وقد دعم هذا العمل في المقام الأول 5 UO1-ES016045 بدعم جزئي من 1-R21-R44-ES019498 وES021116. وأيد DMW من التدريب غرانت علوم الصحة البيئية في علم السموم البيئية T32-ES007020. تم توفير المعدات من قبل مركز علوم الصحة البيئية P30-ES002109.

1. إعداد رقاقة <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام رقاقة من حزمة والمكان إلى جانب فيلم بئر واحدة لوحة مستطيلة، هلام أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل هلام في 25 مل 1X PBS لمدة 15 دقيقة، كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل على لوحة من الزجاج والتوجه التسمية من هلام وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط بلطف على قعر وحة 96 جيدا مقلوب على هلام. تأكد من أن جميع الآبار من لوحة جيدا قعر ضمن مجال هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1.5 &#39;مقاطع الموثق على كل جانب من لوحة لتأمين لقط مع الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة PBS الزائدة العازلة في كل بئر. </li></ol> 2. تحميل خلايا <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للخطوط الخلايا تعليق، تمييع تعليق خلية في وسائل الإعلام للحصول على تركيز النهائي من 10 -10 5 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للخطوط الخلايا الملتصقة، اتبع العادية فصل / بروتوكولات trypsinization ودilute خلايا منفصلة في وسائل الإعلام إلى التركيز النهائي من 10 5 -10 6 خلية / مل. إذا خلايا الكلي، تمرير تعليق خلية في تصفية خلية للحصول على تعليق خلية واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من 96 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الغلاف مع الفيلم هلام لمنع التبخر وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للخلايا لتحميل لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 ° C الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة رقاقة من الحاضنة ونضح وسائل الإعلام من كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مقاطع الموثق وقعر صفيحة 96 أيضا؛ عقد رقاقة مع لوحة من الزجاج في زاوية وشطف بلطف مع 1X PBS لإزالة الخلايا الزائدة على الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق تحميل الخلية باستخدام المجهر حقل مشرق مع عدسة الهدف 4X. إذا لوحظ عدم كفاية تحميل، كرر من الخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة تحميلها على السطح حتى (المختبر مقاعد البدلاء). رقاقة تراكب مع 1٪ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز هذا هو ما قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية. استخدام حوالي 2̵هناك حاجة إلى 3 مل من LMP الاغاروز لكل رقاقة: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح تراكب ليصلب الأول في RT لمدة 3 دقائق ثم ينتقل إلى 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة 5 دقائق لدبق كاملة. </li></ol> 3. الجرعات وتصليح ملاحظة: لدراسة خط الأساس DNA مستوى الضرر، انتقل إلى الخطوة 4. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة بعناية الآبار من الشريحة (تم إنشاؤه من لقط السابق) مع آبار جديدة قعر وحة 96 جيدا. إعادة الصحافة قعر لوحة 96 جيدا على رأس وآمن لقط مع مقاطع الموثق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الكيميائي للجرعة المطلوبة إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا. تؤدي الجرعات / أو العلاج على الجليد في 4 درجات مئوية الثلاجة لمدة المبلغ المطلوب من الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجرعات الكيميائية للنضح من كل بئر وشطف بعيدا الكيميائية المتبقية باستخدام برنامج تلفزيوني 1X. إذا تم دراستها الأضرار المباشرة هنا، انتقل إلى الخطوة 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدراسة حركية الإصلاح، وتسمح للخلايا في رقاقة لإصلاح فيوسائل الإعلام في 37 درجة مئوية. ليز (انتقل إلى الخطوة 4) في نقطة زمنية محددة. ملاحظة: إصلاح لا يمكن أن يؤديها على رقاقة مع قعر لوحة 96 جيدا المرفقة، أو يمكن خفض الشريحة إلى قطع منفصلة بعد إزالة لوحة قعر البئر 96. </li></ol> 4. تحلل <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء فحص القلوية المذنب: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العمل العازلة تحلل القلوية بإضافة 1٪ تريتون X-100 إلى القلوية محلول المخزون تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي نا 2 EDTA، 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 10). إعداد حوالي 25 مل من العمل العازلة تحلل لكل رقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البرد العمل العازلة تحلل القلوية في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر رقاقة بارد في العمل العازلة تحلل القلوية والسماح تحلل لأداء O / N في 4 ° C الثلاجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء فحص محايد المذنب: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العمل