עבודה זו תומכת בעיקר על ידי 5-UO1-ES016045 עם תמיכה חלקית מ1-R21-ES019498 וR44-ES021116. DMW נתמכה על ידי הדרכת גרנט NIEHS בסביבת טוקסיקולוגיה T32-ES007020. ציוד סופק על ידי המרכז לבריאות הסביבה המדעים P30-ES002109.

.1 הכנת צ&#39;יפ <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל שבב מהחבילה והמקום לצד סרט אחד היטב צלחת מלבנית, ג&#39;ל למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ג&#39;ל ב25 מ&quot;ל 1x PBS במשך 15 דקות, לחזור על שתי פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל להגדיר על צלחת זכוכית וכיוון תווית של ג&#39;ל בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעדינות על צלחת 96 היטב ללא תחתית הפוכה על ג&#39;ל; לוודא שכל הבארות של הצלחת גם ללא תחתית נמצאות בשטח של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1.5 &#39;קליפים קלסר&#39; בכל צד של הצלחת כדי להבטיח הידוק עם הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את PBS העודף חיץ בכל טוב. </li></ol> 2 תאים טוען <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות תא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורות תאי השעיה, לדלל השעיה תא בתקשורת כדי להשיג ריכוז סופי של 10 5 -10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורות תאים חסיד, בצע את מתנתק / פרוטוקולי trypsinization נורמלים ודilute תאים מנותקים בתקשורת לריכוז סופי של 10 5 -10 6 תאים / מ&quot;ל. אם תאים לצבור, עובר השעיה תא במסנן תא לקבל השעיה תא בודדת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של השעיה תא 100 μl היטב בכל הצלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת כיסוי עם סרט ג&#39;ל על מנת למנוע אידוי של תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים לטעון לפחות 30 דקות ב37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שבב מתקשורת חממה ולשאוב מכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מהדקים ו96 גם צלחת תחתית; להחזיק את השבב עם צלחת הזכוכית בזווית ובעדינות לשטוף עם PBS 1x כדי להסיר תאים עודפים על agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק טעינת תא באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם עדשה אובייקטיבית 4X. אם טעינה מספיקה הוא ציין, לחזור מצעד 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שבב הועמס על אף פני השטח (ספסל מעבדה). שבב שכבה עם 1% agarose נמוך נקודת התכה (LMP) שהוא מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס. השתמש כ 2̵1; 3 מ&quot;ל של agarose LMP נחוץ לכל שבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כיסוי לביסוס ראשון ב RT במשך 3 דקות ולאחר מכן לעבור ל4 מקרר מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לgelation מלאה. </li></ol> .3 מינון ותיקון הערה: כדי ללמוד ברמת נזק לדנ&quot;א בסיסית, דלג לשלב 4. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות ליישר את הבארות של השבב (שנוצר מההידוק קודם) עם הבארות של צלחת 96, גם ללא תחתית חדשה. Re-עיתונות 96 גם הצלחת תחתית בהידוק עליון ומאובטח עם קליפים קלסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של כימי של מינון רצוי 100 μl היטב בכל הצלחת 96 היטב; לבצע מינון / טיפול בקרח או במקרר 4 ° C לכמות רצויה של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מינון, כימיקלים לשאוב מכל טוב ולשטוף משם כימי שיורית באמצעות 1x PBS. אם נזק ישיר הוא למד כאן, המשך לשלב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללמוד קינטיקה תיקון, לאפשר לתאים בשבב לתקן בתקשורת ב37 C °. Lyse (המשך לשלב 4) בנקודות זמן ספציפיות. הערה: תיקון יכול להתבצע על שבב עם 96 גם צלחת תחתית המצורפת, או השבב ניתן לחתוך לחתיכות נפרדות לאחר הסרת צלחת 96 היטב ללא תחתית. </li></ol> .4 תמוגה <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע assay שביט אלקליין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את העבודה מאגר תמוגה אלקליין על ידי הוספת 1% Triton X-100 אלקליין פתרון מניות תמוגה (2.5 M NaCl, 100 מ&quot;מ Na 2 EDTA, 10 מ&quot;מ טריס, pH 10). הכן כ 25 מ&quot;ל של עבודה חיץ תמוגה לכל שבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת עובדת מאגר תמוגה אלקליין על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול שבב במאגר תמוגה מגניב עובד בסיסי ולאפשר תמוגה לבצע O / N במקרר 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע assay שביט