وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (U54CA143906 لKGP، OJTM وR01HL101972 لOJTM) ومؤسسة أبحاث أوريغون الطبية جائزة الباحث السريرية المبكرة (KGP). OJTM هو محقق جمعية القلب الأمريكية تأسست (13EIA12630000). نشكر الدكتور اريك اندرسون من معهد السرطان فارس لإعداد عينات الخلايا المستخدمة في هذا العمل.

1. المجهر المواصفات لتنفيذ التصوير في الأزياء الصحيح ينبغي أن يكون المجهر المواصفات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتلك كل من النقيض تدخل الفرق (DIC) وbrightfield (BF) التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لديها حركة ض محور الكمبيوتر التي تسيطر عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هل لديك توقف الفتحة قابل للتعديل لتغيير عدسة مكثف الفتحة العددية. مطلوب فتحة مع قاعدة متدرج أو قراءات الإلكترونية لمعرفة قيمة الفتحة العددية. الفتحة العددية ينبغي أن تتراوح بين 0.1 لتصل إلى 0.9 NIQPM (أو أعلى) لHTDIC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون المجهر الضيقة مرشح الفرقة اللون لاستخدامها للتصوير حقل مشرق. مطلوب هذا الفلتر لإصلاح الزيادة الانكسار والتصدع التي تعتمد على الطول الموجي تستخدم لتحويل المرحلة إلى كثافة الكتلة لNIQP. </li></ol> 2. الفرق التدخل التباين (DIC) اقتناء Z-كومة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح SlideBook البرمجيات والثانية إنشاء شريحة جديدة لجمع الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، فتح نافذة التركيز. تحت المقطع تصفية مجموعة، حدد مدينة دبي للإنترنت. على علامة التبويب نطاق، ضمن المقطع المكثف، وضبط شريط الانزلاق فتحة إلى أبعد الموقف الصحيح (فتح كل وسيلة). وهذا يوفر عالية العددية فتحة إضاءة ويعزز باجتزاء الضوئية للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على عينة باستخدام الهدف DIC. ضبط كثافة مصابيح الهالوجين حتى هو عينة مرئية بسهولة. لضمان عدم المشبعة الكاميرا، حدد علامة التبويب كاميرا في نافذة التركيز والتحقق من أن الرسم البياني للكثافة بكسل ضمن مجموعة ديناميكية من الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح نافذة التقاط الصور. في قسم التقاط نوع، حدد المربع 3D. في قسم التقاط 3D، وحدد المدى حول مركز والعودة إلى الموقع الحالي </stronز&gt; صناديق وتحديد نطاق Z-الاتجاه، عدد من الطائرات، وحجم الخطوة. مجموعة Z-الاتجاه ينبغي أن تتضمن العينة بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المقطع تصفية مجموعة من نافذة التقاط الصور، والتحقق من مربع مدينة دبي للإنترنت، وتحديد مدة التعرض. في قسم معلومات الصورة، اسم الصورة (اختياري)، واختر بدء لبدء التصوير. </li></ol> 3. حقل مشرق (BF) اقتناء Z-كومة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد الانتهاء من جمع المجهر DIC Z-كومة من العينة، وفتح نافذة التركيز وحدد فتح تحت المقطع تصفية مجموعة. ضبط شريط الانزلاق فتحة إلى أبعد الموضع الأيسر (مغلقة كل وسيلة) لتوفير الإضاءة المنخفضة NA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير فلتر المجهر ضوء مسار إلى اللون الأخضر. ضبط كثافة مصابيح الهالوجين حتى هو عينة مرئية. ضمان عدم وجود تشبع الكاميرا عن طريق تحديد <stرونغ&gt; علامة التبويب كاميرا في نافذة التركيز والتحقق من أن الرسم البياني للكثافة بكسل ضمن النطاق المحدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح نافذة التقاط الصور. سوف يتم عرض إعدادات التقاط 3D من اكتساب Z-كومة مدينة دبي للإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المقطع تصفية مجموعة من نافذة التقاط الصور، والتحقق من المربع فتح وتحديد مدة التعرض. في قسم معلومات الصورة، اسم الصورة (اختياري)، واختر بدء لبدء الحصول على الصور Z-المكدس. </li></ol> 4. تصدير Z-كومة الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح التقاط Z-المكدس. تغيير طريقة العرض إلى 100٪. ضبط الرسم البياني لقيم بكسل ليتم عرضها بين 0 و قيمة بكسل كحد أقصى للكاميرا (4،095 الكاميرات لمدة 12 بت، 16 بت ل65،535). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر عرض&gt; تصدير&gt; سلسلة TIFF. وهذا تصدير Z-مكدس على شكل سلسلة من الصور TIFF(واحد لكل طائرة Z). حفظ سلسلة TIFF في مجلد منفصل مع اسم له تسطير في نهاية (أي &quot;مدينة دبي للإنترنت المكدس 1_&quot;). كرر هذا مع كل DIC أو BF Z-المكدس. </li></ol> 5. حجم القياسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج MATLAB HTDIC بعنوان &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت القسم 0 برنامج HTDIC، تحديث متغير الدليل التبعيات. نسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على الملفات وhilbert_transform_dic.m sobel_edge_detect.m من المستكشف (PC) في بين علامات الاقتباس المفردة التالية &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 برنامج JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في القسم 1، تحديث &quot;images_directory&quot;. مرة أخرى، ونسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على الصور من خلال التركيز في. شكل معرض طرابلس في بين علامات الاقتباس المفردة. فقط RUN القسم 1 مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحاذاة وتناوب الصور لهيلبرت تحويل تشغيل القسم 2 من التعليمات البرمجية. سوف يظهر مربع حوار بعنوان &quot;تعريف HTDIC معلمات&quot; تظهر. خمسة numbeويطلب من المستخدم التمرير: عدد البؤري حيث الصورة DIC من العينة هو في التركيز، القرار الوحشي (ميكرون / بكسل في الصورة)، القرار المحوري (هذا هو 0.1 لالتقاط صور في 0.1 ميكرومتر الخطوات المحورية)، زاوية دوران الصورة DIC اللازمة لأداء هيلبرت تحويل والقيم النموذجية هي 45 و -135. أخيرا، يدخل المنطقة من حجم الفائدة، وتحدد هذه المعلمة طول الجانب من المربع الذي سيظهر لاحقا - هو القيمة النموذجية 400. انقر فوق موافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصورة من مدينة دبي للإنترنت البؤري المحدد من قبل عدد البؤري تظهر مع الصندوق الأزرق. ضع مربع عبر ميزة من الفائدة، مثل خلية. مربع لا يلزم أن يكون مربع. مرة واحدة وقد تم وضعه في مربع فوق المنطقة المطلوب، انقر مرتين داخل منطقة الجزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وشخصية أخرى تظهر الآن: يحتوي هذا الرقم على الصورة التي تم اقتصاصها واستدارة في المنطقة ذات الاهتمام المحدد في الخطوة السابقة. وينبغي أن يكون على النقيض من الصورة مثلالميزات التي تظهر داكنة على اليسار بينما تظهر ملامح مشرقة على اليمين. اسحب المربع الأزرق على المنطقة من الفائدة، وإعادة تشكيل الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم 3 يولد قناع لالمكعب ض المكدس. هناك نوعان من الأقنعة المتاحة: قناع مستطيل لإنشاء مستطيل حول الخلية وأداة اليد خالية من لمخطط خلية من الفائدة باليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء قناع مستطيل، خط حرر 167 و 170 تعليق الخط (خط التعليق من خلال وضع &quot;٪&quot; في بداية هذا السطر). تنفيذ المادة 3 من البرنامج. انقر في الصورة واسحب الماوس لبدء تحديد قناع مستطيل. انقر مرتين على مربع لقبول ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء قناع مرسومة باليد، تعليق خط 167 وخط 170 وتنفيذ حرر القسم 3. انقر ورسم القناع المطلوب مع الماوس. انقر مرتين على القناع لقبوله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم تشغيل 4to بناء هيلبرت تحول مدينة دبي للإنترنت صورة المكدس والمقابلة DIC صورة كومة من مجال الاهتمام.سيتم تطبيق قناع شيدت في القسم 3 إلى هيلبرت تحويل مدينة دبي للإنترنت وكومة كومة مدينة دبي للإنترنت العادية عند تعيين &quot;maskON&quot; إلى 1 في السطر 179. ووضع &quot;maskON&quot; ل0 بناء مداخن صورة دون تطبيق القناع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل القسم 5 لتحسين تجزئة صورة XZ عبر الصور المقطعية المنطقة من الفائدة. الرقم 500، التي تنتجها البرنامج، يظهر عرض ثلاثة أنواع مختلفة من التباين. نجاح خوارزمية لإيجاد حدود الخلية وتعتمد على مزيج من قناع المستخدمة وقيمة &quot;العتبة&quot; في سطر 229 من البرنامج. تبدأ بقيمة 0.5. ضبط قيمة العتبة وإعادة تشغيل هذا القسم من البرنامج حتى يتم تحقيق مخطط تفصيلي السليم في واحدة من الأعمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الخطوط العريضة أفضل في العمود 1، استخدم القسم 6 لتحديد حجم الصورة باستخدام DIC تجزئة. إذا العمود 2 أعطى أفضل النتائج، قم بتشغيل القسم 7 لتحديد حجم الخلية من صور مدينة دبي للإنترنت هيلبرت تحول. إذا العمود 3 غافه على أفضل النتائج، قم بتشغيل القسم 8 لتحديد حجم استخدام فورييه تصفيتها-هيلبرت تحول الصور، مدينة دبي للإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويرد حجم يقاس من العينة، التي أعلن عنها في ميكرون مكعب (فلوريدا) في عنوان الشكل 600، 700، 800 أو ينتجها البرنامج اعتمادا على اختيار قياس مستوى الصوت. </li></ol> 6. القياسات الشامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج MATLAB NIQPM بعنوان &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت القسم 0 برنامج NIQPM، وتحديث الموقع من ثلاثة الدلائل اللازمة لتشغيل البرنامج. هذه هي &quot;dependencies_directory&quot;، و &quot;brightfield_directory&quot;، و &quot;dic_directory&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، تشغيل الفرع 1. هذا القسم من التعليمات البرمجية يولد المجال مشرق صورة مكعب من حقل كامل من مجموعة كاملة من الصور. فقط RUN القسم 1 مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، تشغيل القسم 2. سوف يظهر مربع حوار بعنوان &quot;تعريف NIQPM معلمات&quot; تظهر. ويطلب أربعة أرقام من المستخدم: الرقم البؤري حيث الصورة حقل مشرق للعينة هو في التركيز، القرار الوحشي (ميكرون / بكسل في الصورة)، القرار المحوري (هذا هو 0.1 لالتقاط صور في 0.1 ميكرومتر الخطوات المحورية)، ومنطقة حجم الفائدة، وتحدد هذه المعلمة طول الجانب من المربع الذي سيظهر لاحقا - قيمة نموذجية هو 200. انقر فوق موافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف صورة البؤري حقل مشرق المحدد من قبل عدد البؤري تظهر مع الصندوق الأزرق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الصورة ليست في التركيز، انقر مرتين في القسم باعادة 2 المربع الأزرق و، تأكد من ضبط عدد البؤري في مربع الحوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الصورة هو في التركيز، اسحب مربع أزرق حول الصورة وتغيير حجمها عن طريق تحديد العقد من منطقة الجزاء، وسحبها عند الضرورة. وضع مربع حول ميزة من الفائدة، مثل خلية. مربع لا يلزم أن يكون مربع. انقر مرتين داخل منطقة الجزاء لقبوله. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، تشغيل القسم 3 لبناء كومة من الصور الميدانية مشرق اقتصاص إلى منطقة فيterest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد خريطة المرحلة، مدينة دبي للإنترنت صورة الزائفة، ومقارنات لصور حقل مشرق وصورة مدينة دبي للإنترنت صحيح، قم بتشغيل القسم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الزائفة مدينة دبي للإنترنت ومدينة دبي للإنترنت الصور الحقيقية مماثلة قدر الإمكان خريطة كثافة الكتلة، الكتلة الكلية، والرسم البياني للكثافة الخلية يمكن تحديده من خلال تشغيل القسم 5A 5B أو. القسم 5A ينفذ الكشف الآلي الحدود من الميدان - الأمثل &quot;العتبة&quot; في سطر 300 - القيم النموذجية تختلف بين 0.1-1. أعد هذا القسم حسب الحاجة لتحسين قيمة العتبة. القسم 5B ينفذ تقرير الشامل، وما إلى ذلك بعد يحدد المستخدم الخلية من الفائدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung.">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+contrast,+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects.">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Phase.">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li><li>Smith, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li><li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinterf&#233;rom&#232;tre+diff&#233;rentiel+&#224;+ondes+polaris&#233;es.">Microinterf&#233;rom&#232;tre diff&#233;rentiel &#224; ondes polaris&#233;es.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li><li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy.">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li><li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-enhanced+contrast,+differential+interference+contrast+(VEC-DIC)+microscopy:+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris.">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image+processing+greatly+enhances+contrast,+quality,+and+speed+in+polarization-based+microscopy.">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li><li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+shape+change+and+spreading.">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li><li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+microscopy+and+mass+determination.">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li><li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractometry+of+living+cells.">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li><li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy.">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li><li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy.">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li><li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide&#8208;field+differential+interference+contrast+microscope.">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide&#8208;field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li><li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+(TI-DIC)+microscopy+for+quantitative+phase+imaging.">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering-phase+theorem:+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media.">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li><li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Carr&#233;+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude.">Quantitative Carr&#233; differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li><li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+phase+microscopy.">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li><li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light.">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li><li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=non-iterative+phase+retrieval+by+Green&#8217;s+functions.">non-iterative phase retrieval by Green&#8217;s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li><li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+quantification+of+cellular+mass,+volume,+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient.">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li><li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+single+cell+refractive+index,+dry+mass,+volume,+and+density+using+a+transillumination+microscope.">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li><li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum.">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li><li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cell+membrane+tension.">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics.">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li><li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+phase+microscopy.">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li><li>Charri&#232;re, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy.">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li><li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging.">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li><li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+interference+microscopy.">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li><li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems.">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li><li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics.">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li><li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li><li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images.">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li><li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation.">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية في العمل المقدم.

بشكل عام، NIQPM هي تقنية محدودة الحيود على التحقق من صحة مسار بصري أطوال تتراوح ،25-44،7. تم إجراء التحقق من الصحة على ن = 1.596 المجالات البوليسترين تتراوح في القطر ،11-9،8 ميكرون معلقة في Fluoromount G (لا تظهر البيانات). تمتلك الخلايا الضوئية أطوال الطريق التي تتراوح بين ما يقرب من 0...