تحلل العازلة محايد بإضافة 1٪ تريتون X-100 و 10٪ DMSO إلى محايد محلول المخزون تحلل (2.5 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي نا 2 EDTA، 10ملي تريس، 1٪ N -Lauroylsarcosine، ودرجة الحموضة 9.5). إعداد حوالي 25 مل العمل تحلل العازلة لكل رقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحارة العمل تحلل العازلة محايد في 43 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغرق في رقاقة دافئ العمل تحلل العازلة محايدة، والسماح تحلل لأداء O / N في 43 ° C الحاضنة. </li></ol></li></ol> 5. الكهربائي <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء فحص القلوية المذنب: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة تحلل وبسرعة شطف رقاقة مع 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقاقة آمن في غرفة الكهربائي مع الجانب هلام فيلم تواجه أسفل باستخدام الشريط على الوجهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الغرفة إلى غرفة باردة 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة مع قلوية البارد عازلة الكهربائي (0.3 M هيدروكسيد الصوديوم، 1 ملم نا 2 EDTA) إلى المستوى الذي يغطي فقط هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح بتفكيك قلوية لمدة 40 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الكهربائي في 1 V / سم و 300 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة في غرفة باردة. ضبط مستوى الصوت من العازلة الكهربائي في تشاmber لتحقيق المطلوب الحالية قيد التشغيل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء فحص محايد المذنب: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة تحلل وشطف رقاقة مع العازلة الكهربائي محايد (2 ملي نا 2 EDTA، 90 ملي تريس، حمض البوريك 90 ملم، ودرجة الحموضة 8.5) لمدة 2 × 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقاقة آمن في غرفة الكهربائي مع الجانب هلام فيلم تواجه أسفل باستخدام الشريط على الوجهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الغرفة إلى غرفة باردة 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة مع البرد عازلة الكهربائي محايد (2 ملي نا 2 EDTA، 90 ملي تريس، حمض البوريك 90 ملم، ودرجة الحموضة 8.5) إلى المستوى الذي يغطي فقط هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للهلام على الجلوس في غرفة باردة لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الكهربائي عند 0.6 V / سم و 6 مللي أمبير لمدة 60 دقيقة في غرفة باردة. ضبط مستوى الصوت من العازلة الكهربائي في الغرفة لتحقيق المطلوب تشغيل الحالية. </li></ol></li></ol> 6. التصوير الفلورسنت <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة رقاقة من غرفة الكهربائي من عمودغرفة د. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد المواد الهلامية في تحييد العازلة (0.4 M تريس، ودرجة الحموضة 7.5) لمدة 2 × 15 دقيقة في 4 درجات مئوية الثلاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار وصمة عار مع رقاقة الحمض النووي الفلورسنت الاختيار (أي الذهب SYBR، إيثيديوم بروميد) تحت مصنع أوصى الإجراءات. الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت. </li></ol> تحليل البيانات 7. تحليل الصور المذنب من قبل معيار البرمجيات مقايسة المذنب مثل كوميت 5.5.

<ol>
	<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles,+Applications,+and+Limitations.">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li><li>Olive, P. L., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+and+DNA+damage+analysis+using+microwell+arrays.">Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).</li><li>Weingeist, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+enables+high-throughput+evaluation+of+DNA+double-strand+breaks+and+DNA+repair+inhibitors.">Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.</a> Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).</li><li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+comet+assay:+use+and+status+in+genotoxicity+testing.">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li><li>Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+toxicity+assessment:+employing+the+best+science+for+human+safety+evaluation+part+III:+the+comet+assay+as+an+alternative+to+in+vitro+clastogenicity+tests+for+early+drug+candidate+selection.">Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection.</a> Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>M&#248;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+of+environmental+agents+assessed+by+the+alkaline+comet+assay.">Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay.</a> Basic &amp; clinical pharmacology &amp; toxicology. 