في الجسم الحي التصوير تم تنفيذها باستخدام IVIS الموارد المشتركة في جامعة كولورادو مركز السرطان (بدعم من منحة P30-CA046934). تم تنفيذ التدفق الخلوي في التدفق الخلوي الموارد المشتركة، مركز جامعة كولورادو للسرطان (بدعم من منحة P30CA046934). وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (RO1CA137078 إلى DKG). ABLS هو زميل في برنامج التنمية للأطفال عالم، بدعم من المنح المقدمة من الأكاديمية الأميركية لطب الأطفال، وجمعية طب الأطفال الأمريكية، وكينيدي شرايفر المعهد الوطني يونيس لصحة الطفل والتنمية البشرية (K12-HD000850).

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics.+2010.">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+childhood+cancer.">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li><li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia:+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there?.">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?.</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li><li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult.">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li><li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias.">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li><li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43,+phosphatase+inhibition,+and+thiol+reactivity+as+model+systems.">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li><li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+anticancer+agents:+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li><li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts:+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission.">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).</li><li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions.">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li><li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro:+malignant+melanomas.">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li><li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development.">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li><li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia:+a+strategy+for+preclinical+modeling.">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li><li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم مثبطات التيروزين كيناز الرواية في علاج سرطان الدم الحاد. باستخدام هذا النهج، يتم تقييم الأنشطة البيوكيميائية ومكافحة سرطان الدم الأول في المقايسات خلية مقرها في المختبر ثم في نماذج طعم أجنبي في الجسم الحي. تم استخدام تحليل طخة مناعية بنجاح لإثبات تثبيط كيناز التيروزين الهدف في خلايا سرطان الدم بعد العلاج مع TKIs وللمقارنة بشكل مباشر على قوة من مركبات متعددة في الخلايا. في بروتوكول المعروضة هنا، تم استخدام pervanadate لتحقيق الاستقرار في الفوسفات من البروتين وتركزت البروتين الهدف عن طريق مناعي. إذا كانت هذه القياسات كافية للسماح للكشف من قبل لطخة غربية، ويمكن أيضا أن تكون زيادة مستويات الفوسفات من البروتين عن طريق إضافة يجند، إما مع أو بدون pervanadate. وبالمثل، يمكن إضافة يجند في حل تستخدم لطرد نخاع العظام للدراسات الدوائية. لىجنت يمكن تنقيته أو، في بعض الحالات، يمكن أن تقدم بوصفها مكونا من مكونات مصل بقري جنيني. في حال أن هذه الأساليب لا تسمح للكشف عن السيارات-فسفرته التيروزين كيناز والأهداف المصب يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم تثبيط الهدف، على الرغم من أنه من الأفضل لتقييم النشاط من البروتين الهدف مباشرة عندما يكون ذلك ممكنا. من المذكرة، ينبغي توخي الحذر عند تفسير نتائج التجارب باستخدام pervanadate، وهو مثبط غير انتقائي الفوسفاتيز الذي يؤثر على العديد من البروتينات الخلوية. لهذا السبب، pervanadate لا ينبغي أن تستخدم للكشف عن تغيرات في مكونات الإشارات المصب. قبل للدراسة في النماذج الحيوانية، فمن المستحسن لتأكيد النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs في خلايا سرطان الدم. لهذه الدراسات ونحن نعتمد على المقايسات مولد الرمع في ميثيل أو لينة المتوسطة أجار. بينما فحوصات أخرى يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم تأثيرات مضادة للورم في الثقافة، مستعمرة المقايسات تشكيل غالبا ما تكون أكثر العلاقات العامةedictive في الجسم الحي من الكفاءة النسبية لفحوصات أكثر تقليدية التي تقيم انتشار و / أو البقاء على قيد الحياة في الثقافة السائل. ومع ذلك، قد يتم استخدام هذه المقايسات جنبا إلى جنب مع المقايسات تشكيل مستعمرة لتقييم آليات النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs ويمكن أيضا أن تكون مفيدة في حالة عدم وجود خط الخلية من الفائدة لا تشكل المستعمرات. على وجه التحديد، قد يكون من المفيد لتقييم استحثاث موت الخلايا المبرمج في الاستجابة للعلاج مع TKIs باستخدام فحوصات تدفق cytometric لتحديد مستويات المشقوق caspases / تنشيط، وزيادة ربط Annexin V إلى سطح الخلية، أو امتصاص الفرق من YOPRO-1-يوديد . وبالمثل، انخفض انتشار أو تحريض تمايز قد تسهم أيضا في النشاط المضاد للسرطان الدم. على هذا النحو، يمكن أن تتولد منحنيات النمو في وجود وغياب TKI لتقييم انتشار