استخدام المجهر الضوئي هو الآن في كل مكان في التحقيق في الكائنات الحية الخلوية. وترجع الزيادة إلى انخفاض الذاتية الامتصاصية وضعف نثر خصائص الطيف الضوئي على مدى مرئية، والخلايا لا تؤثر بشدة اتساع الموجات الضوئية التي تعبر منها، ويبدو شبه شفاف عندما التقط مع المجاهر حقل مشرق القياسية الآن. العينات الخلوية لا، ومع ذلك، وإبطاء موجات الضوئية السفر من خلالهم بطريقة يرتبط خطيا لكمية من كثافة الإعلام المحلية في منطقة معينة من الفضاء من خلالها الضوء يسافر. وكان أول وصف استخدام هذا الفارق الزمني غير متجانسة أو &quot;مرحلة&quot; لمحة من موجات الضوئية التي تنتقل عن طريق عينات مجهرية في عام 1935 من قبل فريتس Zernike 1 وأدركت تجريبيا بواسطة Zernikein 1942 2. منحت جائزة نوبل Zernike في عام 1953 لتحقيق هذا الإنجاز. زايس تجاريا هذه الطريقة في عام 1945 3. في عام 1955، سميث وNomarskوأود أن تقديم العمل الأولي على استخدام 4 و 5 من نظرية النقيض تدخل الفرق (DIC) المجهري، وهو أسلوب يستخدم التدرج المكاني للمرحلة كآلية التباين. تم تسويقها من قبل مدينة دبي للإنترنت زايس في 1965in بالتعاون الوثيق مع Nomarski 6. في عام 1981، أثبتت مختبرين سجلت أول الخلية الحية DIC الصور مع إدماج كاميرات الفيديو في القطار البصريات المجهر DIC 7، 8. ولدت في عصر التصوير الخلية الحية. منذ هذا الوقت، وكان إعدام كل من النقيض المرحلة ومدينة دبي للإنترنت على المجاهر التجارية إلى حد كبير دون تغيير. وتستخدم هذه الطرق أساسا من قبل علماء الأحياء لإنتاج صور من الخلايا لأغراض النوعي: رصد التشكل، وتتبع هياكل التحت خلوية، والتحقيق في ديناميات غشاء 9. هذه التقنيات هي النوعية في التكوين الخاصة بهم &quot;الجاهزة&quot; على حد سواء المرحلة وDIالصور C هي وظائف التعسفي من شدة مصدر الضوء، وإعدادات البصريات والإضاءة، وكسب كاميرا CCD، غاما، وإعدادات التعرض. وقد سعت والفيلق صغيرة من الفيزيائيين والمهندسين البصرية لجعل طرائق التصوير التجاري الكمي. بين الجهود الأولى كانت رسالتين إلى الطبيعة في عام 1952 و 1953 التي الطبيب الذي تحول إلى الفيزياء الحيوية روبرت تظاهر أكثر عريا استخدام المرحلة المجهر لتحديد كتلة جافة الخلوي للخلايا عن طريق تقدير مرحلة التحولات من خلال هذين النوعين من الخلايا باستخدام المجهر المرحلة المتاحة تجاريا 10، 11. وقد وضعت حقل العديد من التقنيات على مدى السنوات التي تلت ذلك القائمة حول ثلاث آليات النقيض خالية من التسمية الأساسية: مرحلة المجهر 10،11، مدينة دبي للإنترنت المجهر 12-17، وحقل مشرق 18-22 لتحديد مسار بصري طول، المرحلة، الشامل الكثافة، معامل الانكسار، وحجم الخلوية. في الفقرةllel، كما تم تطوير مجموعة كبيرة من الأجهزة البصرية المخصصة منذ 1950s، وجعلت بعيدة المدى القياسات البصرية التي تتراوح بين التطبيقات في النمو الطفيلي 23، لتوثيق دورة الخلية 24 إلى التحقيق ديناميات غشاء خلايا الدم الحمراء 25. على وجه الخصوص، فقد شهدت السنوات العشر الماضية ثروة من التسمية خالية المجهر الكمي في شكل المرحلة حيود المجهري 26، تصوير الشعاعي الطبقي المرحلة المجهري 27، المجهر الرقمي المجسم 28، مرحلة حساسة التماسك البصري المجهري 29، المكاني تدخل ضوء المجهر 30، هيلبرت المرحلة المجهري 31، والكمية المرحلة المجهري 32. على الرغم من نجاحاتهم الجماعية، لم تنشر هذه الصكوك إلى الحقل أكبر من الباحثين البيولوجية بسبب، في الغالب، إلى الأجهزة الخاصة بهم