96, 1-42 (2005).</li><li>Dusinska, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+in+human+biomonitoring:+gene-environment+interactions.">The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions.</a> Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+the+comet+assay+in+the+clinical+management+of+cancer.">Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer.</a> Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+generated+damage+to+the+guanine+moiety+of+DNA:+mechanistic+aspects+and+formation+in+cells.">Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells.</a> Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).</li><li>Forchhammer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+measurement+of+DNA+damage+by+comet+assay+measured+by+the+ECVAG&#8224;+inter-laboratory+validation+trial.">Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG&#8224; inter-laboratory validation trial.</a> Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).</li><li>Olive, P. L., Wlodek, D., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis.">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li><li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA.">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li><li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+(comet+assay).">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , (2010).</li><li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay.">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li><li>Collins, A. R., Dusinsk&#225;, M., Horsk&#225;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alkylation+damage+in+human+lymphocyte+DNA+with+the+comet+assay.">Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay.</a> Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).</li><li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic.">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li><li>Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations.">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li><li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population.">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li></ol>

The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

genotoxins في كل مكان في البيئة وأيضا داخل الخلايا البشرية تمارس الضغط لا مفر منه وتلف الحمض النووي الخلوي. في الواقع، تشير التقديرات إلى أن هناك 1،000s من آفات الحمض النووي الموجودة في الخلايا البشرية في حالة مستقرة 18. فهم الضرر قابلية وحركية الإصلاح في البشر ليس فقط يجلب البصيرة إلى البحوث الأساسية، ولكن أيضا فوائد تطوير الأدوية. ومن المفارقات، على الرغم من قدرة الحمض النووي من التلف لتعزيز السرطان، وتستخدم وكلاء ضررا DNA عند مستويات مرتفعة جدا لعلاج السرطان، مما يجعل المعرفة عن الحمض النووي من التلف وإصلاح ذات الصلة الطب الشخصي. وCometChip هو جهاز البحوث الرواية التي تستخدم ممارسات التصنيع الدقيق للثورة وكانت موجودة منذ فترة طويلة فحص الحمض النووي من التلف. بناء على نفس مبادئ الفحص المذنب التقليدي، يوفر رقاقة أعلى بكثير الإنتاجية وتحسين التكاثر. وصفنا هنا طرق لاستخدام هذه الشريحة. لتوضيح فائدتها ومتانة، وتبين لنا النتائج جيئة وذهابام العديد من التجارب حيث تم استخدام رقاقة لتقييم الأضرار الناجمة عن عدة عوامل ضارة DNA مختلف، وحيث تم استخدامه لتقييم إصلاح الحمض النووي. معا، والنتائج المقدمة هنا توفر معلومات مفيدة لاستخدام رقاقة وتظهر إمكانية تطبيقه على نطاق واسع لبحث الحمض النووي من التلف والإصلاح. واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هو إنجاز الفعلي لتحميل الخلية. وقد تم اختبار العديد من خطوط الخلايا على هذا النظام، بما في ذلك تعليق والخلايا الملتصقة. تحميل كفاءة يعتمد على العديد من المتغيرات مثل نوع من الخلايا، حجم الخلية، وتركيز التحميل والوقت. خطوط الخلايا مثل الخلايا تعليق lymphoblastoid هي أسهل للعمل مع. تركيز تعليق خلية يمكن أن تتفاوت من 10 أبريل - 10 يونيو خلايا في 96 جيدا وتحميل يكمل عادة في 15-30 دقيقة. كثافة الخلية أعلى تسهل التحميل ويقصر مقدار الوقت اللازم للخلايا ليستقر في microwells. يمكن تحميل المعلمات للخلايا ملتصقة تختلف من خلايا تعليق. تم العثور على خطوط الخلايا مثل الصينية الهامستر المبيض (CHO) خلايا، لديك كفاءة مماثلة تحميل كخلايا تعليق (trypsinization التالية)، وبالتالي استخدام ظروف التحميل مماثلة. أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا السرطانية التي تشكل بسهولة المجاميع خلية في التعليق، وتتطلب معالجة إضافية. يمكن تمرير تعليق خلية من خلال مرشح وحيد الخلية وإضافة التربسين إلى