT الثاني لثقافة فرعية. ويمكن تخزين المواد السمية الثابتة إضافية تجميدها لاستخدامها في المستقبل. </li></ol>

<ol>
	<li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length.">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li><li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus:+all+for+one+or+one+for+all.">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li><li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture.">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li><li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells.">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li><li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li><li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo(a)pyrene.">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li><li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation.">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li><li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion.">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li><li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines.">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li><li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -. L., Ljung, B. -. M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer.">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li><li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -. L., Lee, J. -. H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized.">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li><li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis.">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li><li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization.">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li><li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs.">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li><li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li><li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia.">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li><li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells:+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract.">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الإنسان معالجة الأنسجة الثديية الطريقة المعروضة هنا يمكن الحصول على الخلايا الظهارية الثديية نقية من خليط غير متجانس من أنواع الخلايا في الثدي الإنسان. الترشيح من خلال مسام حجم ثابت يسمح الفصل بين الفصائل المختلفة في الغدة الثديية (مثل الأقنية والسنخية، مقابل الأقنية السنخية) من المصفوفة اللحمية هضمها. ويمكن الحصول على الخلايا الليفية الثديية إسوية الجينات لتتناسب مع الخلايا الظهارية. احتفظ المجمدة المواد هضمها جدوى جيدة لأكثر من 30 عاما. وقد عملت هذه الطريقة بنجاح على كافة أنسجة الثدي الليفي ولكن جدا، وبسيطة لتنفيذ. الأشكال الأخرى من معالجة الأنسجة الثديية موجودة والتي لا توفر الكسور الظهارية التي هي قابلة للحياة، نظيفة، أو المنفصلين عن ذويهم. وضع organoids معالجتها في الثقافة مع وسائل الاعلام الإجهاد الذي يحفز منخفضة مثل M87A يسمح النمو على المدى الطويل من علامات HMEC مع نسب متعددة. HMEC التي تم زرعها على البلاستيك ما زالت تحتفظ القدرة على أجناسالشركة المصرية للاتصالات مع الهياكل 3D طبيعية في الجسم الحي علاقات النسب مثل. هذه الثقافات HMEC هي مناسبة لتحقيق تجريبية واسعة النطاق، بما في ذلك الإنتاجية العالية، والسلوك العادي وHMEC العوامل التي قد تدفع أو تمنع الشيخوخة والتحول.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الزجاج طبق بتري 15 سم </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> مقص 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> ملقط 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> المتاح المشارط </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> كولاجيناز </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> هيالورونيداز </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> الأنسولين </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / الستربتوميسين </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymixin B كبريتات </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> الحياة تكنولوجيز</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> التربسين 0.05٪ 100 مل </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> الخلية مصفاة 100 ميكرون </td><td> BD الصقر </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> الخلية مصفاة 40 ميكرون </td><td> BD الصقر </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 15 مل أنابيب </td><td> غرينر الحيوي واحدة </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> 50 مل أنابيب </td><td> غرينر الحيوي واحدة </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> أطباق TC 10 سم </td><td> غرينر الحيوي واحدة </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> أطباق TC 6 سم </td><td> غرينر الحيوي واحدة </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> المبردة قارورة </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> هاوزر العلمية </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> نبذ </td><td> إيبندورف نموذج </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

