Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (U54CA143906 zu KGP, OJTM und R01HL101972 zu OJTM) und einem Oregon Medical Research Foundation Frühe klinische Investigator Award (KGP) unterstützt. OJTM ist ein American Heart Association Gegründet Investigator (13EIA12630000). Wir danken Dr. Eric Anderson von dem Ritter Cancer Institute für die Herstellung von Zellproben in dieser Arbeit verwendet.

1. Mikroskop Technische Daten Zur Durchführung Bildgebung in der richtigen Art und Weise das Mikroskop sollte den folgenden Spezifikationen: <ol><li> Besitzen beide Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Hellfeld (BF) Kontrast. </li><li> Haben Computer-gesteuerten z-Achsen-Bewegung. </li><li> Haben Sie eine verstellbare Blende, um die Sammellinse numerische Apertur variieren. Eine Öffnung mit einer abgestuften Regel oder elektronische Auslesung erforderlich ist, um den Wert der numerischen Apertur zu kennen. Die numerische Apertur von 0,1 sollte für NIQPM bis 0.9 (oder höher) für HTDIC reichen. </li><li> Das Mikroskop sollte eine Schmalband-Farbfilter müssen für Hellfeld-Bildgebung genutzt werden. Dieser Filter ist erforderlich, um den Brechungsschritt, eine wellenlängenabhängige lung zur Phase der Massendichte für NIQP konvertieren zu beheben. </li></ol> 2. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Z-Stapel-Erfassung <ol><li> Öffnen Sie die Slidebook Software einnd erstellen Sie eine neue Folie für die Bildsammlung. </li><li> Dann öffnen Sie den Fokus-Fenster. Unter dem Filter-Set Wählen Sie im Abschnitt DIC. Auf der Registerkarte Bereich unter der Kondensator Abschnitt, stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten rechten Position (in alle Richtungen öffnen). Dies sorgt für hohe numerische Apertur Beleuchtung und verbessert optische Schnitte der Probe. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf die Probe mit Hilfe eines DIC Ziel. Einstellen der Halogenlampenintensität, bis die Probe leicht sichtbar ist. Um sicherzustellen, dass die Kamera nicht gesättigt ist, wählen Sie die Registerkarte Kamera in der Focus-Fenster und überprüfen Sie, dass das Histogramm der Pixelintensitäten innerhalb der Dynamikbereich der Kamera. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. In dem Abschnitt Aufnahmetyp, überprüfen Sie die 3D-Box. In der 3D-Capture-Abschnitt, wählen Sie den Bereich um das Zentrum und zurück zu aktuellen Standort </strong&gt; Boxen und geben Sie den Z-Richtung Bereich, die Anzahl der Flugzeuge und Schrittweite. Die Z-Richtung Bereich sollte die gesamte Probe zu integrieren. </li><li> In der Filter-Set Abschnitt der Bild-Capture Fenster die DIC Kästchen und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um die Abbildung zu initiieren. </li></ol> 3. Hellfeld (BF) Z-Stapel-Erfassung <ol><li> Sobald das Mikroskop Sammeln der DIC Z-Stapel von der Probe beendet ist, öffnen Sie den Fokus-Fenster und wählen Sie unter dem Filter-Set Abschnitt Öffnen. Stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten links (geschlossen den ganzen Weg) zum niedrigen NA Beleuchtung zu bieten. </li><li> Ändern Sie den Mikroskoplicht-Pfad-Filter auf grün. Stellen Sie die Halogenlampe Intensität, bis die Probe sichtbar ist. Sicherzustellen, dass keine Sättigung der Kamera durch Auswahl der <strong&gt; Kamera-Registerkarte in der Focus-Fenster und überprüfen, ob das Histogramm der Pixelintensitäten innerhalb des angegebenen Bereichs. </li><li> Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. Die 3D-Capture-Einstellungen aus der Z-Stapel Erwerb DIC wird angezeigt. </li><li> In der Filter-Set Abschnitt der Bildaufnahme-Fenster, überprüfen Sie die OPEN-Box und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um den Z-Stapel-Bildakquisition zu initiieren. </li></ol> 4. Exportieren Z-Stapel-Bilder <ol><li> Öffnen Sie ein Z-Stapel-Aufnahme. Ändern Sie die