وسائل الإعلام تعليق قمع تشكيل مجموعات الخلايا أثناء التحميل. أخيرا، من حيث وقت التحميل، والوقت اللازم لالتقاط خطوط الخلايا الملتصقة في microwells يمكن أن تتفاوت من 20 دقيقة إلى 1 ساعة. ونتيجة لذلك، فمن المستحسن أن المستخدمين إجراء التجارب الرائدة لتحديد ظروف التحميل الأمثل قبل الشروع في مزيد من التحقيقات. يمكن تصور فعالية تحميل تحت المجهر حقل مشرق أو كشف أكثر دقة عن طريق تلطيخ الخلايا مغلفة مع دابي أو DNA الآخرينالبقع السابقة للتقييم تحت المجهر الفلورسنت. واحد الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي رقاقة وبراعة. أولا، لا تقتصر الباحثين إلى تركيز خلية عمل معين لأن الخلايا الزائدة وجرفت، وميكروأري يضمن موحدة المذنب الكثافة. ثانيا، يمكن جعل microwells مع أحجام متغيرة لاستيعاب أنواع الخلايا ذات أحجام مختلفة. في ظل الظروف التي يتم التقاطها خلايا متعددة في microwell واحد، المذنبات متعددة الخلايا هي النتائج متسقة معايرة الذاتي والعائد بالمقارنة مع المذنبات وحيدة الخلية 6،7. فائدة أخرى من الزخرفة الخلايا في ميكروأري هي أن جميع المذنبات هي ثم في نفس المستوى البؤري مع مواقع ثابتة، والحد من الضوضاء بسبب المذنبات غير مركزة وتسهيل التصوير والتحليل الآلي. تمكن تحسينات كبيرة في الإنتاجية والحساسية التي تقدمها CometChip تطبيق الفحص للدراسات واسعة النطاق. أخذت معا، ورقاقة توفيرسا أداة قيمة لتقييم الأضرار الحمض النووي للباحثين وعلماء السموم والأطباء وعلماء الأوبئة. بينما يتم الفحص المذنب المعروف حساسية ممتازة في الكشف عن مجموعة واسعة من الحمض النووي من التلف، يعاني هذا الاختبار أيضا من انخفاض خصوصية. باستخدام هذا البروتوكول يحسن إلى حد كبير استنساخ والإنتاجية للمقايسة، ولكنها لا تثبت التقدم في خصوصية. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن مضاعفة فحص مع منهجيات أخرى لتكون فعالة في تحقيق أعلى خصوصية. ومن الأمثلة على ذلك إدراج تنقية الانزيمات آفة محددة. هذه الانزيمات يمكن تحويل قاعدة الآفات لا يمكن اكتشافها إلا في فواصل حبلا اكتشافها ومواقع abasic 1،19-21. والمثال استخداما هو إصلاح الحمض النووي نوكلياز داخلية formamidopyrimidine glycosylase (FPG)، الذي يكشف عن تعديلات الحمض النووي الأكسدة 19،22. لأنه يتم تطبيق الخطوة انزيم الهضم بعد تحلل الخلية، يمكن للنظام أن يعامل بنفس الطريقةسا الشريحة الاغاروز التقليدية دون إجراء أي تعديلات على البروتوكول. على الرغم من أن بروتوكول مفصلة لم يتم وصفه هنا، وقد تم تكييف هذا النهج من قبل العديد من المستخدمين مقايسة المذنب التقليدي في الماضي والبروتوكولات يمكن العثور بسهولة. في منشور السابق، استخدمنا هذا الأسلوب لتحديد الفلورسنت التي يسببها ضوء الضرر 22. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يوفر الإنتاجية، والذي يفتح الأبواب للدراسات التي كانت في السابق مستحيلا. القدرة على معالجة 96 عينة على نفس المنصة لا يقلل فقط من العمل والوقت، ولكن أيضا يقلل من الضوضاء التجريبية، ويعزز إلى حد كبير استنساخ. تباين عينة أمور أقل بكثير من التباين التقليدي شريحة إلى الشريحة، التي يمكن أن تكون 2 أضعاف أعلى من التباين وحظ مع هذه الشريحة 6،7. يؤدي خفض الضوضاء أيضا في تحسين حساسية، مما كشف عن الاختلافات أكثر دهاء بين العينات. لأن الجهاز يعمل على ستاndard شكل 96 جيدا، وهو متوافق مع المعدات البحثية العامة وHTS التكنولوجيات. النظر في الدراسة التي تتطلب تقييم 100 عينة، على افتراض أن متوسط ​​الباحث يمكن معالجة ~ 30 الشرائح الزجاجية على مدار عدة أيام. وبالنظر إلى أن كل عينة تحتاج إلى أن يؤديها في ثلاث نسخ، ان الامر سيستغرق نحو شهر لاستكمال هذه الدراسة، التي من شأنها أيضا تعاني حتما من عينة لعينة الاختلاف. في المقابل، معالجة 100 حالة، كل في ثلاث نسخ، مع هذه الشريحة تتطلب سوى بضع لوحات، ويمكن أداؤها في ثلاثة أيام. هذا تحسن كبير في الإنتاجية يفتح الباب أمام الدراسات التي كانت سابقا غير قابلة للتحقيق. بروتوكول المعروضة هنا يصف كل من الإجراءات الأساسية لإجراء الفحص المذنب القياسية والخطوات اللازمة لتعديل استخدام منصة CometChip. مع القدرة على قياس كل المتأصلة مستويات الحمض النووي من التلف والرد إصلاح اللاحقة، والاختبار هو ذات أهمية كبيرة لمجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية والسريرية. معلومات عن تأثير التعرض للمواد الكيميائية المحددة على الجينوم تسهل الوقاية من الأمراض والعلاج. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا اهتمام كبير في تحديد الاختلافات في الحمض النووي الضرر الحساسية والقدرة على إصلاح بين الأفراد 23،24. توفر هذه التقنية سرعة نقل المطلوب لمثل هذه الدراسات على نطاق واسع. المعرفة حول الاختلافات بين الأفراد هو أمر حاسم لتحديد الأشخاص المعرضين لتصميم وعلاجات فردية أو استراتيجيات المنع. أخذت معا، والتكنولوجيا المقدمة هنا توفر إنتاجية عالية وموضوعية وكمية منصة تحليل الحمض النووي من التلف الذي لديه القدرة على أن تصبح منهجية موحدة في المستقبل القريب.