ومورفولوجيا الخلوية والتغيرات في التعبير عن علامات سطح الخلية يمكن فحص لتحديد مرحلة التمايز. استخدام مولد الرمعيتم تأسيس المقايسات بشكل جيد في مجال تطوير الأدوية وبمثابة أداة فعالة من حيث التكلفة لتقييم TKIs. ومع ذلك، فمن المعروف أن التغيرات المنتظمة في ظروف الثقافة (بما في ذلك إضافة عوامل النمو وغيرها من الملاحق، والاختلافات في تكوين الدم، والاختلاف في الرقم الهيدروجيني من الحل TKI) يمكن أن تؤثر على كل من النمو ومستعمرة chemosensitivity 9،10. وبالتالي، والاتساق في ظروف الثقافة هو أمر حاسم لاستنساخ في هذا الاختبار. التوزيع غير المتكافئ للخلايا أو TKI يمكن أن يؤدي أيضا إلى mischaracterization من فعالية العلاجات التجريبية (الشكل 2C). في التقييم إضافة نقطة أكثر من مرة واحدة لعد مستعمرة أو الطلاء بعد التعرض المخدرات قد تساعد على التمييز بين الأدوية التي تتوسط تأثيرات مضادة للالتكاثري ولكن ليس لديهم إمكانات علاجية 7. في الجسم الحي الدراسات الموضحة هنا تمثل خطوة حاسمة على الطريق نحو السريريل تطبيق TKI. الدراسات الدوائية لإثبات تثبيط الهدف مهمة لتحديد الجرعة وتردد الإدارة ذات الصلة لدراسات لاحقة لتقييم فعالية. في معظم الحالات فمن الأفضل لتحقيق تثبيط كاملة ومستمرة من البروتين وهذا الهدف قد يتطلب معالجة أكثر من مرة في اليوم. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط حدوث الاييضاض وزيادة البقاء على قيد الحياة في نماذج طعم أجنبي قد تتطلب جرعة أعلى من TKI مما هو مطلوب لاستكمال والمستمر تثبيط البيوكيميائية في نخاع العظام. قد يحدث هذا بسبب سرطان الدم أثبت في مواقع متعددة والتعرض لTKIs قد تكون غير متجانسة في مواقع تشريحية مختلفة، بما في ذلك الدماغ، أو أنها يمكن أن تعكس القيود في حساسية مقايسة مما أدى إلى عدم اكتشاف كميات محدودة المتبقية من البروتين الهدف نشط ( أي تثبيط الهدف غير مكتملة). مع ذلك، على عكس العلاجات السامة للخلايا التقليدية التي تدار في أقصى بهمجرعة التسامح، قد تكون أكثر وكلاء جزيئيا المستهدفة للورم انتقائية نفس القدر من الفعالية في الجرعات المنخفضة التي هي كافية لتثبيط البيوكيميائية للبروتين الهدف، ولكن لا ترتبط مع السميات كبيرة. وبالتالي، لهذه الفئة من العملاء، والدراسات الأولية لتقييم الآثار المترتبة على TKI على تطور سرطان الدم في نماذج طعم أجنبي غالبا ما تستخدم الجرعة الحد الأدنى اللازم للحصول على تثبيط الكامل والمستمر من الهدف. إذا لم يلاحظ أي آثار على تطور سرطان الدم أو البقاء على قيد الحياة، ويمكن زيادة الجرعة حتى لوحظ سمية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه النماذج للتحقيق في الآثار المترتبة على TKI تديرها بالاشتراك مع علاجات سرطان الدم القياسية، وبالتالي إبلاغ تطوير البروتوكولات السريرية اللاحقة. إنشاء نماذج طعم أجنبي من سرطان الدم الحاد باستخدام الخلايا، معربا عن luciferase المراسل يمثل تقدما كبيرا على مدى أكثر النماذج التقليدية وطعم أجنبي لديه القدرة على تسريع كبيرعملية اكتشاف المخدرات والتنمية 11. التصوير تلألؤ بيولوجي يسمح لتحديد طولية غير الغازية من عبء سرطان الدم، مما يقلل من عدد الحيوانات اللازمة للدراسات، ويمكن أيضا تقديم معلومات حول موقع التشريحية للمرض. بالإضافة إلى ذلك، في محاولة لتوسيع بناء المرافق السريرية المحتملة للTKIs، والتصوير تلألؤ بيولوجي يمكن أن يتحقق بتكاثر بعد زرع العينات البشرية الأولية الموسومة luciferase المراسل المريض 12. ومع ذلك، يمكن تفسير الصور تلألؤ بيولوجي تكون صعبة نظرا لعدم اليقين الموضعية من الخلايا التي ينبعث منها ضوء وبالتالي في الجسم الحي التصوير تلألؤ بيولوجي ينبغي أن تستخدم فقط كأداة نصف كمي لمتابعة نفس الحيوان في ظل ظروف مماثلة 13. في حالة حسن الحظ أن مركبات متعددة لها نشاط كبير وقابلة للمقارنة في المقايسات وصفها هنا، معايير إضافية التي يمكن استخدامها لمزيد من رانكينغرام من المركبات تشمل السهولة النسبية لتوليف مركب، والذوبان، ودرجة التوافر الحيوي عن طريق الفم، والخصائص الدوائية، ودراسات علم السموم. أخذت معا، وينبغي أن تسمح هذه البيانات لتحديد مركب الأمثل للتقدم إلى التحقيق السريرية والتي تكون ضرورية لدعم ايداع الفحص دواء جديد (IND) التطبيق مع إدارة الغذاء والدواء (FDA) لتمكين الدراسات السريرية. بعد توليد هذه البيانات ما قبل السريرية الحرجة اللازمة للنهوض من هذه العوامل الرواية في العيادة، وينبغي النظر في الاستفادة من المعهد الوطني للبرنامج التقييم علاج السرطان الصحة (CTEP). في هذا البرنامج وترعى التجارب السريرية لتقييم الأدوية المضادة للسرطان جديدة، مع التركيز بشكل خاص على البحوث متعدية. ينبغي الحرص على تنسيق العرض العام للبيانات ما قبل السريرية، بما في ذلك وصف لهياكل والتوليف من المركبات الرواية، مع تقديم طلبات براءات الاختراع لحمايهر حقوق الملكية الفكرية. بشكل عام، لا ينبغي أن تعرض البيانات علنا ​​حتى يتم إيداع طلبات البراءات حماية تكوين المادة وطرق استخدامها. في الختام، لقد أثبتنا استراتيجية فعالة للتحقيق وتقييم إمكانات TKIs رواية كعوامل علاجية لعلاج سرطان الدم الحاد. تثبيط الهدف في خلايا سرطان الدم، سواء في الثقافة والمعزولة من نخاع العظام من الفئران مع xenografts سرطان الدم البشرية، يمكن تقييمها من قبل طخة مناعية. أهمية وظيفية من تثبيط الهدف يمكن تقييمها باستخدام المقايسات مولد الرمع ومثلي نماذج طعم أجنبي الفئران مع التصوير للإضاءة الحيوية. معا هذه المقايسات توفير بيانات ما قبل السريرية الحرجة اللازمة للنهوض من هذه العوامل متعدية الرواية في العيادة.

