المؤلفان بالشكر شارمين حسين لنمو الفيلم الوقت الفاصل بين اسر من خلية عصبية غير ناضجة وDunfield ديريك للصور المجهر الإلكتروني لنصائح micromicropipette SCE.

معدات انشاء : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعدات الكهربائية اللازمة لهذه التقنية هي محفز ، الذبذبات ، حتى أن صاحب micropipette مزودة بسلك الفضة لإدراجها في micropipette. عادة ما نستخدم الأدوات أكسون Axoporator 800A مشجعا ، ولكن التحفيز والتشجيع المشتركة الأخرى مثل الصكوك غراس SD9 التحفيز والتشجيع هي أيضا مناسبة لوحيدة الخلية electroporation. توصيل منشط للheadstage ، والتي واجهات مع سلك كهربائي الفضة لتوضع داخل micropipette الزجاجية التي تحتوي على حل داخلي إجراء. توصيل تؤدي غيرها من منشط للمدخلات الذبذبات ، الذي يتلقى أيضا مدخلات من الأرض الخارجية الشرغوف. الأرض الشرغوف الخارجي هو مجرد اسلاك الفضة التي لا تزال على اتصال مع تيار كهربي خلال الشرغوف electroporation. اكتمال الدائرة مرة واحدة يتم وضع micropipette في اتصال مع الشرغوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحيد الخلية electroporation يتطلب المجهر مع مسافة عمل جيدة (على الأقل 5cm) ، لأن هذا يعطي مجالا للمناورة ويسمح في جلب micropipette بزاوية 30-45 درجة تقريبا. </li></ol> تلفيق micropipettes : إعداد micropipettes المناسب هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. وتكمن الصعوبة في تحقيق التوازن بين تلميح الضيقة (أقل من 1μm في القطر) مع واحد التي لن كسر بسهولة عندما ثقب الأنسجة. وقد وجدنا أيضا أن النصائح بزاوية تفتق أكبر من 10 درجة هي الأفضل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد micropipette الزجاج وسحبت التي يبلغ قطرها أقل من غيض من 1μm ، وزاوية تفتق غيض من أكبر من 10 درجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي مناسبة تماما الزجاج البورسليكات مع خيوط داخلية مع القطر الخارجي والداخلي قطرها 1.5mm 0.75mm من أجل هذا الغرض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زجاج سميك نسبيا يوفر درجة من الصلابة إلى الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خيوط الداخلي هو المهم في الرسم مرة أخرى مليئة السائل نحو غيض micropipette. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتلفيق من النصائح المناسبة وغالبا ما تتطلب تعديلات عدة على أساس النتائج الملاحظة. قد تتطلب الأنسجة المختلفة تلميح مع شكل مختلف قليلا أو القطر تلميح. </li></ol> وحيدة الخلية electroporation البروتوكول : للمستخدمين الجدد ، فإنه من المستحسن أن تبدأ مع الأصباغ الفلورية ديكستران منذ ذلك الحين ، على عكس البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا ، يمكن أن ينظر مباشرة تحت epifluorescence. استخدام الأصباغ الفلورية تمكن المستخدم من رؤية مباشرة من موقع الطرف micropipette داخل الأنسجة ، وبناء على ردود الفعل الفورية electroporation يعطي ما إذا كان قد تم تعيين بشكل صحيح حتى المعدات وعما إذا كان الطرف micropipette مناسبا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء micropipette مع حل المجمع ليكون electroporated إما باستخدام حقنة التحميل أو عن طريق ملء الخلفي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام الحمض النووي البلازميد ، وضمان أن العينات خالية من الذيفان الداخلي ، وعلى التركيز بين 1-2μg/ml ، الذي أعد في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي تركيز الأصباغ الفلورية ديكستران العزم تجريبيا. نحن غالبا ما تستخدم الأصباغ الفلورية المخفف في الماء ل300μM تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة ، وكميات من 1μl - 0.5 كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التحميل ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الحلول بسرعة عالية للحد من كمية الحطام في رسمها الجسيمات micropipette ، والتي قد تؤدي إلى انسداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقاعات الهواء داخل تلميح غالبا ما تؤثر على تدفق الحالية ، وينبغي أن طردتهم عبها بقوة micropipette قبل تصاعد على headstage. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج micropipette إلى صاحب المركبة أو headstage micromanipulator على 3 محاور. ضمان أن يتم إدخال سلك كهربائي في micropipette الفضة ، وعلى اتصال مع تيار كهربي الحل الداخلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الضفادع الصغيرة عن طريق الغمر في 0.02 ٪ MS - 222 (3 - أمينوبنزويك حمض إيثيل استر) التي أعدت في المتوسط ​​تربية الشرغوف (حل شتاينبرغ ، ودرجة الحموضة 7.4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم عادة مرحلة 44-48 البيضاء القيطم المورق الضفادع الصغيرة في تجاربنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعادة ما تكون الضفادع الصغيرة تخدير كامل بعد حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشراغف عدة في وقت واحد قد يكون تخدير للحد من الانتظار الوقت ، ومع ذلك ، وتجنب التعرض لMS - 222 لفترات تتجاوز 1 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرغوف تخدير واحد لغرفة electroporation باستخدام micropipette نقل من البلاستيك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن تكون الغرفة التي electroporation بسهولة في المنزل من خلال تجويف نحت على شكل الشرغوف في Sylgard ® سيليكون صغيرة الكتلة ، وإدخال سلك الأرض الفضة في تجويف هذه أنه سيكون على اتصال مع تيار كهربي الشرغوف في الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبلل موقف الجانب الظهري الشرغوف حتى باستخدام فرشاة الرسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض micropipette حتى أنه في تماس مع الجلد ، المتاخمة مباشرة للمنطقة من الفائدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تستهدف المناطق ذات أجسام الخلايا المكتظ زيادة كبيرة في فرص نجاح electroporation.