وهلام الكهربائي خلية واحدة (SCGE) فحص (الملقب الفحص المذنب) هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتقدير حجم مجموعة واسعة من آفات الحمض النووي، بما في ذلك الآفات القاعدة، مواقع abasic، فواصل حبلا واحدة، فواصل حبلا مزدوجة، crosslinks والقلويات حساسة المواقع. مبدأ الكامنة وراء الفحص هو أن تلف الحمض النووي يهاجر بسهولة أكبر من الحمض النووي غير التالفة بسبب التشرذم وفقدان هيكل superhelical. مدى الهجرة يتناسب مع كمية من الحمض النووي من التلف، ويمكن تصور باستخدام المجهر مضان. التقاط الصور وتحليل الشخصية شدة DNA على شكل المذنب الفردي ثم تقديم القياسات المعلمة مثل طول الذيل، والذيل لحظة، وDNA٪ في الذيل للكشف عن مستوى الضرر الحمض النووي داخل الخلية 1-4. حاليا هناك نسختين تستخدم عادة للمقايسة المذنب: أ) فحص القلوية المذنب وب) مقايسة المذنب محايد. فحص القلوية المذنب هو الأكثر انتشاراالنسخة المستخدمة، والذي يستخدم منطقة عازلة درجة الحموضة العالية للاسترخاء DNA قبل الكهربائي وبالتالي بالكشف عن جميع أنواع فواصل حبلا والقلويات مواقع حساسة. الفحص المذنب محايد، من ناحية أخرى، هو أقل متمرسة لأنه يستخدم عازلة محايد للحفاظ على اللوالب المزدوجة وكشف الوحيدة فواصل حبلا مزدوجة 2،5. الكيميائية والعوامل المادية التي تحفز DSBs، يتم إنشاء SSBS في الحفل، وتتشكل عند مستويات أعلى بكثير (على سبيل المثال، SSBS γIR التي يسببها هي أمر من حجم أكثر شيوعا من DSBs). بالنسبة لمعظم التعرض الضارة DNA، DSBs هي أقل تواترا بكثير من فئات أخرى من الحمض النووي من التلف، وبالتالي هي أكثر صعوبة للكشف. لقد أثبتنا في المنشورات السابقة نافذة الكشف عن كلا الإصدارين. 6،7 على الرغم من أن مقايسة المذنب قد استخدمت بشكل روتيني للبحوث الأساسية على الحمض النووي من التلف وإصلاح واختبار السمية الوراثية 1،2،8-15، تم الإبلاغ عن الفحص وجود الفقراء بسبب استنساخ عينة ل-عينة، من شخص إلى شخص وتقلب المختبر إلى المختبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن الاختبار هو انخفاض الإنتاجية، وذلك جزئيا بسبب الحصول على الصور وتحليل البيانات وشاقة. معا، تساهم هذه القيود لها لقبول منخفض نسبيا في الدراسات على نطاق واسع. من خلال دمج تقنيات ومبادئ الهندسة، وCometChip يجلب حلا لمشاكل إنتاجية والتناقضات التي ترتبط مع المذنب الفحص التقليدي 6،7. لفترة وجيزة، لإنشاء رقاقة، وmicrofabricated قالب باستخدام ضوئيه لخلق microposts بأقطار صغيرة مثل التي من خلية واحدة. ثم يتم استخدام القالب للقضاء على الاغاروز المنصهر، مما أدى إلى مجموعة من microwells بعد يتصلب هلام. ويجري حاليا وضع رقائق لتوفير الباحثين مع الآبار متغير الحجم لتتوافق مع أنواع مختلفة من الخلايا. لتحميل رقاقة، ويسمح للخلايا في وسائل الإعلام لتسوية في الآبار عن طريق الجاذبية. يتم غسلها الخلايا الزائدة بعيدا. خلايا المحاصرين ثم يتم تغليف لناجي طبقة رقيقة من نقطة انصهار منخفضة الاغاروز، ومن ثم فرضت في قعر 96 لوحة جيدا على سطح هلام لخلق 96 macrowells، ولكل منها مئات microwells على سطحه السفلي. يصف هذا البروتوكول والإجراءات العامة لإجراء التجارب مع هذه الشريحة، والتي تشمل إعداد هلام، تحميل خلية، الجرعات وإصلاح، تحلل الخلية، الكهربي، والتصوير الفلورسنت. نحن لشرح مثالين من التجارب الاستجابة للجرعة مع الخلايا lymphoblast يتعرض كلاء ضررا الحمض النووي المعروف، وذلك باستخدام قلوية والإصدارات محايدة للمقايسة على التوالي. وتظهر تجربتين إصلاح أيضا لوصف كيف يمكن تقييم استجابة إصلاح بعد التعرض باستخدام نظام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