ניטראלי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את העבודה מאגר תמוגה ניטראלית על ידי הוספת 1% Triton X-100 ו10% DMSO לפתרון מניות תמוגה ניטראלי (2.5 M NaCl, 100 מ&quot;מ Na 2 EDTA, 10מ&quot;מ טריס, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). הכן כ 25 מ&quot;ל עובד מאגר תמוגה לכל שבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם עובד מאגר תמוגה ניטראלי ב43 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול שבב במאגר תמוגה חם עובד ניטראלי ולאפשר תמוגה לבצע O / N ב43 ° C חממה. </li></ol></li></ol> .5 אלקטרופורזה <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע assay שביט אלקליין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מאגר תמוגה ובמהירות לשטוף שבב עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבב מאובטח בתא אלקטרופורזה עם צד סרט ג&#39;ל פונה כלפי מטה באמצעות קלטת דו צדדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את החדר לחדר קר 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את התא עם חיץ אלקליין הקר אלקטרופורזה (0.3 M NaOH, 1 מ&quot;מ Na 2 EDTA) לרמה שפשוט מכסה את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר להתרה בסיסית ל40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל אלקטרופורזה ב1 V / cm ו300 mA ל30 דקות בחדר הקר. כוון את עוצמת הקול של חיץ אלקטרופורזה בצ&#39;הmber להשיג רצוי נוכחי פועל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע assay שביט ניטראלי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מאגר תמוגה ולשטוף שבב עם חיץ אלקטרופורזה הניטרלית (2 מ&quot;מ Na 2 EDTA, 90 מ&quot;מ טריס, חומצה בור 90 מ&quot;מ, pH 8.5) עבור 2 x 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבב מאובטח בתא אלקטרופורזה עם צד סרט ג&#39;ל פונה כלפי מטה באמצעות קלטת דו צדדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את החדר לחדר קר 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את התא עם חיץ אלקטרופורזה ניטראלי קר (2 מ&quot;מ Na 2 EDTA, 90 מ&quot;מ טריס, חומצה בור 90 מ&quot;מ, pH 8.5) לרמה שפשוט מכסה את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר ג&#39;ל לשבת בחדר קר ל60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל אלקטרופורזה ב0.6 V / cm ו -6 mA ל60 דקות בחדר הקר. כוון את עוצמת הקול של חיץ אלקטרופורזה בתא כדי להשיג נוכחי ריצה רצויה. </li></ol></li></ol> .6 הדמיה פלורסנט <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שבב מתא אלקטרופורזה מcolחדר ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את ג&#39;לי במאגר נטרול (0.4 M טריס, pH 7.5) עבור 2 x 15 דקות במקרר 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השבב עם כתם DNA ניאון של בחירה (כלומר, זהב SYBR, Ethidium ברומיד) תחת מפעל מומלץ נהלים. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> ניתוח .7 הנתונים לנתח תמונות כוכב שביט על ידי תוכנת assay שביט סטנדרטית כגון קומט 5.5.

<ol>
	<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles,+Applications,+and+Limitations.">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li><li>Olive, P. L., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+and+DNA+damage+analysis+using+microwell+arrays.">Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).</li><li>Weingeist, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+enables+high-throughput+evaluation+of+DNA+double-strand+breaks+and+DNA+repair+inhibitors.">Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.</a> Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).</li><li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+comet+assay:+use+and+status+in+genotoxicity+testing.">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li><li>Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+toxicity+assessment:+employing+the+best+science+for+human+safety+evaluation+part+III:+the+comet+assay+as+an+alternative+to+in+vitro+clastogenicity+tests+for+early+drug+candidate+selection.">Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection.</a> Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>M&#248;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+of+environmental+agents+assessed+by+the+alkaline+comet+assay.">Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay.</a> Basic &amp; clinical pharmacology &amp; toxicology. 96, 1-42 (2005).</li><li>Dusinska, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+in+human+biomonitoring:+gene-environment+interactions.">The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions.</a> Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+the+comet+assay+in+the+clinical+management+of+cancer.">Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer.</a> Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+generated+damage+to+the+guanine+moiety+of+DNA:+mechanistic+aspects+and+formation+in+cells.">Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells.</a> Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).</li><li>Forchhammer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+measurement+of+DNA+damage+by+comet+assay+measured+by+the+ECVAG&#8224;+inter-laboratory+validation+trial.">Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG&#8224; inter-laboratory validation trial.</a> Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).</li><li>Olive, P. L., Wlodek, D., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis.">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li><li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA.">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li><li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+(comet+assay).">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , (2010).</li><li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay.">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li><li>Collins, A. R., Dusinsk&#225;, M., Horsk&#225;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alkylation+damage+in+human+lymphocyte+DNA+with+the+comet+assay.">Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay.</a> Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).</li><li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic.">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li><li>Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations.">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li><li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population.">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li></ol>

The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

genotoxins בכל מקום בסביבה וגם בתוך תאים אנושיים מפעיל עומס ונזק לדנ&quot;א הסלולרי בלתי נמנעים. למעשה, ההערכה היא שיש 1000 של נגעי DNA קיימים בתאי אדם במצב יציב 18. הבנת רגישות נזק וקינטיקה תיקון בבני אדם לא רק מביאה תובנה למחקר בסיסי, אבל גם יתרונות לפיתוח תרופות. באופן אירוני, למרות היכולת של נזק לדנ&quot;א כדי לקדם את הסרטן, סוכנים מזיקים DNA משמשים ברמות גבוהות מאוד לטיפול בסרטן, מה שהופך את הידע על נזק לדנ&quot;א ותיקון רלוונטי לרפואה מותאמת אישית. CometChip הוא מכשיר מחקר חדשני שמנצל שיטות microfabrication לחולל מהפכה assay נזק לדנ&quot;א ארוך היה קיים. בנייה על אותם העקרונות של assay השביט המסורתי, השבב מספק תפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי ושחזור טוב יותר. אנו מתארים כאן שיטות לשימוש בשבב הזה. כדי להבהיר את השירות ואת החוסן שלה, אנו מציגים תוצאות הלוך ושובמ &#39;מספר ניסויים שבהם השבב נעשה שימוש כדי להעריך נזק הנגרם על ידי מספר סוכנים המזיקים DNA שונה, ובו נעשה שימוש כדי להעריך תיקון DNA. יחד, תוצאות שהוצגו כאן מספקות מידע מועיל לשימוש בשבב ולהפגין התחולה הרחבה שלה למחקר על נזק לדנ&quot;א ותיקון. אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הוא להשיג טעינת תא יעילה. שורות תאים רבות נבדקו במערכת זו, ובכלל זה גם השעיה ותאים חסיד. טעינת יעילות תלויה במשתנים רבים כגון סוג תא, גודל תא, ריכוז טעינה וזמן. שורות תאי השעיה כגון תאי lymphoblastoid הם הקלים ביותר לעבוד איתו. ריכוז של ההשעיה התא יכול להשתנות מאוקטובר 4 - אוקטובר 6 תאים לכל 96 היטב וטעינה בדרך כלל משלימה ב15-30 דקות. צפיפות תאים גבוהה יותר מאפשרת טעינה ומקצרת את משך הזמן הנדרש לתאים להתיישב לתוך microwells. פרמטרים טוען לתאים חסיד יכולים להיות שונים מתאי השעיה. שורות תאים כגון סינית אוגרים השחלות (CHO) תאים, נמצאו כבעלי יעילות טעינה דומה לתאי השעיה (trypsinization הבא) ובכך להשתמש בתנאי