المعقدة والمتطلبات الحاسوبية. نحن هنا دescribe استخدام المجهر الضوئي القياسية لأداء القياسات الكمية للكتلة، وحجم، وكثافة على العينات الخلوية من خلال مزيج من حقل مشرق وصور مدينة دبي للإنترنت. يتم عرض نهجين أساسيين: noninterferometric المرحلة الكمي المجهري (NIQPM)، لأداء القياسات من مجموع كتلة الخلية وتوزيع الكثافة التحت خلوية، وهيلبرت تحويل التدخل النقيض التفاضلية المجهري (HTDIC)، لتحديد حجم. المزايا الأساسية لNIQPM وHTDIC يكمن في الوصول التكنولوجية. الشروط التصوير اللازمة لتنفيذها الناجحة هي ضمن نطاق العمل العادي لمعظم المجاهر متاحة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك، خوارزميات مرحلة ما بعد المعالجة مستقرة، وسريعة، وقوية - بعد أن تم تنفيذها في MATLAB باستخدام تحويل فورييه السريع الخوارزميات (الاتحاد الفرنسي للتنس) استنادا كلما أمكن ذلك. NIQPM هي طريقة لإعادة المرحلة وكثافة كتلة متكاملة محوريا من سلعينات من الصور lular حقل مشرق. محصلة هذه الكثافة كتلة متكاملة محوريا فوق منطقة العينة يعطي مجموع المحتوى الشامل الجافة للعينة. ويستند البروتوكول NIQPM على الأسس التجريبية التي وضعتها Paganin ونوجنت 18، 19 - الذي أثبت أن الملف الشخصى المرحلة من خلية يمكن بناؤها من الصور مجال مشرق من خلال تركيز العينة - والعمل النظري من فرانك ، Altmeyer، وفيرنيك 20 - على حل نماذج موجة مجاور للمحور بطريقة فعالة تستند الاتحاد الفرنسي للتنس. ويستند اتصال من مرحلة إلى كثافة الكتلة الجافة على العمل من قبل أكثر عريا 10 و 11 و 33 بوبيسكو. يمكن الحصول على معلومات الحجمي من مدينة دبي للإنترنت من خلال صور عالية التركيز تحت ظروف الإضاءة NA التي تمكن باجتزاء البصرية من العينة على طول المحور البصري. هيلبرت تحويل المعالجة على مداخن صورة مدينة دبي للإنترنت يعزز إلى حد كبيرخوارزميات الكشف عن الحافة لتوطين حدود العينة في ثلاثة أبعاد من خلال فصل القيم الرمادية من كثافة عينة من تلك الخلفية. هذا العمل ينبع مع ​​Arinson وآخرون 34 على الرغم من أننا قد أدخلت كل من طرق تصفية فورييه لتعزيز التباين وحافة طريقة الكشف يستند سوبل للتحليل الحجمي الآلي من العينة. لدينا أيضا التحقق من صحة HTDIC سابقا على المجالات البوليسترين تتراوح في حجمها من الحد الحيود تصل إلى 20 ميكرون في القطر 36. في حين أن كلا NIQPM وHTDIC يمكن الوصول إليها من الناحية التكنولوجية نظرا لتطورها على المجاهر التجارية، والأساليب تقتصر بشكل أساسي من تكوين الأجهزة من المجاهر أنفسهم. قيود الرئيسي من هذه التقنيات هي ذات شقين: بطيئة ض المكدس اكتساب الوقت على نطاقات التجارية، وذلك بسبب ترجمة المرحلة عينة بأكملها بدلا من مجرد عدسة الهدف، يحد حاليا التحقيق في الظواهر أسرع من ما يقرب من 1 الإطار / دقيقة، وثانيا، والآثار الحيود تقييد فائدة NIQPM وHTDIC إلى كائنات تتراوح في حجمها من 0.2 إلى 10 و 20 ميكرون في القطر، على التوالي. وبالتالي، فإن العينة وديناميات الوقت يرتبط به من الفائدة يجب أن تفي حجم معين والقيود الزمنية لتمكين استخدام هذه الأساليب على صكوك نموذجية &quot;قبالة الجاهزة للاستخدام&quot;. والمثير أن يتم التحقيق في معظم العينات الخلوية الثابتة بسهولة مع هذه الطرق. يتم إعطاء لمحة عامة عن NIQPM والبروتوكولات HTDIC في الشكل 1. في الشكل 2 نحن لتوضيح التصوير الأمثل والأمثل من خلال التركيز على حد سواء في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة والعالية على حد سواء NA حقل مشرق وصور مدينة دبي للإنترنت. أرقام 3 و 4 تدليل على الاعتماد المعلمة من الخوارزمية NIQPM تسليط الضوء على تطبيقات الناجحة وغير الناجحة. <strong&gt; ويوضح الشكل (5) والخطوات المتبعة في الخوارزمية لمعالجة الصور HTDIC ويدل على التنفيذ الأمثل لخوارزمية لتحديد حجم الخلوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