في هذا المثال الأول، نحن تصف النهج لقياس المستويات الأولية من الحمض النووي من التلف في الخلايا lymphoblastoid الإنسان بعد التعرض لأضرار الأكسدة باستخدام H 2 O 2. من أجل تقييم H 2 O 2 يسببها الآفات قاعدة وفواصل حبلا واحدة، وتستخدم الظروف المذنب قلوية. بعد تحميل كاملة وتم تغليف الخلايا مع تراكب الاغاروز، يتم الضغط قعر لوحة 96 جيدا على سطح لخلق 96 المقصورات على الرقاقة. كل من الآبار 96 يمكن مداوي مع نوع مختلف أو تركيز المواد الكيميائية. هنا استخدمت أربع جرعات مختلفة من H 2 O 2، وكان يستخدم برنامج تلفزيوني 1X وسيطرة سلبية. وتظهر الصور التمثيلية المذنبات المحتشدة في الشكل 1A، حيث غير المعالجة (أعلى)، 50 ميكرومتر (وسط) و 100 ميكرومتر (القاع) H 2 O 2 أظهرت عينات -exposed مستويات مختلفة من ذيول المذنبات. تحليل الصور المذنب يمكن ادائهاميد باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا، التي تقيس مستويات الضرر عموما على أساس كثافة مضان والهجرة المسافة الإجمالية لكل ذيل المذنب. يتم إجراء قياسات عادة على 50 إلى 100 ​​المذنبات في حالة والقيمة المتوسطة (إما DNA٪ الذيل أو طول الذيل) يتم احتساب. يوضح الشكل 1B منحنى استجابة DNA نسبة ذيل تحليلها من TK6 المذنبات الخلايا lymphoblastoid تتعرض لأربعة تركيزات مختلفة من H 2 O 2. الاتساق بين تجارب مستقلة يدل على فعالية هذا النهج في تقييم الحمض النووي ردا الضرر من مستويات مختلفة من العلاجات الكيميائية في الخلايا. لمعرفة المزيد عن التباين بين العينات (على سبيل المثال، بين macrowells) وبين من يكرر نفس التجربة، وقد تآمر بين العينة والتباين بين التجريبي في الشكل 2A و 2B على التوالي. في كل تجربة، كل بئر للث 96الذراع رقاقة يعادل عينة مختلفة، وبالتالي الاختلاف جيد إلى جيد يكشف التباين بين عينة من الجهاز. هنا، تم علاج الخلايا TK6 تحميلها في 12 بئرا من 96 رقاقة جيدا مع نفس الجرعة من H 2 O 2 و lysed مباشرة بعد العلاج. تم تنفيذ جميع الخطوات تجريبية أخرى بالتوازي وتم رسم الوساطات لا تقل عن 50 المذنبات من كل macrowell في الشكل 2A. متوسط ​​الوساطات هو 77.53٪ DNA في الذيل، مع الانحراف المعياري هو 3.99٪. من هذه البيانات، نحسب أن معامل التباين بين العينات 5.2٪، وهو أقل عدة أضعاف من الفحص التقليدي، مما يدل على متانة محسنة لهذا الاختبار 6،16. لمعرفة المزيد عن استنساخ للمقايسة، فإننا تتعرض خلايا TK6 في رقاقة مع 75 ميكرومتر H 2 O 2 وتحليل مستوى فوري الحمض النووي من التلف. وتكررت هذه التجربة تم رسم ست مرات والبيانات من كل تجربة في Figure 2B. تحت ظروف تجريبية متطابقة، حصلنا على نتائج تتراوح بين 41.76٪ إلى 57.87٪، كما هو موضح القضبان الرمادية في الشكل. متوسط ​​ستة يكرر هو 49.57٪، مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​من 2.04٪ فقط. الاختلاف بين منخفض يعني أن يكرر الفحص المذنب أجريت على هذا الجهاز الجديد هو تكرار للغاية. لتقييم حركية إصلاح، ويسمح للخلايا لإصلاح الحمض النووي في وسائل الإعلام الجديدة بعد العلاج. Lysing macrowells في نقاط زمنية مختلفة يكشف عن تغيير في الحمض النووي من التلف مع مرور الوقت. ويرد مثال في الشكل 3. في هذه التجربة، تم تغليف الخلايا TK6 لأول مرة في رقاقة، وتعامل مع 50 ميكرومتر H 2 O 2، وسمح لإصلاح ما يصل إلى 60 دقيقة بعد التعرض. هي lysed خلايا في 0، 20، 45 و 60 دقيقة على التوالي. وتظهر الصور المذنب ممثلة في نقاط زمنية مختلفة في الشكل 3A، ويتم رسم التغير في مستويات الحمض النووي من التلف مع مرور الوقت في الشكل3B. وكشفت هذه البيانات التي يتم إصلاحها ما يقرب من جميع الأضرار خلال 45 دقيقة آخر H 2 O 2 العلاج. يمكن أن العديد من المتغيرات تؤثر على معدل إصلاح، بما في ذلك نوع من خط الخلية والعوامل الكيميائية المستخدمة. وبالتالي يمكن للباحثين إجراء تعديلات على البروتوكول (أي تمديد وقت الإصلاح) لتلبية احتياجات إضافية في