وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة على جائزة تنمية عالم السريرية K08NS002083، وهو معهد بحوث Shervert فرايزر غرانت، وجائزة الباحث الشاب NARSAD لإدغار A. BÜTTNER.

1. التنموية تأخير / الفتك الفحص: البرية من نوع (N2) واثنين من المسخ (Mut1 وMut2) سلالات يتم اختبارها في ثلاثة تركيزات كلوزابين في لوحة 12 جيدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 1، صب 2 مل NGM المتوسطة 10 في كل بئر من لوحة 12 جيدا (كل جيدا مع 2 سم القطر) والسماح لتتصلب على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها. في اليوم نفسه، واختيار مستعمرة من البكتيريا الإشريكية القولونية OP50، تصيب زجاجة من 50 مل LB الحل، والثقافة في شاكر 37 درجة مئوية في 220 دورة في الدقيقة التناوب بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 2، ونقل 20 ميكرولتر OP50 ثقافة البكتيرية على مركز كل NGM جيدا. احتضان لوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية أو تركهم في RT بين عشية وضحاها للسماح للبكتيريا أن تنمو في الحديقة سمكا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء 80 ملي حل الأسهم كلوزابين عن طريق إذابة كلوزابين في DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل) المذيبات. ثم تقديم حل العمل 80 ميكرولتر مع الحل الأسهم المخفف في 1.7 ملي حمض الخليك باسعد على الجدول 1. ملاحظة: يجب تحديد الحل يعمل لدواء معين من الاهتمام من خلال القيام بسلسلة من الاختبارات الأولية للعثور على تركيز تركيز الأنسب للتمييز بين النوع البري من المسوخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 80 ميكرولتر حل كلوزابين العمل على لوحة NGM المصنفة جيدا ودوامة لوحة للسماح الحل لتوزيعها بالتساوي على السطح. انتظر لوحة لتجف. استخدام لوحة للفحص في نفس اليوم أو وضعها في حاضنة 20 درجة مئوية لاستخدامها في اليوم التالي. ملاحظة: الحل هو تعليق العمل المخدرات بسبب ذوبان منخفضة من كلوزابين، وخصوصا في أعلى تركيز. وبالتالي، دوامة أنبوب قبل نقل الحل إلى لوحة المخدرات من أجل ضمان أن تركيز الدواء دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الديدان قبالة 3.5 سم لوحة تحتوي على الكثير من البالغين مع العازلة M9 حامل ثم تدور عليهم في أنبوب 15 ملفي 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف. إضافة 5 مل حل التبييض (هيدروكسيد الصوديوم: هيبوكلوريت: [ده 2 O في 4:01:05) وتعطيل الديدان الخيطية التي كتبها قلب بلطف الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الحيوانات حتى تذوب نصفهم في حوالي 5 دقائق. تدور باستمرار البيض في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وإضافة 14 مل العازلة M9 بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار البيض في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة، ونضح طاف، وترك حوالي 100 ميكرولتر حل. دوامة بتعليق البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيض 2 ميكرولتر معلقة في M9 على طبق من ذهب NGM العادية لاختبار مدى العديد من البيض يتم نقلها. ضبط حجم البيض مع وقف التنفيذ لضمان أن هناك ما يقرب من 30-35 من البيض في كل عملية تحويل. نقل 30-35 البيض إلى كل بئر من لوحة الفحص، ومن ثم احتضان في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم الأول من الفحص، يسجل عدد البيض فقس. ضبط عدد من الحيوانات تحاك ل25/well بواسطة pickiنانوغرام من الديدان إضافية إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأيام التالية، ومراقبة الحيوانات ويسجل لهم كل 24 ساعة. وسجل مرحلة تنموية استنادا إلى حجم الحيوان وشكل الفرج 11. التجربة يدوم 5-6 أيام مع تأثير أقوى ينظر عادة في اليوم الثالث أو الرابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال البيانات إلى ملف إكسل وحساب النسبة المئوية للحيوانات في كل مرحلة تنموية لكل يوم من التجربة. توليد الرسوم البيانية مع وظيفة &#39;100٪ مرصوف العمود &#39;في &#39;2-D العمود&#39; القائمة. </li></ol> 2. البلعوم الضخ الفحص: يونغ الحيوانات الكبار لمن نوع البرية والمسخ سلالات وسجل على لوحات الفحص كلوزابين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء فحص لوحة باتباع نفس البروتوكول المستخدم للالتنموية تأخير / الفتك الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 50 الحيوانات L4 لكل سلالة لوحات NGM المصنفة 24 ساعة قبل الفحص واحتضان الديدان عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 10 الحيوانات إلى أساذ لوحة جيدا. ثم اختيار 10 الحيوانات إلى البئر كل 15-20 دقيقة المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تعرضت الحيوانات في أول بئر للمخدرات لمدة 30 دقيقة، يبدأ الفحص من خلال مراقبة ضخ البلعوم تحت المجهر تشريح ويسجل مضخات لمدة 20 ثانية 9. مرة واحدة وسجل البلعوم الضخ، واختيار دودة قبالة لوحة. </li></ol>