Ansicht auf 100%. Einstellen des Histogramms der Pixelwerte zwischen 0 angezeigt, und der maximale Pixelwert der Kamera (4.095 für 12-Bit-Kameras, 65.535 für 16 Bit.). </li><li> Wählen Sie Ansicht&gt; Exportieren&gt; TIFF-Serie. Dadurch wird die Z-Stapel als eine Reihe von TIFF exportieren(Eine für jede Z-Ebene). Speichern Sie die TIFF-Serie in einem separaten Ordner mit einem Namen, der einen Unterstrich am Ende (dh &quot;DIC Stapel 1_&quot;) hat. Wiederholen Sie dies mit jedem DIC oder BF Z-Stapel. </li></ol> 5. Volumenmessungen <ol><li> Öffnen Sie die HTDIC MATLAB-Programm mit dem Titel &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Nach § 0 des HTDIC Programm, aktualisieren Sie die Abhängigkeiten Verzeichnis variabel. Kopieren Sie das Verzeichnis mit der hilbert_transform_dic.m und sobel_edge_detect.m Dateien aus dem Explorer (PC) in zwischen den einfachen Anführungszeichen folgenden &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 des JoVE_HTDIC_v1.m Programm. </li><li> In Abschnitt 1, aktualisieren Sie die &quot;images_directory&quot;. Auch Kopieren Sie das Verzeichnis mit den durch-Fokus-Bilder in. Tif Form zwischen den einfachen Anführungszeichen. NUR EINMAL ein Laufabschnitt. </li><li> Ausrichtung und Drehung der Bilder für Hilbert-Transformation Run Abschnitt 2 des Codes. Ein Dialogfeld mit dem Titel &quot;Define HTDIC Parameter&quot; wird angezeigt. Fünf numbeRS sind für den Benutzer erforderlich, die Brennebene Nummer, die DIC-Bild der Probe fokussiert ist, laterale Auflösung (&amp;mgr; m / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist 0,1 für die Bildaufnahme in 0,1 um axiale Stufen), der Drehwinkel der DIC-Bild benötigt, um die Hilbert-Transformation durchzuführen, sind 45 und -135 typische Werte. Schließlich geben Sie die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite der Box, die später erscheinen werden - typischer Wert ist 400. Klicken Sie auf OK. </li><li> Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben DIC Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt. Positionieren Sie die Box auf das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Sobald die Box über den gewünschten Bereich, doppelklicken Sie in der Box positioniert. </li><li> Eine weitere Zahl wird nun angezeigt: Diese Zahl enthält eine beschnittene und gedrehte Bild der Region von Interesse in der vorherigen Schritt ausgewählt. Der Kontrast des Bildes sollte so sein,dass dunkle Funktionen erscheinen auf der linken Seite, während helle Funktionen erscheinen auf der rechten Seite. Ziehen Sie die blaue Box auf dem Gebiet von Interesse, neu zu gestalten wie nötig. </li><li> Abschnitt 3 erzeugt eine Maske für die z-Stapel Würfel. Es gibt zwei Arten von Masken zur Verfügung: eine rechteckige Maske, um ein Rechteck um die Zelle und ein Freihandwerkzeug, um die Zelle von Interesse von Hand skizzieren erstellen. </li><li> Um eine rechteckige Maske, entfernen Linie 167 und Linie 170 Kommentar (Kommentar einer Linie durchgeführt, indem ein &quot;%&quot; am Anfang der Zeile) zu erzeugen. Führen Abschnitt 3 des Programms. Klicken Sie in das Bild und ziehen Sie die Maus, die rechteckige Maske definieren, um zu beginnen. Doppelklicken Sie auf das Feld, um es zu akzeptieren. </li><li> Um eine von Hand gezeichnete Maske Kommentarzeile 167 und Kommentar-Linie 170 zu generieren und auszuführen Abschnitt 3. Klicken Sie auf und ziehen Sie die gewünschte Maske mit der Maus. Doppelklicken Sie auf die Maske, es zu akzeptieren. </li><li> Führen Abschnitt 4to der Hilbert-Konstrukt transformiert DIC Bildstapel und die entsprechende DIC Bildstapel der Bereich von Interesse.Die in Abschnitt 3 aufgebaut Maske wird dem Hilbert-Transformation angewendet werden DIC-Stack und die regelmäßige DIC Stapel, wenn &quot;Maskon&quot; auf 1 in Zeile 179 festgelegt ist. Einstellung &quot;Maskon&quot; wird auf 0 Bildstapeln