فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. خه بينغ تشنغ، Huiliang تشانغ وستيفن Kolwicz على تعليقاتهم المفيدة والدعم التقني في تطوير هذا الأسلوب. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح والمنح الإنمائية العلماء من جمعية القلب الأمريكية لWW.

1. تجربة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول ملحي متساوي التوتر متوازنة (50 مل) تحتوي على: 140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 2.5 مم CaCl 2، 2 مم MgCl 2 و 10 ملي HEPES (درجة الحموضة 7.2) لفي الجسم الحي التصوير العضلات والهيكل العظمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 1 لتر من كريبس-هنسلايت العازلة (جسر الملك حسين) التي تحتوي على: 118 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5.3 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO 4، 0.5 ملي EDTA و 25 مم 3 NaHCO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقاعة في جسر الملك حسين مع الغاز التي تحتوي على 95٪ O 2/5٪ CO 2 لمدة 10-15 دقيقة قبل إضافة 2 مم CaCl 2. إضافة ركائز التمثيل الغذائي (مثل الجلوكوز 10 ملم و 0.5 ملم البيروفات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأدوات الجراحية بواسطة تعقيم المشبك، مقص، وملقط في الايثانول 70٪ ثم الشطف في تعقيم ده 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على نظام نضح القلب، وضبط درجة الحرارة على حمام مائي ودائري، ضبط سرعة مضخة تحوي على 6 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقاعة في جسر الملك حسين مع 95٪ O 2/ 5٪ CO 2 الغاز، ورصد معدل التدفق ودرجة الحرارة (37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة قبل التحقيق الألياف البصرية) من النفايات السائلة. يحتاج النظام حوالي 20 دقيقة لدرجة حرارة الغاز وموازنة. </li></ol> 2. التصوير متحد البؤر من عضلات الهيكل العظمي في فيفو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع بنتوباربيتال (80 مغ / كغ، والملكية الفكرية). سوف الحيوان تصل التخدير الجراحي (أي رد حتى أخمص القدمين قرصة) في غضون 10-15 دقيقة والبقاء في هذا الوضع ل1-1.5 ساعة، كافية لفي الجسم الحي التصوير من عضلات الهيكل العظمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعر على واحد من hindlimbs وتعقيم الجلد مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في الجلد على طول الجانب الخارجي من أطرافهم لفضح عضلات الساق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط غمد بلطف مع ملقط حادة وإجراء شق من خلال ذلك مع مقص. مزيد من تشريح لإزالة غمد وفضح ألياف العضلات تحتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفي الجسم الحي تحميل TMRM في الهيكل العظميالعضلات، وتشمل TMRM (500 نانومتر) في متساوي التوتر حل متوازن الملح أن تزج العضلات لمدة 30 دقيقة ثم يغسل بها الحل خالية من المؤشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس على جانبها على المجهر متحد البؤر (LSM زايس 510) مرحلة وكبح جماح الطرف الخلفي في موقف أن الهيكل العظمي والعضلات تتعرض تواجه ضد ساترة التي تشكل الجزء السفلي من الغرفة. ساترة هو في بين الأنسجة العضلية والهدف مقلوب (النفط 40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على الساق أسفل بلطف لاجراء اتصالات ضيق بين الأنسجة وساترة. تزج العضلات التي تتعرض لها متساوي التوتر حل متوازن الملح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل ثنائية الأبعاد (2D، س ص) وصور متحد البؤر بمعدل عينة من ثانية واحدة لكل إطار. يتم ترقيم شدة كل بكسل على عمق 8 بت. عادة، تفحص المسلسل يحتوي على 100 لقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور المتسلسلة التي كتبها الأولى مثيرة في 405 نانومتر وجمع في&gt; 505 نانومتر ثم في 488 نانومتر في حين جمع&gt; 505 نانومتر لثنائي الطول الموجي excitatioن تصوير MT-cpYFP. استخدام الإثارة متتابعة في 405 و 488 و 543 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 505-545، 505-545، و&gt; 560 نانومتر، على التوالي، على الثلاثي الطول الموجي الإثارة التصوير MT-cpYFP وTMRM. </li></ol> 3. التصوير متحد البؤر من القلب Perfused ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التصوير في الجسم الحي من عضلات الهيكل العظمي، وحقن الفأر مع 200 وحدة من الهيبارين (الملكية الفكرية). بعد عشر دقائق، الموت ببطء الماوس عن طريق بضع الصدر وبسرعة إزالة القلب مع الرئتين والغدة الصعترية