تحقيقاتها. هنا نقدم مثالا آخر على تجربة إصلاح باستخدام هذه الشريحة، حيث يتم الطعن خلايا TK6 مع وكيل سام للجينات مختلفة N -Methyl- N &#39;-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) وكيلا مؤلكل المعروف للحث على الآفات قاعدة بينهم 7-methylguanine و3 methyladenine. يتم تحويل هذه الآفات إلى مواقع abasic إما عن طريق نزع البورينات عفوية أو عن طريق إزالة الأنزيمية التي glycosylases DNA. يمكن المشقوق الموقع abasic الناتج تحت ظروف قلوية وبالتالي الكشف على الرقاقة. يسبب التعرض الأولي زيادة كبيرة في الضرر، واضحة من فترة طويلةذيول، وبمرور الوقت يتم تخفيض هذه الذيول واستعادة الخلايا DNA سليمة خلال إصلاح. على الرغم من الألكلة والضرر التأكسدي على حد سواء إصلاحه في المقام الأول إصلاح قاعدة الختان المسار، ومقدار الآفات ولدت والبروتينات المشاركة في إصلاح تختلف. هذه الاختلافات يمكن أن تؤدي إلى معدلات مختلفة من التحول إلى مواقع abasic، وكذلك أسعار مختلفة ترميم المواقع abasic الناتجة عن ذلك. في الشكل 4، حركية إصلاح الخلايا TK6 تتعرض ل0.1، 1، وتظهر 3 ميكروغرام / مل من MNNG. في هذه التجربة، ونحن مدد الوقت لتجربة 2 ساعة بعد التعرض لضرر MNNG التي يسببها يبدو أن تستمر لفترة أطول ويتم مسح بمعدل أبطأ بالمقارنة مع H 2 O 2 يسببها الضرر. تحليل DSBs باستخدام الظروف المحايدة هي مشابهة جدا لبروتوكول لتحليل الآفات واحدة حبلا باستخدام الظروف القلوية. لإظهار مستويات الضرر الأولية، تعرضت خلايا TK6 إلى مستويات متفاوتة من البنت،<html> والخلايا الناتجة هي lysed وelectrophoresed في درجة الحموضة محايد (الشكل 5A). ومن الجدير بالذكر أن مورفولوجية ذيول المذنب يختلف عن الظروف فحص قلوية. لتحقيق DNA مجزأ يمكن ملاحظتها باستخدام هذا الاختبار، جرعة الأشعة تحت الحمراء المستخدمة هي أعلى بكثير (0-100 غراي) من الجرعة المطلوبة لنرى الضرر باستخدام الظروف القلوية. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن طول الذيل المعلمة الأكثر حساسية في التعبير عن مدى الضرر DNA عند استخدام الفحص المذنب محايد 7. ويتضح منحنى الاستجابة للجرعة التي تم تحليلها في الشكل 5B. يمكن أيضا إصلاح الحمض النووي فواصل حبلا مزدوجة في الخلايا يتم تقييم، ولقد ثبت من خلال Weingeist آخرون. ال 7. أخذت معا، وCometChip محايدة تقدم أداة قيمة لتحليل إنتاجية عالية من الحمض النووي DSBs. 1highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; الشكل 1. H 2 O 2 جرعة استجابة الخلايا TK6 باستخدام القلوية المذنب مقايسة. (A) المذنبات microwell العريض من دون علاج الابيضاض اللمفاوي TK6 (أعلى) والخلايا TK6 تتعرض ل50 ميكرومتر (وسط) و 100 ميكرومتر (القاع) H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. شريط النطاق هو 100 ميكرون. (B) H 2 O 2 الاستجابة للجرعة الخلايا TK6 تتعرض لمستوى مختلف من H 2 O 2. كل نقطة البيانات هي متوسط ​​ثلاث تجارب مستقلة، حيث تم الحصول على الحمض النووي متوسط ​​نسبة ذيل لا يقل عن 50 المذنبات الفردية في كل تجربة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​من ثلاث تجارب مستقلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. المشترك بين العينة التجريبية وبين التغير. (A) تباين عينة إلى عينة. تم تحميلها TK6 خلايا lymphoblast الإنسان في 12 بئرا من الشريحة 96 جيدا. تعرضت كل بئر إلى 100 ​​ميكرولتر من 50 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. الخلايا هي lysed فورا ويعاير لDNA٪ الذيل. وأظهرت بيانات من كل بئر هنا. يمثل كل مربع متوسط ​​لا يقل عن 50 المذنبات الفردية من كل بئر. يعني من 12 بئرا هو 77.53٪، الانحراف المعياري هو 3.99٪، ويتم حساب معامل الاختلاف لتكون 5.2٪. (B) تجربة إلى تجربة الاختلاف. تم تحميل TK6 خلايا lymphoblast الإنسان في 96 رقاقة جيدا، ويتعرضون ل100 ميكرولتر من 75 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. الخلايا هي lysed فورا ويعاير لDNA٪ الذيل.