<ol>
	<li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition.">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+(PI3K)/insulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li><li>Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease.">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li><li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors.">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+effects+of+clozapine:+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus.">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li><li>Saur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans+Identifies+the+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Subunit+ACR-7+as+an+Antipsychotic+Drug+Target.">A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target.</a> PLoS Genet. 9, (2013).</li><li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).</li><li>Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans.">Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).</li><li>Kage-Nakadai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+very+long+chain+fatty+acid+acyl-CoA+synthetase+genes,+acs-20+and+acs-22,+have+roles+in+the+cuticle+surface+barrier+in+Caenorhabditis+elegans.">Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه لا يوجد صراع المصالح المعنية.

هنا، نحن تصف أساليب لاختبار آثار APDS على تطوير وسلوك C. ايليجانس. يستخدم DMSO الإيثانول أو حل كلوزابين، منذ المخدرات غير قابل للذوبان في الماء نسبيا. لأن تم الإبلاغ المذيبات تؤثر C. ايليجانس البيولوجيا 12، DMSO بذاتها أو مجموعات المراقبة الإيثانول وحدها ضرور...

انواع معينة ايليجانس هو كائن الوراثية بسيطة قابلة للشاشات الوراثية إلى الأمام وعكس نطاق واسع وشاشات جينية الكيميائية. C. ايليجانس حساس لمجموعة واسعة من المركبات النشطة بيولوجيا وبالتالي تم استخدامها بنجاح لتحديد آليات العمل من مجموعة متنوعة من هذه المركبات. على سبيل المثال، ودرس المركبات الحيوية النشطة باستخدام علم الوراثة الدوائي تشمل دودة منبهات مستقبلات الأستيل كولين (على سبيل المثال الليفاميزول، النيكوتين، morantel، وبيرانتيل)، ومواد التخدير (مثل هالوثان)، والكافيين، مثبطات الكولين (مثل الألديكارب، انيت، وترايكلورفون)، الفلورايد، ذات الصلة GABA مركبات (مثل GABA وmuscimol)، بالإيفرمكتين، الباراكوات، استرات phorbol، والعقاقير ذات الصلة السيروتونين (مثل السيروتونين وimiprimine) 3. وعلاوة على ذلك، C. وقد استخدم ايليجانس للشاشات جزيء صغير على نطاق واسع، مما يتيح اكتشاف مجمع النشطة بيولوجيا جديدةق وتحديد الأهداف الوراثية الرواية 4. وC. يتضمن ايليجانس الجينوم المخدرات المحتملة المضادة للذهان (APD) أهداف المحفوظة في البشر، بما في ذلك الجينات ترميز البروتينات اللازمة لتخليق العصبي وللهيكل متشابك وظيفة 5. وبالتالي، C. ايليجانس neurogenetics وأساليب العرض بيولوجيا الأعصاب لاكتشاف الآليات الجزيئية الرواية عمل APDS. في الديدان الخيطية، والتعرض الهادئ في التنمية في وقت مبكر ينتج تأخر في النمو، وبتركيزات أعلى، الفتك 2،6. APD التعرض خلال مرحلة البلوغ وتنتج الظواهر السلوكية. على سبيل المثال، والتعرض كلوزابين يمنع تحرك والبلعوم الضخ ويعزز وضع البيض 1،2،7. تأخر في النمو الهادئ التي يسببها والفتك هي الظواهر قوية لشاشات الجينية الكيميائية على نطاق واسع. هذه الظواهر معقدة بقدر ما أنها من المرجح أن يكون أكثر من واحد باسيل الخلوية والجينيةق. لذلك، من المتوقع أن تسفر عن مجموعة متنوعة من الأهداف المخدرات غير المباشرة مثل شاشات الوراثية. ومع ذلك، فقد أجرى مختبرنا شاشات الجينات مرشح وشاشة رني الجينوم على نطاق لالمكثفات من تأخر في النمو الهادئ التي يسببها والفتك وتعافى الجينات التي من المرجح ترميز أهدافا مباشرة، بما في ذلك الدوبامين، الأنسولين، ومستقبلات أستيل النيكوتين 2،8 بنجاح. وقد أدت الشاشات الجينية على أساس السلوكيات الهادئ التي يسببها في الكبار أيضا إلى تحديد الأهداف الهادئ الرواية، ونحن الآن التحقق من صحة الأهداف من على شاشات كلا التنموية والسلوكية في الثدييات 7. وبالتالي، وهو نهج الجينية الكيميائية اللافقارية لاكتشاف الآليات الجزيئية الرواية عمل APDS يبدو أن ذلك ممكنا 5،8. وC. ايليجانس البلعوم هو الجهاز الذي يضم 20 الخلايا العصبية، الخلايا العضلية 20، و 20 خلايا الإكسسوارات، وملفوفة بواسطة غشاء الطابق السفلي. مماثلة لقلب الثدييات، البلعوم هو الحكم الذاتي لالثانية مضخات باستمرار الغذائية في البيئة الخارجية من 9. تثبيط معدل ضخ البلعوم التنازلات امتصاص المواد الغذائية، وبالتالي الطفرات أو الأدوية التي تمنع ضخ البلعوم سبب تأخر في النمو أو اعتقال 9. APDS تمنع معدل ضخ البلعوم، وهو ما يمثل في جزء منه لآثارها على التنمية والجدوى 1،2. هنا، ونحن نستخدم APD كلوزابين شاذة كمثال لإثبات فحوصات المخدرات للتنمية الديدان الخيطية والبلعوم الضخ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>Clozapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6305</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetic acid (HAC)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2401</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-13</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">425044</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:236px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:200px;">5810 000.017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:188px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:200px;">M1246-0006</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:236px;">Low temperature incubator 815</td>
			<td style="width:188px;">Precision Scientific</td>
			<td style="width:200px;">J1790-1B</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:188px;">Olympus</td>
			<td style="width:200px;">SZX12</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:236px;">Petri dish 35 x 10 mm</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:200px;">NC9434271</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:236px;">12-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:188px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:200px;">REF 353043</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans

انواع معينة ايليجانس هو كائن الوراثية بسيطة قابلة للنطاق واسع إلى الأمام وعكس شاشات الجينية والوراثية شاشات الكيميائية. وC. يتضمن ايليجانس الجينوم المخدرات المحتملة المضادة للذهان (APD) أهداف المحفوظة في البشر، بما في ذلك الجينات ترميز البروتينات اللازمة لتخليق العصبي وللهيكل متشابك وظيفة. التعرض الهادئ ينتج تأخر في النمو و / أو الفتك في الديدان الخيطية بطريقة تعتمد على التركيز. هي سبب هذه الظواهر، في جزء منه، من خلال تثبيط الهادئ الناجم عن ضخ 1،2 من البلعوم. وبالتالي، فإن النمط الظاهري التنموية لديها أساس العصبية والعضلية، مما يجعلها مفيدة للدراسات pharmacogenetic من الذهان. نحن هنا لشرح الإجراءات التفصيلية لاختبار آثار الهادئ على التنمية الديدان الخيطية والبلعوم الضخ. لفحص التنموية، وتوضع الأجنة متزامنة على الديدان الخيطية متوسطة النمو (NGM) لوحات تحتوي على APDS، ومراحل تطوير العانيثم يتم تسجيل ملس اليومية. لفحص معدل ضخ البلعوم، نظموا يتم اختبار الحيوانات البالغة الشباب على لوحات NGM تحتوي على APDS. يتم تسجيل عدد من مضخات البلعوم في وحدة الزمن، ويتم حساب معدل الضخ. هذه المقايسات يمكن استخدامها لدراسة العديد من أنواع أخرى من الجزيئات الصغيرة أو حتى الجزيئات الكبيرة.

1. تأخر في النمو / الفتك نتيجة الفحص و1B أظهر نتيجة نموذجية للالتنموية تأخير / الفتك مقايسة في أرقام 1a و. عندما نمت البرية من نوع الحيوانات في السيطرة على المجموعة إلى مرحلة الكبار حامل (الشكل 1A)، من نوع الحي...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

وأظهرت النهج لاختبار آثار العقاقير المضادة للذهان (APDS) في انواع معينة ايليجانس. وصفت فحوصات لاختبار آثار المخدرات على التنمية وقدرتها على البقاء وعلى معدل ضخ البلعوم. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتجارب pharmacogenetic مع فئات أخرى من المخدرات APDS أيضا.

أساليب لدراسة آليات عمل المضادة للذهان من أدوية في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

methods-for-studying-mechanisms-action-antipsychotic-drugs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

11.4K Views.  Harvard Medical School.  وأظهرت النهج لاختبار آثار العقاقير المضادة للذهان (APDS) في انواع معينة ايليجانس. وصفت فحوصات لاختبار آثار المخدرات على التنمية وقدرتها على البقاء وعلى معدل ضخ البلعوم. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتجارب pharmacogenetic مع فئات أخرى من المخدرا?...

Video: Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

على الفحص لقياس آثار الإيثانول على سرعة تحرك من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

رواية مقاييس لوصف الجنينية الاستطالة للنيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

ا<em&gt; كاينورهابديتيس ايليجانس</em&gt; الوضع الغذائي القائم على النحاس النفور الفحص

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

تصوير العمود الفقري التغصني في Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...