المرتبطة به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إزالة الرئة في المخزن الجليد الباردة. تحديد فصوص من الغدة الصعترية وقشر بلطف مرة أخرى لفضح الأبهر الصاعد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغدة الصعترية وعزل الشريان الأورطي عن طريق إزالة أي نوع من الأنسجة المحيطة بها بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض في نهاية العلوي من الأبهر الصاعد قبل أول فرع من قوس الأبهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد جدار الشريان الأورطي برفق مع اثنين من الملقط الصغير خياطة لفضح التجويف ووضع بعناية الشريان الأورطي إلى كاليفورنياnnula (PE50 أنبوب). يقام الشريان الأورطي في مكان مع المشبك سفينة صغيرة في حين ترتبط خيوط بسرعة حول الشريان الأورطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المشبك، بعناية تحقق قنية مع ملقط للتأكد من غيض من قنية فوق جذر الأبهر. تضاف العلاقات إضافية حسب الضرورة لعقد القلب في المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة تحوي ويروي القلب في 1 مل / دقيقة. فإن القلب استئناف الضرب على الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف من نظام الارواء ووضع القلب على المسرح المجهر. المرحلة ديه المحول الذي يسمح التدفئة للغرفة التي تحتوي على القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من محلول الارواء جسر الملك حسين في غرفة لغمر جزئي القلب. مراقبة درجة حرارة الغرفة عند 37 درجة مئوية. إزالة النفايات السائلة من الغرفة باستخدام مضخة تمعجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة سرعة مضخة تحوي تدريجيا لتوفير تدفق كاف (حوالي 2 مل / دقيقة) إلى القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة من الاستقرار، يروي هيئة التعليم العاليغ مع 10 ميكرومتر blebbistatin و100-500 نانومتر TMRM. وسوف تبطئ ضربات القلب بعد 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق ضغط لطيف على القلب للتأكد من ملامسة ضيق من القلب مع ساترة في الجزء السفلي من الغرفة، ومواصلة قمع ضربات القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع نفس الإجراء لتصوير عضلة القلب سليمة مبائر كما هو موضح في الخطوة 2.8 أعلاه. ضبط البؤري بعناية لتكشف أوضح صورة ممكنة. </li></ol> 4. معالجة الصور وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأدوات التي توفرها &quot;تحليل الفسيولوجية&quot; وحدة من البرنامج لتحليل واحد متحد البؤر الميتوكوندريا ومضات وغشاء التغييرات المحتملة. وغالبا ما تتضمن هذه الوحدة في صورة الحصول على البرمجيات لنظام متحد البؤر ويسمح تحديد مناطق معينة في الصورة وكذلك الناتج من كثافة مضان مع تسميات الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح قاعدة البيانات ثم ملف الصورة 2D المسلسل ليتم تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;المنطقةالاهتمام (ROI) يعني &quot;للتبديل إلى&quot; متوسط ​​رويس &quot;واسطة. انقر على&quot; المنطقة ذات الاهتمام (ROI) يعني &quot;للتبديل إلى&quot; يعني من رويس &quot;واسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف عرض من القنوات الأخرى باستثناء قناة cpYFP 488 نانومتر لاختيار ومضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكبير الصورة ويدويا نقل شريط الشريحة للعب الصور 2D المسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد واحد ومضات الفائق الميتوكوندريا من خلال تحديد موقع الموقع حيث الزيادات إشارة الفلورسنت عابر. استخدام أداة ROI مناسبة للاحتفال ومضات. وسوف تتبع تظهر تعتمد على الوقت تغير مضان من كل ROI تظهر بجانب الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اختيار كل ومضات، بدوره على عرض من القنوات الأخرى. تحديد العائد على الاستثمار على الصورة خارج الخلية لخلفية إشارة الطرح. إخراج متوسط ​​مضان من كل ROI جنبا إلى جنب مع التسميات الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل عدد من ومضات في كل من ملف صورة المسح المسلسل مع الوقت ومسح منطقةالخلية. استخدام Excel لحساب تردد فلاش كما عدد من ومضات في 100 ثانية / 1،000 ميكرون 2 مساحة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برنامج نموا العرف مكتوب في اللغة التفاعلية البيانات (IDL، ResearchSystems) لحساب المعلمات كل فلاش (السعة والوقت إلى الذروة ووقت تسوس). برامج IDL هو متاح تجاريا وبرنامج تطوير مخصصة لتحليل المعلمة فلاش يمكن الحصول عليها من المؤلف عند الطلب. </li></ol>