دراسة تجريبية لالثديية الإنسان العادي الظهارية السلوك (HMEC) خلية، وكيف يكتسب خصائص الخلايا الطبيعية غير طبيعية، يمكن أن تيسره في نظم الثقافة المختبر بدقة أكبر نموذج في علم الأحياء الجسم الحي. استخدام الإنسان لدراسة مواد مشتقة التمايز الخلوي، والشيخوخة، الشيخوخة، وتخليد أمر مفيد نظرا لكثرة الخلافات الجزيئية كبيرة في هذه الخصائص بين الخلايا البشرية واستخدامها القوارض عادة 1-2. الخلايا الثديية تقديم نموذج مناسب لنظام كميات كبيرة من الأنسجة الطبيعية وغير الطبيعية متوفرة بسبب وتيرة الحد من رأب الثدي وجراحات استئصال الثدي. الغدة الثديية يتكون من خليط معقد من العديد من أنواع الخلايا متميزة،، الظهارية على سبيل المثال، الدهنية، الوسيطة، البطانية. الخلايا الظهارية هي المسؤولة عن وظيفة الثديية متباينة من الرضاعة،وأيضا أصل الغالبية العظمى من سرطانات الثدي البشرية. وقد وضعنا طرق لمعالجة الغدة الثديية الأنسجة تجاهل الجراحية إلى مكونات نقية الظهارية وكذلك خلايا اللحمة المتوسطة 3. ويمكن تخزين المواد المصنعة المجمدة إلى أجل غير مسمى، أو شرع في الثقافة الأولية. ويتم نقل المواد الجراحية تجاهل إلى المختبر وتشريح يدويا لإثراء الأنسجة التي تحتوي على لالظهارية. الهضم لاحقة من الأنسجة تشريح باستخدام شرائط هيالورونيداز كولاجيناز والمواد اللحمية من ظهائر في الغشاء القاعدي. ويمكن فصل القطع الصغيرة الناتجة من شجرة الظهارية (organoids) من سدى هضمها عن طريق الترشيح متتابعة على الأغشية من حجم المسام الثابتة. اعتمادا على حجم المسام، يمكن الحصول على الكسور التي تتكون من قطعة أكبر الأقنية / السنخية، مجموعات أصغر السنخية، أو الخلايا اللحمية. وقد لاحظنا نمو متفوقة عندما بدأت الثقافات وorganoids بدلا من ديسواحد الخلايا sociated. وضع organoids في استخدام وسائل الإعلام ثقافة حمل منخفضة الإجهاد تدعم النمو على المدى الطويل من HMEC طبيعية مع علامات من أنواع متعددة النسب (، اللمعية ظهاري عضلي، السلف) 4-5. ويمكن الحصول على عدد كاف من خلايا الأنسجة من فرد واحد للسماح باستخدام الفحص التجريبي واسعة دفعات خلية موحدة، وكذلك التحقيق باستخدام أساليب إنتاجية عالية. وقد استخدمت HMEC مثقف في مجموعة متنوعة واسعة من الدراسات الوبائية التي تبحث في العمليات العادية التي تحكم النمو، والتمايز، والشيخوخة، والشيخوخة، وكيف يتم تغيير هذه العمليات العادية خلال التحول الخالد والخبيثة 4-15،16. ويمكن مقارنة آثار النمو في وجود مواد المصفوفة خارج الخلية، أنواع الخلايا الأخرى، و / أو الثقافة 3D مع النمو على 5،15 البلاستيك. HMEC مثقف، بدءا الخلايا الطبيعية، وتوفير نظام لين العريكة تجريبيا لدراسة العوامل التيقد دفع أو منع الشيخوخة الإنسان والتسرطن.