ohne Auftragen der Maske zu konstruieren. </li><li> Laufabschnitt 5, um die Bildsegmentierung der xz-Querschnittsbilder von dem interessierenden Bereich zu optimieren. Figur 500, durch das Programm erzeugt wird, erscheint die Anzeige drei verschiedene Arten von Kontrast. Der Erfolg des Algorithmus, um die Grenzen der Zelle zu finden, ist abhängig von einer Kombination der Maske verwendet, und der Wert der &quot;Schwellenwert&quot; in Zeile 229 des Programms. Beginnen Sie mit einem Wert von 0,5. Stellen Sie den Wert der Schwelle, und wiederholen Sie diesen Abschnitt des Programms, bis die richtige Gliederung in eine der Spalten erreicht. </li><li> Wenn die Gliederung besten in Spalte 1 war, verwenden Sie Abschnitt 6, um die Lautstärke zu bestimmen, unter Verwendung von DIC Bildsegmentierung. Wenn Spalte 2 gab optimale Ergebnisse laufen Abschnitt 7 zu Zellvolumen von Hilbert-transformierten DIC Bildern zu bestimmen. Wenn Spalte 3 GAVe die optimalen Ergebnisse, Abschnitt 8 laufen, um die Lautstärke zu bestimmen, mit Fourier-gefilterten Hilbert-transformierten DIC Bilder. </li><li> Das gemessene Volumen der Probe in Kubik um (fl) gemeldet wird im Titel von Fig. 600, 700 oder 800 von dem Programm in Abhängigkeit von dem Volumenmessung gewählt hergestellt vorgestellt. </li></ol> 6. Massenmessungen <ol><li> Öffnen Sie die NIQPM MATLAB-Programm mit dem Titel &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Nach § 0 des NIQPM Programm, aktualisieren Sie die Lage der drei Verzeichnisse benötigt, um das Programm auszuführen. Dies sind die &quot;dependencies_directory&quot;, die &quot;brightfield_directory&quot; und die &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 1. Dieser Codeabschnitt erzeugt ein helles Feld Bild Würfel des vollen Feld der gesamte Satz von Bildern. NUR EINMAL ein Laufabschnitt. </li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 2. Ein Dialogfeld mit dem Titel &quot;Define NIQPM Parameter&quot; wird angezeigt. Vier Zahlen sind für den Benutzer erforderlich: Anzahl der Brennebene, wo das helle Feld Bild desProbe im Fokus, laterale Auflösung (um / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist für die Bildaufnahme 0,1 in 0,1 Schritten um axial) und die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite ein Box, die später erscheinen werden - ein typischer Wert ist 200. Klicken Sie auf OK. </li><li> Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben Hellfeld-Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt. <ol><li> Wenn das Bild nicht fokussiert ist, doppelklicken Sie in der blauen Box und erneut Abschnitt 2, achten Sie darauf, um die Brennebene Nummer im Dialogfeld einstellen. </li><li> Wenn das Bild scharf ist, ziehen Sie den blauen Kasten um das Bild und Größe ändern, indem Sie die Knoten der Box und ziehen Sie diese gegebenenfalls. Positionieren Sie den Rahmen um das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Doppelklicken Sie in der Box, es zu akzeptieren. </li></ol></li><li> Als nächstes führen Sie Abschnitt 3, einen Stapel von Hellfeld-Bilder zu konstruieren abgeschnitten, um in der RegionInteresse. </li><li> Um die Phasenkarte, Pseudobild DIC, und Vergleiche mit Hellfeld-Bildern und dem wahren Bild DIC generieren, führen Sie Abschnitt 4. </li><li> Mit der Pseudo DIC und wahre DIC Bilder so ähnlich wie möglich der Massendichte Karte, Gesamtmasse und Histogramm der Zelldichte kann durch Ausführen von § 5a oder 5b bestimmt werden. § 5a führt automatische Erkennung der Grenze des Feldes - optimieren &quot;Schwelle&quot; in Zeile 300 - typische Werte liegen zwischen 0,1-1. Führen Sie erneut diesen Abschnitt wie notwendig, um den Wert der Schwelle zu optimieren. 5b führt Massenbestimmung usw., nachdem der Benutzer den interessierenden Zelle skizziert. </li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen in der vorliegenden Arbeit.