<ol>
	<li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium,+ATP,+and+ROS:+a+mitochondrial+love-hate+triangle.">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria. , (2008).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+heart+failure.">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li><li>Griffiths, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+heart+disease.">Mitochondria and heart disease.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Pieczenik, S. R., Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+molecular+pathways+of+disease.">Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease.</a> Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).</li><li>Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+utilization+for+calcium+uptake+and+force+production+in+different+types+of+human+skeletal+muscle+fibres.">ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 531, 393-403 (2001).</li><li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+human+heart.">Mitochondria in the human heart.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).</li><li>Lambert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+mitochondria.">Reactive oxygen species production by mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes.">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).</li><li>Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-targeted+fluorescent+probes+for+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).</li><li>Belousov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Flashes+in+Single+Mitochondria.">Superoxide Flashes in Single Mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li><li>Wei-Lapierre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+Contribution+of+Mitochondrial+Superoxide+and+pH+to+Mitochondria-targeted+Circularly+Permuted+Yellow+Fluorescent+Protein+(mt-cpYFP)+Flash+Activity.">Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity.</a> J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+superoxide+flash+and+metabolism-coupled+mitochondrial+permeability+transition+in+living+animals.">Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals.</a> Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+flashes:+metabolic+biomarkers+of+skeletal+muscle+activity+and+disease.">Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease.</a> FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).</li><li>Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+illuminating+new+insights+into+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).</li><li>Wei, L., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+SGP+symposium+on+mitochondrial+physiology+and+medicine:+mitochondrial+superoxide+flashes:+from+discovery+to+new+controversies.">Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies.</a> J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).</li><li>Johnson, I., Spence, M. T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.2.">Ch. 12.2.</a> The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 510-511 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+elemental+events+of+mitochondrial+ROS+signaling+in+the+heart.">Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes.">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).</li><li>Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+calcium+waves+and+redox+changes+precede+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+in+the+intact+heart+during+hypoxia+and+reoxygenation.">Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation.</a> Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

تصوير الأحداث الميتوكوندريا واحد في الحيوانات الحية أو الأجهزة perfused لديه ميزة كبيرة على الأساليب التقليدية لتقييم وظيفة الميتوكوندريا 17،19،21،22،24،25. تقنية الموضحة هنا يمكن أن يحقق في الوقت الحقيقي في تحديد الموضع وظيفة الميتوكوندريا في حالة فسيولوج?...