وتظهر الأرقام ممثل لهضم الأنسجة بشكل مناسب لorganoids ووضعها في الثقافة في الشكل 1. سوف تظهر الأنسجة هضم المواد غير كامل لا تزال تعلق على الجزء الخارجي من هذه الهياكل، ومن المحتمل أن يكون بعض نمو الخلايا الأرومة الليفية في الثقافة الأولية، الأمر الذي يتطلب DT إزالته. سوف تظهر الأنسجة Overdigested الحدود الخارجية أقل على نحو سلس، ويمكن أن يستغرق وقتا أطول لإرفاق في الثقافة الأولية. يجب أن تبدأ ثمرة الظهارية ضمن 48-72 ساعة (1B، C). يمكن قطع صغيرة من الأوعية الدموية (1D) أن تكون مصدرا للخلايا اللحمة المتوسطة ثمرة. زيادة نمو الخلايا الطلائية تظهر السكان غير متجانسة شكليا، مع السكان التكاثري التي تحتوي على خليط من الخلايا المرتبطة مع علامات السلف، ظهاري عضلي، والأنساب لمعي (1E، 3C-E). وسيكون معدل النمو في وسائل الإعلام الإجهاد المنخفضة مثل M87A تستكمل مع توكسين الكوليرا والأوكسيتوسين دعم متفوقة على المدى الطويلنمو HMEC قبل الركود العادي مقارنة مع الصيغ السابقة سائل الإعلام (الشكل 2). سوف M87A من نوع وسائل الإعلام أيضا أن تدعم نمو الخلايا اللمعية والسلف من خلال الممرات 4-8 (أرقام 3C-E، 4)؛ بعد ذلك، تظهر علامات معظم الخلايا ظهاري عضلي النسب فقط. يمكن HMEC مثقف على البلاستيك تحتفظ بقدرتها على تشكيل 3D السليم التنظيم الذاتي في micropatterned 3D microwells، مع الخلايا اللمعية الداخلية للخلايا ظهاري عضلي (الشكل 4A، B)، وتشكيل هياكل المنظمة عندما مطلي في Matrigel (4C، D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. HMEC organoids والثقافة الأولية. (A) عضي تظهر الأقنية السنخ هيكل بعد الهضم والترشيح. (B، C) Organoids تظهر بنية الأقنية والسنخية 2 يوم بعد الإيداع في الثقافة الأولية؛ لاحظ الخلية بداية outgrowth (الأسهم البيضاء). (D) الأوعية الدموية الصغيرة والمرفقة مع بدء ثمرة الخلايا الليفية من ثقافات نفس B، C. (E) ثمرة من الخلايا الظهارية الثقافة عضي الأولية بعد 4 أيام. يتم تحديد الأنساب من تلطيخ مع الأجسام المضادة لK14 (أحمر) وK19 (الأخضر)؛ كانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). اللمعية (K14-/K19 + والأخضر)، ظهاري عضلي (K14 + /-K19، أحمر)، والسلف (K14 + / + K19، أصفر) الخلايا مرئية. ويلاحظ خلايا غير ملوثين في قلب عضي بسبب اختراق الأجسام المضادة غير مكتملة. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. وبدأت نمو الثقافات HMEC في المستحضرات وسائل الإعلام المختلفة. Organoids تم الحصول عليها من فرد واحد، عينة 184، في الثقافة الأولية باستخدام وسائل الإعلام المختلفة الصيغ. يتم الحصول على أفضل نمو طويل الأجل باستخدام صياغة لدينا أحدث M87A + الأوكسيتوسين (X) 4. كما يدعم هذه الوسيلةنمو الأنساب HMEC متعددة (انظر الشكل 1E). قدمت وسائل الاعلام في وقت سابق صيغة، مم 3 النمو أقل قوة، في حين أن وسائل الإعلام المصل الحرة، MCDB170 (MEGM التجارية) 17 يؤدي إلى الحث السريع للالسيكلين كيناز مثبطات P16 INK4A واختيار للخلايا الشاذة 7،11،13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="الشكل 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> الشكل 3. مقارنة النسب التنوع في organoids جاهل ومثقف HMEC في 4 تحليل FACS ال مرور. (A، B) لعضوي وغير مثقف فصلها إنزيمي للتعبير (A) من EpCAM وCD49f/alpha إنتغرين 6، وCD227/Muc1 (B) وCD10/CALLA. (C، D) FACS تحليل من 4 HMEC عشر قبل مرور ركود للتعبير عن (C) إنتغرين 6 EpCAM وCD49f/alpha، و (D) وCD227/Muc1 CD10/CALLA. التعرف عكما وصفت opulations LEP (التعبير عن علامات EPCAM اللمعية أو CD227)، الهندسة الكهربائية والميكانيكية (التعبير عن ظهاري عضلي أو علامات CD49f CD10)، أو PROG (المخصب CD49f + / + السكان EPCAM). نلاحظ أنه خلال التكيف مع ثقافة التنظيم والتغييرات EpCAM CD49f مقارنة organoids جاهل. (E) غير مصنف HMEC وFACS التخصيب LEP والهندسة الكهربائية والميكانيكية في مرور ال 4 ملطخة لتحليلها المناعي من الكيراتين K14 (MEP علامة) وK19 (LEP علامة) للتحقق من تحديد النسب. نوى الملون مع دابي تظهر زرقاء. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="الشكل 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> الشكل 4. HMEC مثقف قادر على تشكيل هياكل المنظمة مع النسب في العلاقات الجسم الحي مثل عند وضعه في microenvironments المناسبة. (A) كانت قبل مرور ال 4 ركود HMEC FACS التخصيب طn لاللمعية LEP والأنساب MEP ظهاري عضلي باستخدام علامات لCD227 CD10 و، مع هذه الأنساب التحقق من التعبير عن K14 K19 و(لا يظهر). (ب) كانت الخلايا المستزرعة عندما مختلطة معا في microwells micropatterned، وقادرة على التنظيم الذاتي في طبقات ثنائية مع MEP على السطح الخارجي والداخلي LEP [مقتبس من تشانسون وآخرون. 5]. LEP fluorescently المسمى (الأخضر)، والهندسة الكهربائية والميكانيكية (أحمر) وتصويرها باستخدام المجهر متحد البؤر في ساعة 0، على مدار 24 ساعة، وبعد 48 ساعة بالإضافة إلى microwells (العلوي). وصفت بشكل تعسفي السيطرة HMEC مع تسميات نيون أحمر أو أخضر (أقل). (C) صورة مشرقة مجال الخلايا الاصلية FACS التخصيب (cKit +) في الثقافة مطلي (Matrigel) 3D ونمت لمدة 18 يوما. يمكن الهياكل الناتجة عن المعرض التشكل السنخية. (D) تم استخراج الهياكل من Matrigel وملطخة للكشف عن K14 K19 و؛ كانت counterstained النوى مع دابي. تحليل مناعي يظهر هياكل المنظمة مع بولا الصحيح لمعي والقاعديةاألمن.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture at JoVE.com