טעינה דומים. סוגי תאים אחרים, כגון תאים סרטניים בקלות ליצור אגרגטים תא בהשעיה, דורשים טיפול נוסף. עובר השעיות תא דרך מסנן תא בודד והוספת טריפסין לתקשורת ההשעיה יכולה לדכא ההיווצרות של צבירי תאים במהלך טעינה. לבסוף, במונחים של זמן טעינה, הזמן הנדרש עבור לכידת שורות תאים חסיד בmicrowells יכול להשתנות מ20 דקות לשעה 1. כתוצאה מכך, מומלץ שמשתמשים לבצע ניסויי פיילוט כדי לקבוע תנאי טעינה אופטימליים לפני שתמשיך לחקירות נוספות. יעילות טוען יכולה להיות דמיין תחת מיקרוסקופ שדה בהיר או באופן מדויק יותר מתגלה על ידי צביעת התאים במארז עם DAPI או DNA האחרכתמים קודם להערכה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אחד יתרונות עיקריים של שיטה זו ושבב הוא צדדיות. ראשית, חוקרים אינם מוגבלים לריכוז תא עבודה ספציפי, כי תאים עודפים נשטפים, וmicroarray מבטיח שביט בצפיפות אחידה. שנית, microwells יכול להתבצע עם גדלים משתנים כדי להתאים סוגי תאים בגדלים שונים. בנסיבות שתאים מרובים נלכדים בmicrowell בודד, שביטים רב תא הם תוצאות מכוילות עצמיים ותשואה עקבית בהשוואה לשביטי תא בודדים 6,7. יתרון נוסף תיבנות תאים בmicroarray הוא שכל השביטים הם אז באותו מישור המוקד עם עמדות קבועות, הפחתת רעש בשל שביטים לא ממוקדים ולהקל הדמיה וניתוח אוטומטיים. השיפורים המשמעותיים בתפוקה וברגישות הניתנים על ידי CometChip לאפשר היישום של assay ללימודים בקנה מידה גדולים. יחדיו, השבב מספקכלי רב ערך sa להערכת נזק לדנ&quot;א לחוקרים, toxicologists, קלינאים ואפידמיולוגים. בעוד assay השביט ידוע ברגישות שלה מעולה באיתור מגוון רחב של נזק לדנ&quot;א, assay זה גם סובל מסגולי נמוך. שימוש בפרוטוקול זה משפר באופן משמעותי את שחזור ואת התפוקה של assay, אך לא להפגין התקדמות בסגולית. יחד עם זאת, ריבוב assay עם מתודולוגיות אחרות דווח כיעיל בהשגה סגוליות גבוהה יותר. דוגמא אחת היא ההכללה של אנזימי נגע ספציפי מטוהרים. אנזימים אלה יכולים להמיר נגעי בסיס אחר לגילוי להפסקות גדיל לזיהוי ואתרי abasic 1,19-21. דוגמא נפוצה היא glycosylase endonuclease תיקון formamidopyrimidine-DNA (FPG), אשר חושף שינויי DNA חמצוני 19,22. כי צעד עיכול האנזים מיושם לאחר תמוגה תא, המערכת יכולה להיות מטופלים באותה הדרךשקופית sa מסורתית agarose ללא שינויים לפרוטוקול. אף על פי הפרוטוקול מפורט אינו מתואר כאן, גישה זו הותאמה על ידי משתמשים רבים assay שביט מסורתיים בעבר וניתן למצוא את הפרוטוקולים בקלות. בפרסום קודם, שהשתמשנו בשיטה זו כדי לזהות נזק הנגרם על ידי אור ניאון 22. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא התפוקה שהוא מספק, אשר פותחת דלתות למחקרים שהיו בעבר כמעט בלתי אפשריים. היכולת לעבד 96 דגימות על אותה הפלטפורמה לא רק מפחיתה עבודה וזמן, אלא גם מפחיתה את הרעשים ניסיוניים ומשפרת באופן משמעותי שחזור. הווריאציה מדגם Inter היא נמוכה יותר באופן משמעותי מהווריאציה המסורתית שקופית לשקופית, אשר יכול להיות גבוהה יותר 2 לקפל מאשר הווריאציה נצפתה עם השבב הזה 6,7. רעש מופחת גם מוביל לרגישות משופרת, המאפשר זיהוי של הבדלים דקים יותר בין דגימות. הכיוון שהמכשיר מעסיק standard פורמט 96 היטב, זה תואם עם ציוד מחקר כללי וHTS טכנולוגיות. קחו למשל מחקר שדורש הערכה של 100 דגימות, בהנחה שחוקר ממוצע יכול לעבד ~ 30 שקופיות זכוכית במהלך כמה ימים. בהתחשב בכך שכל דגימה צריכה להתבצע בשלושה עותקים, זה ייקח כחודש כדי להשלים את מחקר כזה, שגם סובל באופן בלתי נמנע ממדגם לדגום וריאציה. בניגוד לכך, 100 תנאי עיבוד, כל אחד בשלושה עותקים, עם שבב זה דורש רק כמה צלחות וניתן לבצעו בשלושה ימים. שיפור משמעותי זה בתפוקה פותח את הדלת למחקרים שהיו בלתי ניתנים להשגה בעבר. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את שני נהלים הבסיסיים לביצוע assay השביט הסטנדרטי וצעדים שונה הנדרשים להשתמש בפלטפורמת CometChip. עם היכולת למדוד את שני רמות נזק לדנ&quot;א טבועים ותגובה לתיקון שלאחר מכן, assay הוא רלוונטי ביותר למגוון רחב של יישומים ביולוגיים וקליניים. מידע על ההשפעה של חשיפה לחומרים כימיים מסוימות בגנום מאפשר מניעת מחלות וטיפול. יתר על כן, יש גם עניין משמעותי בקביעת שינויים ברגישות נזק לדנ&quot;א ויכולת תיקון בקרב אנשים 23,24. טכניקה זו מספקת את התפוקה הנדרשת ללימודים בקנה מידה גדולה כזה. ידע על וריאציות בין פרט הוא קריטי לזיהוי אנשים רגישים ולעיצוב טיפולים אישיים או אסטרטגיות סיכולים. יחדיו, הטכנולוגיה שהוצגה כאן מספקת תפוקה גבוהה, פלטפורמת ניתוח נזק לדנ&quot;א אובייקטיבית וכמותי שיש לו את הפוטנציאל להפוך למתודולוגיה סטנדרטית בעתיד קרוב.