Im allgemeinen ist NIQPM ein beugungsbegrenzter Technik auf optische Weglängen zwischen 0,25-44,7 validiert. Validierung auf n = 1.596 durchgeführt Polystyrolkugeln im Durchmesserbereich von 0,11 bis 9,8 &amp;mgr; m in Fluoromount G suspendiert (Daten nicht gezeigt). Zellen besitzen optischen Weglängen, die von fast 0-7 liegen. Bei der Messung der Dichteverteilung einer Probe kann man feststellen, dass die Pseudo-Bild DIC sieht gut aus, während die Dichtekarte besitzt unerwünschte Hinte...

Die Verwendung optischer Mikroskopie ist nun überall in der Untersuchung von zellulären Organismen. Aufgrund ihrer geringen endogenen Absorption und schwache Streueigenschaften über den sichtbaren Lichtspektrum, ich Zellen nicht stark auf die Amplitude der Lichtwellen durchqueren sie und erscheinen halbtransparent, wenn sie mit Standard-Hellfeld-Mikroskop abgebildet. Zellproben haben jedoch verlangsamen optischen Wellen, die sich durch sie in einer Weise, die linear zur Höhe der lokalen Massendichte in einem bestimmten Raumbereich, durch den das Licht in Beziehung steht. Die Nutzung dieser heterogenen Zeitverzögerung oder &quot;Phase&quot;-Profil von optischen Wellen durch mikroskopische Präparate übertragen wurde erstmals 1935 von Frits Zernike 1 beschrieben und experimentell durch Zernikein 1942 2 realisiert. Zernike den Nobelpreis im Jahr 1953 für diese Leistung ausgezeichnet. Zeiss kommerzialisiert dieses Instrument im Jahr 1945 3. Im Jahr 1955, Smith und Nomarskich würde ihre ersten Arbeiten über die Verwendung 4 und 5 von Theorie Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie, eine Modalität, die die räumliche Gradienten von Phase als Kontrastmechanismus verwendet zu präsentieren. DIC wurde von Zeiss in 1965in enger Zusammenarbeit mit Nomarski 6 kommerzialisiert. Im Jahr 1981 zeigten zwei Labors die erste aufgezeichnete Live-Cell-DIC Bilder mit dem Einbau von Videokameras in die Optik Zug der DIC-Mikroskop 7, 8. Die Ära der Live Cell Imaging war geboren. Seit dieser Zeit hat sich die Ausführung der beiden Phasenkontrast und DIC auf kommerziellen Mikroskope weitgehend unverändert geblieben. Diese Methoden werden hauptsächlich von Biologen genutzt werden, um Bilder von Zellen für qualitative Zwecke zu produzieren: Überwachung der Morphologie, Tracking subzellulärer Strukturen, und Untersuchungen von Membrandynamik 9. Diese Techniken sind in ihrer qualitativen &quot;off-the-shelf&quot;-Konfiguration und Phase DIC lassen sich beliebige Funktionen der Intensität der Lichtquelle, die Beleuchtungsoptik Einstellungen und CCD-Kamera Verstärkung, Gamma-und Belichtungseinstellungen. Eine kleine Legion von Physikern und Ingenieuren optischen hat sich bemüht, zu kommerziellen bildgebenden Verfahren quantitativ. Zu den ersten Bemühungen waren zwei Briefe an die Natur in 1952 und 1953, in denen der Arzt-turned-Biophysiker Robert Barer demonstriert die Verwendung von Phasenmikroskopie, um Zelltrockenmasse von Zellen durch Schätzung Phasenverschiebungen durch diesen Zelltypen mit einem handelsüblichen Phasen Mikroskop bestimmen 10, 11. Phasenmikroskopie 10,11, DIC-Mikroskopie 12-17, 18-22 und Hellfeld auf optische Weglänge, Phase, Masse zu bestimmen: Das Feld hat eine Vielzahl von Techniken in den folgenden Jahren auf Basis drei Grundmarkierungsfreie Kontrastmechanismen entwickelt Dichte, Brechungsindex, und Zellvolumen. In Abs.llel, eine große Sammlung von kundenspezifischen optischen Instrumenten wurden auch seit den 1950er Jahren entwickelt worden und haben weitreichende optische Messungen im Bereich von Anwendungen in der Parasitenwachstum 23, zu dokumentieren, die den Zellzyklus 24 bis sucht Membrandynamik der roten Blutzellen 25. Insbesondere hat die vergangenen zehn Jahren eine Fülle von kennzeichnungsfreien quantitativen Mikroskopie in Form von Beugungsphasenmikroskopie 26, 27 tomographischen Phasenmikroskopie, digitale holographische Mikroskopie 28, phasensensitive optische Kohärenzmikroskopie 29, räumliche Lichtinterferenzmikroskopie 30. Hilbert gesehen Phasenmikroskopie 31 und quantitative Phasenmikroskopie 32. Trotz ihrer