وتكررت التجربة نفسها 6 مرات ويتم عرض البيانات من كل تكرار كشريط الرمادي. يمثل كل مربع ومتوسط ​​DNA٪ ذيل المذنبات لا يقل عن 100 فرد من كل تكرار. متوسط ​​6 تكرارات هو 49.57٪، كما هو موضح في شريط هنا مرة أخرى. الانحراف المعياري 6 تكرارات هو 4.99٪، ويتم احتساب الخطأ المعياري للمتوسط ​​لتكون 2.04٪، ممثلة شريط خطأ في الشكل. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. إصلاح H 2 O 2 يسببها الضرر في الابيضاض اللمفاوي TK6. (A) تخطيطي لدراسة إصلاح مع المذنبات التمثيلية. يتم التعامل مع خلايا TK6 مع وكلاء ضررا والسماح للإصلاح في وسائل الإعلام في 37 ° C قبل تحلل. (B) حركية إصلاح خلايا TK6 بعد العلاج مع 50 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 20 دقيقة على 4 &amp; #176؛ C. كل نقطة البيانات هي متوسط ​​ثلاث تجارب مستقلة، حيث تم الحصول على الحمض النووي متوسط ​​نسبة ذيل لا يقل عن 50 المذنبات الفردية في كل تجربة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​من تكرار التجارب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. إصلاح الأضرار التي يسببها MNNG في الابيضاض اللمفاوي TK6. يتم التعامل مع خلايا TK6 0.1، 1، و 3 ميكروغرام / مل MNNG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وسمحت لإصلاح في وسائل الإعلام عند 37 درجة مئوية تصل إلى 120 دقيقة آخر التعرض. تم الحصول على الحمض النووي متوسط ​​نسبة ذيل لا يقل عن 50 المذنبات الفردية لكل من ثلاث تجارب مستقلة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياريللمتوسط ​​من ثلاث تجارب مستقلة. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> الرقم 5. الاستجابة للجرعة الأشعة تحت الحمراء من خلايا TK6 باستخدام مقايسة المذنب محايد. (A) العريض المذنبات microwell من الابيضاض اللمفاوي غير المعالجة TK6 (أعلى) والخلايا TK6 تتعرض ل40 ​​غراي (وسط) و 80 غراي (القاع) أشعة جاما. شريط النطاق هو 100 ميكرون. (B) IR الاستجابة للجرعة الخلايا TK6 تتعرض لمستوى مختلف من أشعة جاما. كل نقطة بيانات تمثل متوسط ​​طول الذيل (ميكرومتر) لا يقل عن 300 المذنبات مجمعة من ستة macrowells على الرقاقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells at JoVE.com

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

وصفنا هنا منصة تسمح الكشف مقايسة المذنب الحمض النووي من التلف مع سرعة غير مسبوقة. أنماط جهاز خلايا الثدييات في ميكروأري وتمكن المعالجة المتوازية من 96 عينات. النهج يسهل تحليل الحمض النووي من التلف مستوى القاعدة، التي يسببها التعرض للضرر وإصلاح الحمض النووي DNA حركية.

CometChip: إنتاجية عالية منصة 96-حسنا لقياس الحمض النووي من التلف في خلايا الإنسان Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K Views.  Massachusetts Institute of Technology.  وصفنا هنا منصة تسمح الكشف مقايسة المذنب الحمض النووي من التلف مع سرعة غير مسبوقة. أنماط جهاز خلايا الثدييات في ميكروأري وتمكن المعالجة المتوازية من 96 عينات. النهج يسهل تحليل الحمض النووي من التلف مستوى القاعدة، التي يسببها التعرض للضرر وإ?...

Video: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

ارتفاع الإنتاجية الخميرة سلالة Phenotyping مع تسلسل الحمض النووي الريبي القائم على دروبليت

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

تطوير أنسجة القلب البشرية المنظمة ثلاثية الأبعاد ضمن منصة ميكروفلويديك

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...