الميتوكوندريا تلعب دورا محوريا في الطاقة الحيوية الخلوية، مما يشير الى الجذور الحرة، الأكسدة التوازن، وتنظيم أيون، وتقرير مصير الخلية 1،2. ضعف الميتوكوندريا غالبا ما ترافق وراء التسبب في الأمراض 3-6. وخصوصا في النظم العضلات مثل القلب والعضلات والهيكل العظمي، ويوفر التنفس الميتوكوندريا غالبية ATP لدعم التنظيم في الوقت المناسب من الكالسيوم داخل الخلايا وقوية 7،8 تطوير القوة. هذه العضلات امتلاك عدد كبير من الميتوكوندريا التي غالبا ما تشغل ما يصل الى 20-40٪ من حجم الخلية الكلي و&quot;الثابتة&quot; بين لل myofilaments 2. على الرغم من العديد من الدراسات، فهمنا للتنظيم وظيفة الميتوكوندريا، وتحديدا في الجسم الحي، وتحت الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، محدودة. أحد الأسباب هو أن غالبية الطرق وضعت لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الاعتماد على vitro أو خارج الحي النهج، مثل مراقبة استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا المعزولة تستكمل مع ركائز مصطنعة، وغير المباشرة لتحديد وظيفة الميتوكوندريا من خلال التشكل (مثل الإلكترون المجهري)، نشاط انزيم (مثل النشاط أكونيتاز)، أو مستويات ATP داخل الخلايا 9-11 . مؤخرا، مؤشرات الفلورسنت جزيء صغير مع تخصيب الميتوكوندريا النسبية طبقت لتقديم لمحة عن إشارات الميتوكوندريا، بما في ذلك إمكانات غشاء، والكالسيوم وأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، في الخلايا سليمة 11-13. علاوة على ذلك، العديد من الأخضر بروتين فلوري (GFP) الأكسدة ومقرها وضعت مؤشرات لتحقيق ROS تقييم أكثر تحديدا من الأكسدة داخل الخلايا مجزأة أو ROS يشير 14-16. بين هذا، قمنا بتطوير مؤشر المشفرة وراثيا الفائق، ومبدل بروتين فلوري الصفراء دائرية، وtargeteد عليه في الميتوكوندريا (MT-cpYFP) 17. MT-cpYFP يمكن متحمس في 405 أو 488 نانومتر مع كل قمم الانبعاثات في 515 نانومتر. انبعاث في 488 نانومتر الإثارة تستجيب خصيصا لالفائق كما يتضح من السابق في التجارب المختبرية والمعايرة فيفو 17،18. يتم استخدام الانبعاثات في 405 نانومتر الإثارة كما الرقابة الداخلية (يرجى الرجوع إلى الشكل 1 من المرجع 17 للحصول على معلومات مفصلة عن الانبعاثات والإثارة أطياف MT-cpYFP في ظل ظروف مختلفة). مع مرور الزمن التصوير متحد البؤر، وهذا مؤشر يكشف انفجار الأحداث الإنتاج الفائق، واسمه ومضات الفائق، في الميتوكوندريا واحدة من الخلايا سليمة. يقدم الفائق فلاش بوصفها وظيفة مركب من التنفس الميتوكوندريا، المرفقة عابرة الميتوكوندريا الاستقطاب الغشاء وROS إنتاج 17-20. في الآونة الأخيرة، ونحن قد ولدت الأنسجة عموم MT-cpYFP الفئران المعدلة وراثيا باستخدام ناقلات تقوم تقنية-CAGGS-MT-cpYFP 17،19 C57/BL6 على خلفية والتحقق من اكسبريس قويةسيون من هذا المؤشر في قلب والعضلات والهيكل العظمي والأنسجة الأخرى (الشكل 2). فإن الفئران المعدلة وراثيا تكون متاحة للمحققين الأكاديمية المهتمة بناء على طلب وموافقة MTA من جامعة واشنطن. في هذه الدراسة، ونحن تصف الوضع الطبيعي من ومضات التصوير الفائق في قلب Langendorff perfused وكذلك في الجسم الحي التصوير من الأحداث فلاش في عضلات الهيكل العظمي من تخدير MT-cpYFP الفئران المعدلة وراثيا في 17،19. هذه التكنولوجيا تتيح رصد في الوقت الحقيقي للأحداث إنتاج ريوس الميتوكوندريا واحد في حالة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي أو 21،22. بل هو أيضا من المجدي استخدام نظام لرصد الأخرى المعلمات الميتوكوندريا واحد مثل غشاء المحتملة والكالسيوم مع مؤشرات الفلورسنت المناسبة. التقييم كذلك، في وقت واحد أو بالتوازي وظيفة الميتوكوندريا مع الأحداث داخل الخلايا (مثل العابرين الكالسيوم) أو وظيفة القلب (على سبيل المثال. جزء طرد) لا يمكن أن يتحقق. الاضطرابات المرضية، مثل نقص التروية وضخه، يمكن تطبيقها على قلب perfused لتقييم تأثير الإجهاد على وظيفة الميتوكوندريا واحدة في عضلة القلب سليمة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