ג&#39;ל אלקטרופורזה תא הבודד assay (SCGE) (aka assay השביט) היא טכניקה המשמשת באופן נרחב לכימות של קשת רחבה של נגעי DNA, כוללים נגעי בסיס, אתרי abasic, הפסקות גדיל בודדות, הפסקות כפולות גדיל, crosslinks ואלקלי רגיש אתרים. העיקרון הבסיסי של assay הוא שDNA שניזוק נודד בקלות רבה יותר מאשר DNA ניזוק בשל התנפצות ואובדן מבנה superhelical. הגירת המידה פרופורציונלית לכמות של נזק לדנ&quot;א, ויכולה להיות דמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכידת תמונה וניתוח פרופיל עוצמה של DNA בצורת כוכב שביט הבודד לאחר מכן לספק מדידות פרמטר כגון אורך זנב, רגע זנב, וDNA% בזנב כדי לחשוף את הרמה של נזק לדנ&quot;א בתאים 1-4. כרגע יש שתי גרסאות נפוצות של assay השביט:) assay שביט אלקליין ו ב) assay שביט ניטראלי. Assay שביט אלקליין הוא נרחב ביותרגרסה משומשת, אשר עושה שימוש במאגר pH גבוה להירגע DNA לפני אלקטרופורזה וכך מזהה את כל הסוגים של הפסקות גדיל ואתרי אלקלי רגישים. Assay השביט הניטרלי, לעומת זאת, הוא פחות מיומן משום שהיא משתמשת חיץ ניטראלי כדי לשמור על הסלילים כפולים ולזהות הפסקות גדיל כפולות בלבד 2,5. עבור כימי וסוכנים פיזיים שגורמים לDSBs, SSBs נוצרים בקונצרט, ונוצרים ברמות גבוהות הרבה יותר (למשל SSBs, הנגרם על ידי γIR הם בסדר גודל נפוץ יותר מDSBs). עבור רוב החשיפות מזיקות DNA, DSBs הם הרבה פחות נפוצה מאשר סוגים אחרים של נזק לדנ&quot;א, ולכן הם קשים יותר לאתר. אנחנו הוכחנו בפרסומים קודמים חלון זיהוי של שני הגרסאות. 6,7 למרות assay השביט כבר משמש באופן שגרתי למחקר בסיסי על נזק לדנ&quot;א ובדיקת התיקון וgenotoxicity 1,2,8-15, assay כבר דיווח על שחזור ירוד עקב מדגם-ל-מדגם, אדם אל האדם והשתנות מעבדה למעבדה. בנוסף, assay הוא תפוקה נמוכה, בין שאר משום שרכישת תמונה וניתוח הנתונים הם מייגע. יחד, מגבלות אלה תורמים לקבלתה הנמוכה יחסית במחקרים בקנה מידה גדולה. באמצעות שילוב של טכנולוגיות הנדסה ועקרונות, CometChip מביא פתרון לבעיות של תפוקה וחוסר עקביות הקשורים לassay השביט המסורתי 6,7. בקצרה, כדי ליצור את השבב, עובש microfabricated באמצעות photolithography ליצור microposts בקטרים ​​קטנים כמו זה של תא בודד. העובש משמש אז כדי להחתים על agarose המותך, וכתוצאה מכך מערך של microwells לאחר מתמצק ג&#39;ל. שבבים שמפתחת לחוקרים, בבארות משתנים בגודל תואם עם סוגי תאים שונים. כדי לטעון את השבב, תאים בתקשורת מותר להתיישב לתוך הבארות על ידי כוח הכבידה; תאים עודפים נשטפים. לאחר מכן תאים לכודים הכמוסיםing שכבה דקה של agarose נקודת התכה הנמוך, וצלחת גם ללא תחתית 96 לאחר מכן הידקה אל פני השטח ג&#39;ל ליצור 96 macrowells, כל אחד עם מאות microwells על המשטח התחתון שלה. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הכלליים לניסויים עם שבב זה, הכוללים הכנת ג&#39;ל, טעינה סלולארי, מינון ותיקון, תמוגה תא, אלקטרופורזה, ודימות פלואורסצנטי. אנו מדגימים שני דוגמאות לניסויי תגובת מנה עם תאי lymphoblast נחשפו סוכנים מזיקים DNA הידוע, באמצעות בסיסי וגרסאות ניטרליות של assay בהתאמה. שני ניסויי תיקון מוצגים גם לתאר איך תגובת תיקון לאחר חשיפה ניתן להעריך באמצעות מערכת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