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

يوصف أسلوب لمعالجة المواد تجاهل الإنسان الثديية الجراحية. ويمكن تخزين الأنسجة المصنعة، في شكل organoids، مجمدة إلى أجل غير مسمى أو وضعها في الثقافة لنمو طويل الأجل. هذه الطريقة تمكن من فحص تجريبي الإنسان العادي بيولوجيا الخلايا الظهارية، وآثار الاضطرابات الخارجية.

تجهيز رأب الثدي لحد من استئصال الثدي والأنسجة البشرية للثقافة الخليوي

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

processing-human-reduction-mammoplasty-mastectomy-tissues-for-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory. يوصف أسلوب لمعالجة المواد تجاهل الإنسان الثديية الجراحية. ويمكن تخزين الأنسجة المصنعة، في شكل organoids، مجمدة إلى أجل غير مسمى أو وضعها في الثقافة لنمو طويل الأجل. هذه الطريقة تمكن من فحص تجريبي الإنسان العادي بيولوجيا الخلايا الظهارية، وآثار الاضطرابات الخارجية....

Video: Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

تجهيز الدماغ الأولية للفحوصات الأنسجة السرطانية والخلايا الجذعية تدفق الفرز

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

الثقافة الأولية من الإنسان الدهليزي Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

الإنسان دوبوترين<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة Myofibroblasts وخارج الخلية مصفوفة التفاعلات

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere تشكيل الفحص من الثدي البشري سرطان الأنسجة وخطوط الخلايا

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

العمل مع الأنسجة البشرية لبالحركة أبحاث السرطان

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

A غليوبلاستوما الإنسان أورغانوتيبيك نموذج شريحة شريحة لدراسة هجرة الخلايا السرطانية والآثار الخاصة بالمريض من الأدوية المضادة للغزو

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

منهجية الاستقراء البصاق وتجهيز المختبرات

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...