سرطان الدم الليمفاوي الحاد (ALL) هو الورم الخبيث الأكثر شيوعا عند الأطفال 1،2. معدل البقاء على قيد الحياة عموما للأطفال ALL-B النسب (B-ALL) هو ما يقرب من 85٪، ولكن الأنواع الفرعية بيولوجية معينة، بما في ذلك النسب T-ALL (T-ALL)، يكون لا يزال الأكثر فقرا التكهن حتى مع البروتوكولات العلاجية الحالية. لا يزال مزيد من العلاج من انتكس ALL تحديا 3. على الرغم من أن الغالبية العظمى من المرضى البالغين المصابين بسرطان الدم الحاد تحقيق مغفرة مع العلاج الكيميائي في خط الهجوم، العديد من المرضى لا تزال تعاني من الانتكاس 4. ومن المعروف نظم العلاج الكيميائي الحالي في علاج سرطان الدم الحاد لتتسبب في آثار جانبية طويلة المدى القصير والمرتبطة سمية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى علاجات أقل سمية التي تستهدف على وجه التحديد خلايا السرطان مع تأثير ضئيل على الأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، وقد تم التركيز على تطوير الرواية، وكلاء المستهدفة جزيئيا مع خصوصية لخلايا السرطان، وغالبا ما تستخدم الكيمياء التكراريةلتوليد المركبات النشطة المتعددة التي يجب عندئذ مقارنة وتحديد أولوياتها 5. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من TKIs لعلاج سرطان الدم الحاد، والتي يمكن استخدامها لتقييم مركب واحد أو لمقارنة مباشرة من المركبات متعددة من أجل تسهيل تطوير العقاقير. طريقة المقدمة هنا يتكون من أربع خطوات. أولا البيوكيميائية (1) ومكافحة سرطان الدم (2) يتم تقييم أنشطة المجمع (ق) في خلية ثقافة، ثم يتم تأكيد تثبيط الهدف في النماذج الحيوانية (3)، وأخيرا الكفاءة العلاجية للTKI (ق) يتم تحديد سرطان الدم في نماذج طعم أجنبي مثلي (4). لهذه الدراسات، فمن المهم اختيار خطوط الخلايا ذات الصلة، والتي هي ممثلين عن الأنواع الفرعية البيولوجية الأكثر شيوعا. وينبغي اختيار خطوط الخلايا، والتي على حد سواء، والتعبير عن الهدف من الفائدة وتفتقر إلى الهدف من الفائدة، للتحقيق في ما إذا كانت الآثار البيولوجية ميدiated عن طريق تثبيط الهدف. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما لتطوير مثبطات جزيء صغير، والتي لها آثار خارج الهدف التي قد تكون مهمة للنشاط المضادة للورم. من الضروري أيضا اختيار خط الخلية التي تعتمد على الهدف للآثار وظيفية مثل الانتشار أو البقاء على قيد الحياة. ويمكن استخدام دراسات التحقق من صحة الهدف الأولي (خارج نطاق هذه المقالة) باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو وسائل أخرى محددة لمنع الهدف لتحديد خطوط الخلايا التي تعتمد على الهدف. ومن المستحسن أيضا لاختيار خطوط الخلايا التي يمكن أن تشكل xenografts الفئران، مثل أن نتائج زراعة الخلايا يمكن أن يكون ترجمة لفي التجارب المجراة على نحو أكثر مباشرة. لتقييم النشاط البيوكيميائية بوساطة TKIs في خلايا سرطان الدم، انخفاض في مستقبلات الفسفرة يمكن استخدامها كمؤشر على تثبيط الهدف. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية أو ELISA المقايسات، وهذا يتوقف على مدى توافر ونوعية الأجسام المضادة.إذا كانت الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لهدف المتاحة، فحوصات ELISA هي الأفضل لأنها أكثر كمية وكفاءة. في الحالات التي تكون فيها الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لELISA ليست متاحة، قد يكون من الضروري تحليل لطخة غربية. في هذه الحالة، يمكن مناعي من كمية كبيرة من المحللة تكون مفيدة للكشف عن الأهداف التي هي في وفرة منخفضة. هذا النهج هو ذات الصلة ولا سيما لقياس الفوسفات، والبروتينات، والتي قد يكون لها نصف حياة قصيرة للسماح للتغيرات السريعة في إشارة استجابة للمؤثرات البيئية. بعض البروتينات فسفرته هي عطوب للغاية، وعلى الأرجح نتيجة لتشكيل معقدة مع phosphatases. للكشف قوية وثابتة من هذه البروتينات فسفرته، قد يكون من الممكن أيضا لعلاج الخلايا مع pervanadate، وهو لا رجعة فيه بروتين تيروزين الفوسفاتيز المانع 6، لتحقيق الاستقرار في الفوسفات من البروتين قبل إعداد لست] خلية كاملة. إلىتحديد ما إذا كان النشاط البيوكيميائية النتائج في تأثيرات مضادة للورم، والعمليات البيولوجية التي تعتمد على الهدف يمكن رصدها في التجارب القائمة على الخلية. لخطوط خلية سرطان الدم، النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs يمكن تقييمها باستخدام فحوصات أجريت في تشكيل مستعمرة ميثيل أو أجار لينة 7. أجار لينة قد يكون من المفضل لأن هذا هو وسيلة الصلبة التي هي أكثر قابلية للتلاعب إذا كان العلاج تتكرر مع TKI ضروري. في حين أن العديد اللوكيميا myloid (AML) خطوط الخلايا الحادة وشكل مستعمرات في أجار لينة، فإن معظم خطوط الخلايا ALL تشكل فقط المستعمرات في ميثيل، والذي هو وسيلة شبه صلبة. على الرغم من أنه من الممكن لتحديث المتوسطة و / أو TKIs في الثقافات ميثيل، فقط كميات صغيرة يمكن استخدامها مع وتيرة محدودة. وبالمثل، فإنه من الصعب صمة عار المستعمرات دون تعطيل لهم في ميثيل. ينبغي