نحن الهدف عادة سقف الشرغوف البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب micropipette في بزاوية 30 إلى 45 درجة. ضحالة مسارات جعل ثقب الجلد أكثر صعوبة ، في حين كثيرا ما تعوق انحدارا زوايا عرض واحد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يخفض استمرار micropipette رصعة في الجلد في البداية ، ثم تمر عبر في النسيج الأساسي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويفضل الخلايا السطحية للتصوير في الجسم الحي ، ويمكن أن تكون مستهدفة من خلال ضمان أن يتم تخفيض رأس micropipette ببطء على التنقير من الجلد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي للمرء أن يرصد باستمرار المقاومة micropipette توضع مرة واحدة داخل الأنسجة. إذا باستخدام 800A Axoporator (أكسون صكوك) ، المقاومة ما يقرب من 10 40MΩ هي الأمثل. المقاومة هي مؤشر جيد على ما إذا كان القطر تلميح غير مناسبة وحيدة الخلية electroporation. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاومات micropipette عالية (&gt; 100MΩ) تدل على نصائح أو انسداد micropipettes مع النصائح التي هي ضيقة للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاومات micropipette منخفضة (&lt;10MΩ) تدل على أن الطرف قطرها كبير جدا ، وغالبا نتيجة لطرف المكسور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام منشط لا توفر مقياسا المقاومة مباشرة ، ويمكن قياسها بشكل غير مباشر من خلال مراقبة micropipette المقاومة اتساع النبضات الجهد يقاس الذبذبات (مناقشته أدناه). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق تدريب الجهد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لDNA البلازميد والقطارات وجدت النبض لتكون أكثر فعالية تتكون من نبضات موجة سلبية في مربع 1ms المدة ، وألقيت في 300Hz مع فترة تدريب نبض 500ms. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد مثل هذا الجهد نبض تجريبيا أن السعة من البقول قياس الذبذبات على ما بين 0.75 و 1.5μA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لديكستران الأصباغ الفلورية ، يتم تسليم إيجابية البقول موجة مربعة لمدة 300μs على تردد 300Hz مع فترة تدريب نبض 10ms. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو الحال مع بروتوكول للالحمض النووي ، ويتم تحديد مثل هذا الجهد نبض تجريبيا أن السعة من البقول قياس الذبذبات على ما بين 0.75 و 1.5μA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إجراء تعديلات إضافية لتحفيز المعلمات على أساس مراعاة نتائج electroporation تحت epifluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الخلايا electroporated تظهر قاتمة ، ينبغي المعلمات نبض تدريجيا حتى تظهر الخلايا أكثر إشراقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من ناحية أخرى ، إذا وصفت مجموعات من الخلايا ، ينبغي تخفيض المعلمات نبض حتى تتم تسمية الخلايا واحد. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع micropipette ، في موقع مختلف داخل النسيج إعادة إدراج ، وتطبيق تدريب الجهد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحسين الإنتاجية ، ونحن عادة electroporate مواقع متعددة في كل من نصف الكرة سقف البصري الشرغوف مع تباعد كافية لضمان أن الخلايا المسمى لا تتداخل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرغوف electroporated في وعاء مع الحل للتربية شتاينبرغ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف يتعافى بسرعة من الضفادع الصغيرة التخدير في غضون دقائق قليلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن استخدام نفس micropipette الشراغف عديدة. ومن المهم أن نلاحظ باستمرار اتساع النبضات الملاحظة على الذبذبات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت السعة نبض لا يزال منخفضا بعد زيادة كبيرة في شدة النبضة هذا من المحتمل أن يكون نتيجة لانسداد تلميح يجري ، غالبا ما ينظر إليها عند electroporating الشراغف كثيرة في جلسة واحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك طريقة لطرد a تسد طرف القاصر لتطبيق نبضة واحدة ايجابية بعد إدراج micropipette في الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لا يمكن أن تسد فكها ، أو انسداد يتكرر في كثير من الأحيان ، استبدال micropipette. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان لا يزال نبض السعة الكبيرة جدا بعد انخفاض كبير في المعلمات نبض ، وهذا هو إشارة إلى أن الطرف قد كسر ويحتاج إلى استبداله. </li></ol></li></ol> الكشف عن خلايا electroporated بنجاح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد electroporation ، يتم فحص لخلايا الشراغف المسمى باستخدام المجهر تستقيم epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة من الأصباغ الفلورية ، قد يتم فرزهم الشراغف بعد اقل من 30 دقيقة بعد electroporation. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد وجدنا ، مع ذلك ، أن ترتبط فترات أطول مع انخفاض مستويات مضان الخلفية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات الفلورية للترميز وراثيا ، ويجرى الفحص عادة 12 ساعة على الأقل بعد electroporation. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأعرب عن الخلايا البروتينات الفلورية الاستمرار في الحصول على اكثر اشراقا مع مرور الوقت ، وبالتالي قد تكون الخلايا قاتمة اعادة فرزهم بعد فترة من 12-24 ساعة إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تخدير الضفادع الصغيرة على النحو الموصوف أعلاه ، وضعت في غرفة ® Sylgard وcoverslipped. ثم يتم فحص الشراغف الفردية بموجب epifluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علما أن التعرض المفرط لضوء epifluorescence سينتج الضيائية التي قد تقتل الخلية المسمى. لذلك ، تقليل مقدار الوقت الذي تتعرض الخلايا لضوء الفلورسنت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى حاوية مع الشراغف حل للتربية شتاينبرغ. </li></ol>