בדוגמא ראשונה זו, אנו מתארים את הגישה לכימות רמות ראשוניות של נזק לדנ&quot;א בתאי lymphoblastoid אדם לאחר חשיפה לנזק חמצוני באמצעות H 2 O 2. על מנת להעריך 2 O 2 -induced נגעי בסיס H והפסקות גדיל בודדות, תנאי שביט אלקליין משמשים. לאחר הטעינה הושלמה ותאים כבר במארז עם שכבת agarose, 96 גם צלחת תחתית נלחץ על פני השטח כדי ליצור 96-תאים על השבב. כל אחד מ96-הבארות ניתן במינון עם סוג או ריכוז של כימיקלים שונים. הנה ארבעה מינונים שונים של H 2 O 2 שמשו ו1x PBS שימש כביקורת השלילית. נציג תמונות של כוכבי שביט ערוכים מוצגות באיור 1 א, שבו לא טופל (למעלה), 50 מיקרומטר (באמצע) ו100 מיקרומטר H (תחתון) 2 O 2 -exposed דגימות הפגינו רמות של זנבות שביט שונות. ניתוח של תמונות שביט ניתן perforתרופה באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי, אשר בדרך כלל מכמתת את רמות נזק המבוסס על מרחק עוצמת הקרינה והגירה הכולל של כל זנב שביט. מדידות מבוצעות בדרך כלל על 50 עד 100 שביטים למצב והערך החציוני (בין% DNA זנב או אורך זנב) מחושבת. איור 1 מדגימה את עקומת תגובת DNA זנב אחוז מנותחת משביטי תא lymphoblastoid TK6 נחשפו לארבעה ריכוזים שונים של H 2 O 2. העקביות בין ניסויים עצמאיים מדגימה את יעילותה של גישה זו בהערכת תגובת נזק לדנ&quot;א מרמות השונות של טיפולים כימיים בתאים. כדי ללמוד על הבדלים בין דגימות (למשל, בין macrowells) ובין חזרות של אותו הניסוי, בין מדגם ושונה בין ניסוי היה להתוות באיור 2 א ו -2 בהתאמה. בתוך כל ניסוי, גם כל 96-wשבב ell הוא שווה ערך למדגם שונה ומכאן הווריאציה להיטב היטב מגלה וריאציה בין המדגם של המכשיר. כאן, תאי TK6 נטענים ב12 בארות של שבב 96, גם טופלו במינון זהה של H 2 O 2 ו lysed מייד לאחר טיפול. כל הצעדים הניסיוניים האחרים בוצעו במקביל והחציונים של לפחות 50 שביטים מכל macrowell היו זממו באיור 2 א. ממוצע החציונים הוא DNA 77.53% בזנב, עם סטיית תקן היא 3.99%. מתוך נתונים אלה, אנו לחשב שמקדמים שונים בין דגימות הוא 5.2%, שהוא פי כמה וכמה נמוך מassay המסורתי, הממחיש את החוסן המשופר של assay זה 6,16. כדי ללמוד על שחזור של assay, אנו נחשפים תאי TK6 בשבב עם 75 מיקרומטר H 2 O 2 ולנתח את הרמה המיידית של נזק לדנ&quot;א. ניסוי זה חזר על עצמו שש פעמים ונתונים של כל ניסוי היו להתוות בFigure 2B. תחת תנאי ניסוי זהים, השגנו תוצאות הנעות בין 41.76% ל57.87%, כפי שמוצג פסים אפורים בדמות. הממוצע של שש חזרות הוא 49.57%, עם סטיית תקן של הממוצע רק 2.04%. הווריאציה הנמוכה בקרב חוזרים מרמזת כי assay השביט מבוצע במכשיר הרומן הזה הוא מאוד לשחזור. כדי להעריך קינטיקה תיקון, תאים מותרים כדי לתקן את הדנ&quot;א שלהם בתקשורת טרי לאחר טיפול. Lysing macrowells בנקודות זמן שונים חושף את השינוי בנזק לדנ&quot;א לאורך זמן. דוגמא מוצגת באיור 3. בניסוי זה, תאי TK6 היו ארוזים ראשון בשבב, שטופלו ב50 מיקרומטר H 2 O 2, ואפשרו לתקן עד 60 דקות לאחר חשיפה. תאים היו lysed ב 0, 20, 45 ו60 דקות בהתאמה. תמונות שביט נציג בנקודות זמן שונות מוצגות באיור 3 א, והשינוי ברמות הנזק לדנ&quot;א לאורך הזמן הוא להתוות בתרשים3B. הנתונים אלה עולים כי כמעט