وصفنا استخدام المجهر الضوئي القياسية لأداء القياسات الكمية من الكتلة والحجم، والكثافة على العينات الخلوية من خلال مزيج من حقل مشرق والتفضيلية تدخل على النقيض الصور. يتم عرض نهجين أساسيين: noninterferometric المرحلة الكمي المجهري (NIQPM)، لأداء القياسات من مجموع كتلة الخلية وتوزيع الكثافة التحت خلوية، وهيلبرت تحويل التدخل النقيض التفاضلية المجهري (HTDIC) لتحديد حجم. ويستند NIQPM على نموذج مبسط لانتشار الموجات، ووصف تقريب مجاور للمحور، مع ثلاثة الافتراضات الأساسية: منخفض الفتحة العددية (NA) الإضاءة، ضعيفة نثر، وامتصاص ضعيفة الضوء من العينة. لحسن الحظ، والعينات الخلوية غير ملوثين تلبية هذه الافتراضات ويتحقق انخفاض NA الإضاءة بسهولة على المجاهر التجارية. يستخدم HTDIC للحصول على معلومات الحجمي من صور مدينة دبي للإنترنت من خلال التركيز تحت عالية NA illuminشروط أوجه. NA إضاءة عالية تمكن تعزيز باجتزاء من العينة على طول المحور البصري. هيلبرت تحويل المعالجة على الصورة DIC مداخن بشكل كبير يعزز حافة خوارزميات الكشف عن توطين حدود العينة في ثلاثة أبعاد من خلال فصل القيم الرمادية من كثافة عينة من تلك الخلفية. المزايا الأساسية لNIQPM وHTDIC يكمن في الوصول التكنولوجية الخاصة بهم باستخدام المجاهر &quot;قبالة الجاهزة للاستخدام&quot;. هناك نوعان من القيود الأساسية من هذه الأساليب: بطيئة ض المكدس اكتساب الوقت على نطاقات التجارية يلغي حاليا التحقيق في الظواهر أسرع من الإطار 1 / دقيقة، وثانيا، والآثار الحيود تقييد فائدة NIQPM وHTDIC إلى كائنات من 0.2 إلى 10 (NIQPM) و 20 (HTDIC) ميكرون في القطر، على التوالي. وبالتالي، يجب على عينة والوقت المرتبط به ديناميات الفائدة تلبية حجم معين والقيود الزمنية لتمكين استخدام هذه الأساليب. والمثير أن معظم cellula الثابتةيتم التحقيق العينات ص بسهولة مع هذه الطرق.

الصحيح إضاءة العينة خلال الحصول على الصور من خلال التركيز أمر حاسم لنجاح تنفيذ NIQPM خوارزميات HTDIC الثانية. في الشكل 2 نحن لتوضيح المنخفضة والعالية على حد سواء تحت إضاءة NA مدينة دبي للإنترنت وعلى النقيض من حقل مشرق للكرة البوليسترين والقولون والمستقي?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope at JoVE.com

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Views.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Video: Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

أ ف التوحد لجنة المساواة العرقية ، السلمون المدخن النهج للكشف عن خلية الانصهار في فيفو</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

في تركيب المختبر من تباعد الليفية الأصلية، طويل والقطاعي الكولاجين تباعد طويل

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

تصنيع وتوصيف أشباح الأنسجة البصرية التي تتضمن حداتها

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري لدراسة قلب مورين

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...