أن تحدد الدراسات الأولية قدرة خطوط الخلايا المناسبة لشكل مستعمرات في ميثيل و / أو أجار لينة ورانه الكثافة المثلى من الخلايا في الثقافة بحيث المستعمرات غير قابلة للتداخل وعدد كاف إحصائيا للحصول على البيانات ذات الصلة (عادة 50-200 المستعمرات في لوحة 35 ملم). بينما في فحوصات المختبر هي قوية وفعالة من حيث التكلفة، ولها آثار أخلاقية أقل من التجارب على الحيوانات كلها، والنهوض من المركبات العلاجية يتطلب دليلا على فعالية وسلامة في النماذج الحيوانية. لفي الدراسات المجراة، خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم الحاد يمكن زرعها في orthotopically NOD.Cg-Prkdc SCID أنا l2rg tm1Wjl / SzJ (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران وTKIs عن طريق الحقن أو عن طريق الفم بالتزقيم يمكن أن تدار بسهولة. بعض خطوط الخلايا قد تتطلب تعرض الفئران مجموعة موردي المواد النووية إلى خلية المنخفضة التي تعتمد على خط جرعة من الإشعاع من أجل xenografts أن ينشئ، والفئران في هذه الحالة قد لا تتسامح مع أنبوب تغذية عن طريق الفم دون فترة نقاهة 5-10 يوم آخر التشعيع. يصف هذا المخطوط جيل من B-ALL وT-ALL xenografts استخداميمكن إنشاء خطوط خلية معينة (697 وJurkat) كأمثلة ولكن xenografts في الفئران مجموعة موردي المواد النووية باستخدام مجموعة واسعة من خطوط الخلايا. في حال أن خطوط الخلايا الأخرى هي أكثر قابلية للتطبيق، شرط التشعيع، ينبغي تحديد العدد الأمثل من الخلايا لزرع، وتوقيت ظهور المرض وتطور تجريبيا. من الناحية المثالية، فإن هذه النماذج وانتفاذ كاملة (كل حيوان زرع يتطور سرطان الدم)، حركية متناسقة (اللوكيميا تقدم مماثل في جميع الحيوانات)، ونافذة معالجة معقولة (مثالي بين 20-30 يوما من بدء العلاج وإزالة من الدراسة بسبب المرض) . ويمكن زيادة عدد الخلايا المزروعة لتحسين انتفاذ والاتساق الحركية أو انخفضت إلى تحسين إطار العلاج إذا لزم الأمر. لتحديد ما إذا TKIs تتدخل لإعاقة الهدف في الجسم الحي، يتم جمع عينات من الفئران مع xenografts سرطان الدم بعد العلاج مع TKI أو مركبة فقط. من الناحية المثالية، فإن جرعةوتسترشد جدول د الإدارة لهذه التجارب من خلال الدراسات الدوائية، والتي يمكن في كثير من الأحيان أن يقوم بها المختبرات التجارية وخارج نطاق هذا المقال. إذا كانت البيانات الدوائية المتاحة، وتركيز مركب المطلوبة لتثبيط فعالية المستهدفة في خلية ثقافة والحد الأقصى للتركيز مصل الدم بعد جرعة واحدة من TKI يمكن استخدامها لتحديد جرعة البداية لدراسات على الحيوانات. يمكن أن الدراسات الدوائية أيضا بإبلاغ توقيت جمع العينة بعد العلاج للدراسات الدوائية وطريقة التعاطي. تثبيط الهدف يمكن تقييمها في أي جهاز المتضررة ولكن الأنسجة التي يتم جمع معظم بسهولة ومعالجتها هي الأفضل. خطوط الخلايا سرطان الدم الحاد الأكثر إقامة في الكبد ونخاع العظم والطحال والدم المحيطي، والجهاز العصبي المركزي، على الرغم من أن أجهزة معينة المتضررة ومدى engraftment في هذه الأجهزة تختلف بين النماذج. بروتوكول المعروضة هنا يقيم phosphس البروتين تثبيط نخاع العظام في استخدام تحليل لطخة غربية، ولكن الأجهزة الصلبة قد يكون من الأسهل لجني باستمرار وتتطلب معالجة الحد الأدنى أو أي قبل التجميد، مما يتيح فرصة أقل للتدهور الفوسفات البروتينات أثناء جمع العينات وتجهيزها. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية لتقييم أورام أو الأجهزة المتضررة من سرطان الدم الصلبة. أخيرا، يتم تحديد الكفاءة العلاجية للTKI (ق) في نماذج طعم أجنبي مثلي سرطان الدم. لهذه الدراسات، توقيت بدء العلاج يمكن أن تختلف، بحيث يتم إنشاء أكثر أو أقل المرض. العلاج قد تبدأ على الفور بعد زرع لإجراء الدراسات الأولية ومن ثم يتأخر في دراسات لاحقة حتى يتم الكشف عن عبء المرض كبيرة لتقريب أكثر عن كثب نموذج العلاج التشخيص. من الناحية المثالية، وهذه النماذج الحيوانية أيضا القدرة على القياس غير الغازية من عبء المرض. قمنا الأمثل للأساليب إدخال إبليس اليراعبورصة عمان الجين في خطوط الخلايا سرطان الدم باستخدام جزيئات الفيروسات مثل، والسماح لغير الغازية، وتحليل طولية من بداية ظهور أعراض المرض والتقدم وتقييم عبء المرض في نخاع العظام والأعضاء الصلبة. الحرجة لهذا النهج هو استخدام خطوط الخلايا وحيدة النسيلة الموسومة luciferase المراسل لمنع التقلبات في تطوير سرطان الدم، معربا عن luciferase المراسل المرتبطة باستخدام خطوط الخلايا بولكلونل والعلاج ليست لها علاقة مع TKI 8. أخذت معا، وهذه الخطوات يمكن استخدامها لتقييم لTKI واحدة أو للمقارنة المباشرة وترتيب TKIs متعددة. بينما البروتوكولات المعروضة هنا التركيز على تطوير TKIs، وهذه الأساليب يمكن تكييفها لأهداف أخرى وموصوفة اعتبارات للتنمية الفحص. وبالتالي، قد يكون هذا أكثر قابلية للتطبيق على نطاق واسع الاستراتيجية لتقييم ما قبل السريرية وكلاء جزيئيا المستهدفة للعلاج من سرطان الدم الحاد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