<ol>
	<li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules.">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).</li><li>Dunfield, D., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation.">Single cell electroporation.</a> Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , .</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li></ol>

وحيدة الخلية electroporation (SCE) هو أداة قوية لتحديد وظائف الجينات وأداء التلاعب الجيني المستهدفة. الشفافية في الشرغوف البيضاء وسهولة الحصول على الدماغ تجعل هذا النظام نموذجا مثاليا لنمو الخلايا العصبية وتصور الأحداث داخل الخلايا كائن حي. SCE يسمح التصور من نمو الخلايا العصبية واحد ، و...

single cell electroporation in vivo within the intact developing brain

وحيدة الخلية electroporation (SCE) هي تقنية متخصصة تسمح للتسليم الحمض النووي أو غيرها من الجزيئات في الخلايا الفردية داخل الأنسجة سليمة ، بما في ذلك الأعمال التحضيرية الجسم الحي. ميزة متميزة من هذه التقنية قد يتم تنفيذ هذا التلاعب التجريبية على الخلايا الفردية بينما تترك الأنسجة المحيطة دون تغيير ، وبالتالي التمييز بين الخلايا من آثار الحكم الذاتي تلك الناجمة عن العلاج العالمية. عند دمجها مع تقنيات التصوير المتطورة في الجسم الحي ، SCE علامات الفلورسنت تصاريح التصوير المباشر للمورفولوجيا الخلوية ، ونمو الخلايا ، والأحداث داخل الخلايا على فترات زمنية تتراوح ما بين ثانية لأيام. بينما يتم استخدام هذه التقنية في مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية في فيفو فيفو والسابقين ، ونحن هذا الأسلوب الأمثل لاستخدامها في الشراغف القيطم المورق. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن من التفصيل الداخلي لSCE صبغة الفلورسنت أو DNA البلازميد في الخلايا العصبية في الدماغ سليمة من الشرغوف القيطم البيضاء. نناقش أيضا أساليب لتحسين الإنتاجية ، وتبين الأمثلة التصوير ثنائي الفوتون مضان يعيش من الخلايا العصبية التي fluorescently المسمى SCE.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain at JoVE.com

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

وحيدة الخلية electroporation (SCE) هي تقنية متخصصة تسمح تسليم الحمض النووي أو غيرها من الجزيئات في الخلايا الفردية داخل الأنسجة سليمة ، بما في ذلك الأعمال التحضيرية الجسم الحي. نحن هنا من التفصيل الداخلي لSCE صبغة الفلورسنت أو DNA البلازميد في الخلايا العصبية في الدماغ سليمة من الشرغوف القيطم المورق.

وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

single-cell-electroporation-in-vivo-within-the-intact-developing-brain

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Views.  University of British Columbia - UBC. وحيدة الخلية electroporation (SCE) هي تقنية متخصصة تسمح تسليم الحمض النووي أو غيرها من الجزيئات في الخلايا الفردية داخل الأنسجة سليمة ، بما في ذلك الأعمال التحضيرية الجسم الحي. نحن هنا من التفصيل الداخلي لSCE صبغة الفلورسنت أو DNA البلازميد في الخلايا العصبية في الدماغ سليم...

Video: Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation من مايكوباكتيريا

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

Electroporation في الجسم الحي وخارج الرحم للتعبير الجينات في خلايا الشبكية العقدة ماوس

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ترنسفكأيشن الحمض النووي لعضلات الهيكل العظمي باستخدام الثدييات في فيفو Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...