כל הנזק יתוקן בתוך ההודעה H 45 דקות 2 O 2 טיפול. משתנים רב יכולים להשפיע על השער של תיקון, כולל הסוג של שורת תאים וסוכן כימי המשמש. מכאן חוקרים יכולים לבצע שינויים בפרוטוקול (כלומר, הארכת תיקון זמן) כדי להתאים לצרכימים נוספים בחקירותיהם. כאן אנו מספקים הוא דוגמא נוספת לניסוי תיקון באמצעות שבב זה, שבו תאי TK6 מאותגרים עם סוכן genotoxic שונה N -Methyl- &#39;N -Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) סוכן אלקילציה הידוע כדי לגרום לנגעי בסיס כולל 7-methylguanine ו3-methyladenine. הם נגעים אלה יומרו לabasic אתרים או על ידי depurination הספונטני או על ידי ההסרה האנזימטית על ידי glycosylases DNA. אתר abasic וכתוצאה מכך ניתן ביקע בתנאים בסיסיים ובכך זוהה על השבב. חשיפה ראשונית גורמת לעלייה משמעותית בנזק, עולה מהארוךזנבות, ועם זמן זנבות אלה צומצמו התאים לשחזר DNA ללא פגע במהלך תיקון. למרות אלקילציה ונזק חמצוני שניהם תוקנו בעיקר על ידי מסלול תיקון כריתת בסיס, הסכום של נגעים שנוצרו והחלבונים מעורבים בתיקון להשתנות. וריאציות אלו יכולות להוביל לשיעורים שונים של המרה לabasic אתרים, כמו גם שיעורים שונים של תיקון של אתרי abasic וכתוצאה מכך. באיור 4, קינטיקה התיקון של תאי TK6 נחשפה ל0.1, 1, ו -3 מיקרוגרם / מ&quot;ל של MNNG מוצג. בניסוי זה, הרחבנו את זמן ניסוי שללאחר חשיפה 2 שעות, כי נזק הנגרם על ידי MNNG מופיע להתמיד זמן רב יותר ואינו מסומנת בקצב איטי יותר בהשוואה לH 2 O 2 -induced נזק. ניתוח של DSBs באמצעות תנאים ניטרליים דומה מאוד לפרוטוקול לניתוח של נגעים בודדים גדיל באמצעות התנאים בסיסיים. כדי להציג את רמות נזק ראשוניות, תאי TK6 נחשפו לרמות משתנה של Gir,<html> והתאים וכתוצאה מכך lysed וelectrophoresed בpH ניטראלי (איור 5A). ראוי לציין כי את המורפולוגיה של זנבות השביט היא שונה מתנאי assay אלקליין. כדי להשיג DNA המקוטע הנצפה באמצעות assay זה, מינון IR המשמש הוא גבוה באופן משמעותי (0-100 Gy) מאשר המינון הדרוש כדי לראות נזק באמצעות התנאים בסיסיים. בנוסף, מצאנו כי אורך הזנב הוא הפרמטר הכי רגיש הבמשקף את מידת הנזק לדנ&quot;א בעת שימוש assay השביט הניטרלי 7. עקומת תגובת המנה ניתחה מתוארת באיור 5 ב. תיקון של הפסקות גדיל כפול DNA בתאים גם ניתן להעריך, והוכח על ידי Weingeist et. אל. 7. יחדיו, CometChip הניטרלי מציע כלי רב ערך עבור ניתוח תפוקה גבוהה של DNA DSBs. &quot;Width =&quot; 1highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 1. H 2 O 2 במינון תגובה של תאי TK6 באמצעות assay שביט אלקליין. () שביטים microwell ערוכים מlymphoblasts שלא טופל TK6 (למעלה) ותאי TK6 נחשף ל50 מיקרומטר (באמצע) ו100 מיקרומטר H (התחתון) 2 O 2 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. H (B) 2 O 2 תגובת מינון של תאי TK6 נחשפו לרמה השונות של H 2 O 2. כל נקודת נתונים היא הממוצעת של שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבו DNA זנב אחוז החציוני של לפחות 50 שביטים בודדים הושג בכל ניסוי. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע משלושה ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. Inter-Sample והשתנות. וריאציה Inter-ניסויי () לדוגמא ל-Sample. תאי lymphoblast אנושיים TK6 הועמסו 12 בארות של שבב 96 היטב. כל טוב נחשף לשל H 50 מיקרומטר 100 μl 2 O 2 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. תא היה lysed באופן מיידי וassayed עבור DNA% זנב. הנתונים של כל אחד גם מוצגים כאן. כל אחת מהתיבות מייצגים את החציון לפחות 50 שביטים בודדים מכל טוב. הממוצע של 12 בארות הוא 77.53%, סטיית התקן היא 3.99%, ומקדם שונים מחושב להיות 5.2%. וריאציה (ב &#39;) ניסוי לניסוי. תאי lymphoblast אנושיים TK6 הועמסו שבב 96 היטב, חשופים ל75 מיקרומטר H 2 O 2 100 μl ל20 דקות ב 4 ° C. תא היה lysed באופן מיידי וassayed עבור DNA% זנב.אותו הניסוי חזר על עצמו 6 פעמים ונתונים של כל חוזר מוצגים כפס אפור. כל אחת מהתיבות מייצג את DNA% הזנב החציוני של לפחות 100 שביטים בודדים מכל חוזר. הממוצע של 6 חזרות הוא 49.57%, כפי שמוצג בגב בר כאן. סטיית התקן של 6 חזרות היא 4.99%, ושגיאת התקן של הממוצע מחושבת להיות 2.04%, מיוצגת כבר שגיאה בדמות. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. תיקון של H 2 O 2 נזק -induced בlymphoblasts TK6. () סכמטי של מחקר תיקון עם שביטים נציג. מטופלים תאי TK6 עם סוכנים מזיקים ואפשרו לתקן בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס לפני תמוגה. (ב) קינטיקה תיקון של תאי TK6 לאחר טיפול ב50 מיקרומטר H 2 O 2 ל20 דקות ב 4 &amp; #176; C. כל נקודת נתונים היא הממוצעת של שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבו DNA זנב אחוז החציוני של לפחות 50 שביטים בודדים הושג בכל ניסוי. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע מניסויים חוזרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. תיקון של נזק הנגרם על ידי MNNG בlymphoblasts TK6. מטופלים תאי TK6 עם 0.1, 1, ו -3 מיקרוגרם / מ&quot;ל MNNG ל30 דקות ב 4 ° C ואפשרו לתקן בתקשורת על 37 מעלות צלזיוס עד 120 הודעה דקות חשיפה. DNA זנב אחוז החציוני של לפחות 50 שביטים בודדים הושג עבור כל אחד משלושה ניסויים בלתי תלויים. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקןשל הממוצע משלושה ניסויים בלתי תלויים. <img alt="איור 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> איור 5. תגובת מינון IR של תאי TK6 באמצעות assay שביט ניטראלי. () ערוכות שביטים microwell מlymphoblasts שלא טופל TK6 (למעלה) ותאי TK6 נחשף ל40 Gy (באמצע) ו80 Gy (למטה) קרינת גמא. סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. תגובת מינון IR (B) של תאי TK6 נחשפו לרמה השונות של קרינת גמא. כל נקודת נתונים מייצגת את אורכו הממוצע זנב (מיקרומטר) של לפחות 300 שביטים ונקוו משש macrowells על השבב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells at JoVE.com

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ&quot;א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ&quot;א רמת בסיס, נזק לדנ&quot;א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K Views.  Massachusetts Institute of Technology.  אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA. 

Video: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...