قد تورطت مستقبلات التيروزين كيناز في تطور وتقدم العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الدم والأورام الصلبة، وتكون الأهداف العلاجية druggable جذابة. نحن هنا تصف استراتيجية من أربع خطوات فعالة لتقييم ما قبل السريرية مثبطات التيروزين كيناز (TKIs) في علاج سرطان الدم الحاد. في البداية، تم استخدام تحليل لطخة غربية لتأكيد تثبيط الهدف في خلايا سرطان الدم مثقف. ثم يتم تقييم النشاط الوظيفي باستخدام المقايسات مولد الرمع في ميثيل أو الثقافات أجار لينة. يتم تقييم المركبات التجريبية التي تثبت النشاط في المقايسات الثقافة خلية في الجسم الحي باستخدام NOD SCID جاما (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران زرع orthotopically مع خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم. الأولي في الدراسات المجراة الدوائية تقييم تثبيط الهدف في انفجارات معزولة عن اللوكيميا في نخاع العظام. ويستخدم هذا النهج لتحديد الجرعة والجدول الزمني اللازم لإدارة فعالة تمنع الهدفأيون. دراسات لاحقة تقييم فعالية TKIs في الجسم الحي باستخدام luciferase المراسل معربا عن خلايا سرطان الدم، مما يسمح للإضاءة الحيوية للرصد غير الغازية من عبء اللوكيميا وتقييم استجابة علاجية باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير. وكانت هذه الاستراتيجية فعالة لتقييم TKIs في المختبر والمجراة ويمكن تطبيقها لتحديد وكلاء جزيئيا المستهدفة مع الإمكانات العلاجية أو للمقارنة المباشرة وإعطاء الأولوية للمركبات متعددة.