الحبيبات الخيطية هي عضية داخل الخلايا الحرجة المسؤولة عن إنتاج الطاقة والإشارات بين الخلايا في أنظمة حقيقية النواة. ضعف الميتوكوندريا غالبا ما ترافق وتساهم في الأمراض التي تصيب البشر. وتستند غالبية المناهج التي تم تطويرها لتقييم وظيفة الميتوكوندريا واختلال وظيفي في المختبر أو على فيفو السابقين القياسات. والنتائج من هذه التجارب القدرة في تحديد وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي محدودة. هنا، نحن تصف الرواية التي تستخدم نهج متحد البؤر المسح المجهري للتصوير الأنسجة سليمة في aminals الحية، والذي يسمح للتقييم وظيفة الميتوكوندريا واحد بطريقة الوقت الحقيقي في الجسم الحي. أولا، نحن توليد الفئران المعدلة وراثيا معربا عن الميتوكوندريا المستهدفة مؤشر الفائق، مبدل دائري بروتين فلوري الصفراء (MT-cpYFP). يتم إصلاح MT-cpYFP تخدير الماوس على محول المرحلة حسب الطلب ويتم أخذ الصور الوقت الفاصل بين وROM عضلات الهيكل العظمي المكشوفة من hindlimb. وضحى الماوس في وقت لاحق ويتم تعيين ما يصل لقلب Langendorff نضح مع حلول فسيولوجية في 37 درجة مئوية. يتم وضع القلب perfused في غرفة خاصة على المسرح المجهر متحد البؤر ويتم تطبيق ضغط لطيف لشل حركة القلب وقمع ضربات القلب التي يسببها قطعة أثرية الحركة. تم الكشف عن ومضات الفائق من قبل في الوقت الحقيقي التصوير 2D متحد البؤر على تردد إطار واحد في الثانية الواحدة. الحل نضح يمكن تعديلها لاحتواء ركائز مختلفة التنفس أو مؤشرات الفلورسنت الأخرى. ويمكن أيضا نضح تعديلها لإنتاج نماذج مرض مثل نقص التروية وضخه. هذا الأسلوب هو نهج فريد لتحديد وظيفة واحدة في الحبيبات الخيطية أنسجة سليمة والحية.

وفقا لهذا البروتوكول، في الجسم الحي التصوير من الأحداث الميتوكوندريا واحد يمكن القيام به في عضلات الهيكل العظمي من الفئران تخدير تليها التصوير في الموقع perfused القلب (الشكل 1) في. سوف الإعداد الأمثل للظروف التصوير ضمان صور واضحة للأنسجة العضلات...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo at JoVE.com

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

يتم تطبيق متحد البؤر المسح المجهري لتصوير الأحداث الميتوكوندريا واحد في القلب perfused أو عضلات الهيكل العظمي في الحيوانات الحية. رصد في الوقت الحقيقي للعمليات الميتوكوندريا واحد مثل ومضات الفائق وغشاء التقلبات المحتملة يمكن تقييم وظيفة الميتوكوندريا في سياق ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وخلال الاضطرابات المرضية.

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

confocal-imaging-single-mitochondrial-superoxide-flashes-intact-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

14.5K Views.  University of Washington.  يتم تطبيق متحد البؤر المسح المجهري لتصوير الأحداث الميتوكوندريا واحد في القلب perfused أو عضلات الهيكل العظمي في الحيوانات الحية. رصد في الوقت الحقيقي للعمليات الميتوكوندريا واحد مثل ومضات الفائق وغشاء التقلبات المحتملة يمكن تقييم وظيفة الم...

Video: Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

إعداد ذبابة الفاكهة والتصوير الطولي من وظيفة القلب في فيفو باستخدام البصرية بالاتساق المجهري (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

القياس الكمي لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

تسليط الضوء على المؤلف: القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا  

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

القياس الكمي القائم على التألق لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق باستخدام التصوير المباشر في خلايا هيلا

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...