المقايسات المقدمة هنا تقييم آثار البيوكيميائية والوظيفية بوساطة TKIs، ويمكن استخدامها لتصنيف المركبات رواية تقوم على درجة تثبيط الهدف في المختبر والمجراة، والحد من تشكيل مستعمرة، والتأخير في حدوث الاييضاض في الفئران مجموعة موردي المواد النووية المزروعة مع luciferase المراسل- الموسومة خلايا سرطان الدم. تم استخدام تحليل طخة مناعية لتحديد تثبيط شكل فسفرته النشطة من البروتين الهدف في خلايا سرطان الدم بعد العلاج مع TKIs. أدت المعاملة مع TKIs في الانخفاض تعتمد على الجرعة في كمية البروتين فسفرته. الشكل 1 يبين تثبيط الفسفرة المستهدفة من قبل ثلاثة TKIs مختلفة في خط خلية سرطان الدم الحاد مع TKI C كونها أقوى، TKI B كونها أقل قوة، وTKI وجود أي تأثير. وبالتالي، هذا الاختبار يسمح الترتيب من المركبات على أساس قوة النشاط البيوكيميائية في النظام النموذجي القائم على الخلية. في الأمثلة هو مبين فيكان الرقم 1، والإثراء من المستضد بواسطة مناعي واستخدام مثبط إنزيم الفوسفاتيز pervanadate اللازمة لتحقيق نتائج التأويل. السبب في ذلك قد يكون، أن الفسفرة بروتين كيناز التيروزين هذا هو عطوب المدقع. لدراسة تأثير TKIs على خصائص أنكجنيك من خلايا سرطان الدم الحاد، واستخدمت المقايسات تشكيل مستعمرة. نحن التحقيق في قدرة خلايا سرطان الدم تعتمد على الهدف لتشكيل مستعمرات في القائم ميثيل (ALL) والمتوسطة في أجار لينة (AML). في المثال هو موضح في الشكل 2A، انخفاضا كبيرا إحصائيا في عدد مستعمرة لوحظ في خط الخلية ALL بعد العلاج مع TKI. وقد لوحظت نتائج مماثلة في خطوط الخلايا AML بعد العلاج مع TKIs في أجار لينة. في الشكل 2B، هناك اتجاه نحو انخفاض عدد مستعمرة في الاستجابة للعلاج مع TKI ويظهر انخفاض تعتمد على الجرعة، ولكن الفرق ليس شارعatistically كبيرة نتيجة لتقلب بين مكررات. لاحظ الأخطاء المعيارية كبيرة في الشكل 2B نسبة إلى الشكل 2A. خلط وافرة من الخلايا في المتوسط ​​شبه صلبة والتوزيع المتساوي للوسط شبه صلبة في الآبار أو لوحات أمر بالغ الأهمية من أجل التناسق بين مكررات في المقايسات مولد الرمع. العد الدقيق للخلايا قابلة للحياة قبل الطلاء المهم لضمان الاتساق بين التجارب أيضا. يبين الشكل 2C لوحة مع التوزيع غير المتكافئ للمستعمرات، فقاعات في أجار لينة، وانتشار غير مكتملة من أجار لينة في لوحة (اللوحة اليمنى) و لوحة مع طلاء كافية للمقارنة (اللوحة اليسرى). لضمان أن ميثيل لا تجف أثناء فترة الحضانة من المهم أيضا لتشمل لوحات من الماء المعقم في كل طبق. جفاف المتوسطة ميثيل يغير كثافته ويقلل من قدرة الخلايا على شكل مستعمرات، مما يحتملمنع توليد نتائج مفيدة. لتحديد ما إذا TKIs يمكن أن تمنع بروتين المستهدف في الجسم الحي، كان يعمل تحليل لطخة غربية لفحص مستويات الفوسفات من البروتين والبروتين الكلي في انفجارات نخاع العظام المعزولة من الفئران مجموعة موردي المواد النووية المزروعة مع خط خلية سرطان الدم الحاد. في المثال هو موضح في الشكل 3، وكشف تحليل الدوائية انخفاضا في مستويات الفوسفات من البروتين في تفجيرات اللوكيميا المعزولة من الفئران التي عولجت مع TKI بالنسبة إلى الفئران التي عولجت مع السيارة فقط. وتبين هذه الدراسات تثبيط لصناعة السيارات في الفسفرة في خلايا سرطان الدم بعد العلاج مع TKIs في الجسم الحي، مؤكدا أن هذه المركبات تصل إلى نخاع العظام وتمنع بشكل فعال الهدف. كان TKI D أقل نشاطا من TKI E في هذا الاختبار. المثال المعروض، والاستفادة المطلوبة من pervanadate لتحقيق الاستقرار في الهدف الفوسفات من البروتين وتسمح للكشف. ماوس نموذج طعم أجنبي مثلي من سرطان الدم الحاد في مجموعة موردي المواد النووية ميلم مع حقن استخدمت كل خط الخلية، معربا عن luciferase المراسل لتقييم تأثير العلاج مع TKI على إمكانات أنكجنيك في الجسم الحي. كما هو مبين في الشكل (4)، وكان الفئران التي عولجت مع TKI مستوى أدنى من تلألؤ بيولوجي كبير، مما يدل على انخفاض العبء النسبي لسرطان الدم الفئران التي عولجت مع السيارة فقط. بعد 10 يوما من العلاج، وكان كل الفئران مستوى منخفض من تلألؤ بيولوجي لم يكن يختلف كثيرا بين الحيوانات تعامل مع السيارة والحيوانات تعامل مع TKI. في المقابل، من خلال 19 أيام بعد العلاج، وكان الفئران المعالجة سيلة هامة أعلى كثافة تلألؤ بيولوجي (86.12 ± 19.17 الفوتونات / ثانية)، في حين كان الفئران التي عولجت بجرعة عالية من TKI أقل بكثير كثافة إشارة (29.64 ± 9.04 الفوتونات / ثانية) . <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50720/50720fig1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50720/50720fig1highres.jpg" width="600px" /> الشكل 1. TKIs تمنع الفسفرة من البروتين المستهدف في المختبر، وعولجوا الثقافات الخليوي مع تركيزات مبين من TKI A، B TKI، أو TKI مئوية لمدة 1 ساعة. وأضاف Pervanadate لمزارع الخلايا لمدة 3 دقائق لتحقيق الاستقرار في شكل فسفرته من البروتين الهدف. تم immunoprecipitated البروتين الهدف من الخلية لست وتم الكشف عن الفوسفات من البروتين والبروتين الكلي من قبل لطخة غربية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50720/50720fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50720/50720fig2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50720/50720fig2highres.jpg" width="600px" /> الشكل 2. TKI يقلل تشكيل مستعمرة في خطوط الخلايا في سرطان الدم الحاد ميثيل وأجار لينة. ALL كانت مطلية الخلايا في ميثيل (A) وخلايا مكافحة غسل الأموال وكانت مطلية في لياليكثيرا أجار (B) في وجود TKI أو DMSO (السيطرة على السيارة). احصي المستعمرات بعد 2 أسابيع في الثقافة. وقد استمدت متوسط ​​القيم والأخطاء القياسية من لوحات ثلاث نسخ. (C) يتم عرض لوحات أجار لينة مع الممثل التوزيع الأمثل للمستعمرات (اللوحة اليسرى) أو عدم المساواة في توزيع المستعمرات وأجار لينة منفصلة جزئيا (اللوحة اليمنى). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50720/50720fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50720/50720fig1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50720/50720fig3highres.jpg" width="600px" /> الرقم 3. المعاملة مع TKI يقلل من مستويات الفوسفات من البروتين في الجسم الحي. تم زرع مجموعة موردي المواد النووية والفئران مع خط الخلية ALL وتعامل مع جرعة واحدة من TKI D، E TKI، أو مركبة إلا بعد تطور سرطان الدم. عظم مجمعت سهم الخلايا من عظام الفخذ وتعامل مع pervanadate قبل إعداد لست] خلية كاملة. أجريت مناعي للبروتين الهدف، والكشف عن الفوسفات والبروتينات الكلية من قبل لطخة غربية. كان quantitated شدة B الإشارة بواسطة قياس كثافة وجزء من البروتين فسفرته الهدف بالنسبة إلى السيارة معاملة الحيوانات تم حساب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50720/50720fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50720/50720fig4.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50720/50720fig4highres.jpg" width="600px" /> الشكل 4. المعاملة مع TKI يؤخر تطور المرض في الفئران زرعها مع كل خط الخلية البشرية، معربا عن luciferase المراسل. تم زرع الفئران مجموعة موردي المواد النووية التي يبلغ عدد سكانها حيدة النسيلة من transduced luciferase المراسل-ALL الخلايا عن طريق الحقن في الذيلالوريد. تم حقن D-وسيفيرين الغشاء البريتونى، وأخذت الصور تلألؤ بيولوجي مرتين أسبوعيا (Bining: 8، فوف 19.6، و / وقف 1، زمن التعرض 120 ثانية). وأظهرت الصور Pseudocolor يدل على زيادة كثافة تلألؤ بيولوجي مع مرور الوقت في الفئران زرعها مع خلايا سرطان الدم وانخفاض تعتمد على الجرعة في شدة تلألؤ بيولوجي في الحيوانات تعامل مع TKI. B الكميات من متوسط ​​كثافة تلألؤ بيولوجي والخطأ المعياري لكل مجموعة الدراسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50720/50720fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia at JoVE.com

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

يتم التعبير عن مستقبلات التيروزين كيناز ectopically في العديد من أنواع السرطان وتم تحديدها كأهداف العلاجية في سرطان الدم الحاد. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من مثبطات كيناز التيروزين لعلاج سرطان الدم الحاد.

تقييم ما قبل السريرية من التيروزين كيناز مثبطات لعلاج اللوكيميا الحادة

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

Google

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  يتم التعبير عن مستقبلات التيروزين كيناز ectopically في العديد من أنواع السرطان وتم تحديدها كأهداف العلاجية في سرطان الدم الحاد. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من مثبطات كيناز التيروزين لعلاج سرطان الدم الحاد. 

Video: Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

استعمال الدوائي، التحدي الرنين المغناطيسي الوظيفي في مرحلة ما قبل السريرية للبحوث: بالتطبيق على النظام 5-HT

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

ورم في المثانة Orthotopic النموذجي وتقييم المعالجة سارنا داخل المثانة

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

تحليل الكمي متعددة الأطياف وبعد زرع الأنسجة نيون لتصور أصول الخليوي، وأنواع، والتفاعلات

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

ما قبل السريرية مثلي فأري موديل سرطان البروستاتا البشرية

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

استخدام نظام التخدير الرقمية منخفضة لتدفق الفئران والجرذان

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

نموذج الحاد الشبكية لتقييم الدم الشبكية الحاجز خرق والمحتملة أدوية لعلاج

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

نموذج بورسين ما قبل السريرية لزراعة القلب التقويمي

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

نموذج ما قبل السريرية للتبرع القلبي بعد الوفاة الدورة الدموية

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

تقييم الأورام الدموية الغازية لنظام البطين الأيمن وفرط ضغط الدم الرئوي الناجم عن نقص الأكسجين في الفئران

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...