gemeinsamen Erfolge, haben diese Instrumente nicht zu den größeren Bereich der biologischen Forscher durch, meist, um ihre komplexen Mess-und Rechenanforderungen verbreitet. Hier beschreiben wir dEscribe die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und DIC Bildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Zugänglichkeit. Die für die erfolgreiche Ausführung erforderlich Abbildungsbedingungen sind im Rahmen des normalen Betriebs der meisten kommerziell erhältlichen Mikroskope. Darüber hinaus sind die Post-Processing-Algorithmen stabil, schnell und robust - worden in MATLAB mit Hilfe von schnellen Fourier-Transformation (FFT) basierte Algorithmen, wann immer möglich umgesetzt. NIQPM ist eine Methode zur Phasen-und den axial integriert Massendichte cel rekonstruierenzellulären Proben von Hellfeld-Bilder. Summation dieser axial integrierten Massendichte über die Fläche der Probe gibt die Gesamttrockenmassegehalt der Probe. , In dem sie gezeigt werden, dass die Phasenprofil einer Zelle konnte von durch-Fokus-Hellfeldbildern der Probe rekonstruiert werden - - Die NIQPM Protokoll basiert auf den experimentellen Grundlagen von Paganin und Nugent 18, 19 aufgestellt hat und die theoretische Arbeit von Frank , Altmeyer und Wernicke 20 - auf die Lösung der paraxialen Wellen Modelle in einer effizienten FFT-basierte Weise. Die Verbindung der Phase auf die Trockenmasse Dichte beruht auf der Arbeit von Barer 10, 11 und 33 Popescu basiert. Volumen Informationen können durch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Beleuchtungsbedingungen, die optische Schnitte der Probe entlang der optischen Achse zu ermöglichen, erhalten werden. Hilbert-Transformation Verarbeitung der DIC-Bildstapeln stark erhöhtRanderfassungsalgorithmen zur Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Diese Arbeit stammt mit Arinson et al. 34. obwohl wir beide Fourier-Filter-Methoden eingeführt, um den Kontrast und einen Sobel-Kantenerkennung basierend Verfahren zur automatischen Volumen Analyse der Probe zu verbessern. Wir haben auch bestätigt HTDIC vorher für Polystyrolkugeln in der Größe von der Beugungsgrenze von bis zu 20 um Durchmesser 36. Während sowohl NIQPM und HTDIC technologisch erreichbar aufgrund ihrer Entwicklung zu kommerziellen Mikroskope sind die Verfahren im wesentlichen durch die Hardware-Konfiguration der Mikroskope selbst begrenzt. Die primären Grenzen dieser Techniken sind zweifach: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf kommerziellen Bereiche, die durch Übersetzung der gesamten Probenbühne im Gegensatz zu nur die ObjektivlinseBegrenzt gegenwärtig die Untersuchung von Phänomenen schneller als etwa 1 Bild / min und zweitens Beugungseffekte begrenzen die Nützlichkeit NIQPM und HTDIC auf Objekte in der Größe von 0,2 bis 10 und 20 um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden auf typische &quot;off-the-shelf&quot; Instrumente zu ermöglichen. Spannend, die meisten festen zellulären Proben leicht mit diesen Methoden untersucht. Eine Übersicht über den NIQPM und HTDIC Protokolle sind in Fig. 1 angegeben. In Abbildung 2 veranschaulichen wir optimale und suboptimale Durch Schwerpunkt Bildgebung unter niedrigen und hohen NA Beleuchtungsbedingungen sowohl für Hellfeld-und DIC-Bilder. Abbildungen 3 und 4 zeigen die Abhängigkeit der Parameter NIQPM Algorithmus auf der erfolgreiche und nicht erfolgreiche Implementierungen. <strong&gt; 5 veranschaulicht die Schritte in der HTDIC Bildverarbeitungs-Algorithmus beteiligt und zeigt die optimale Implementierung des Algorithmus, um Zellvolumen zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td><td>Axio Imager D2</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Green filter (&amp;lambda; = 540 &amp;plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>Green filter</td></tr><tr><td>SlideBook 5.5 software</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td><td></td><td>Image acquistion software</td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>Polystyrene spheres</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>Mounting media</td></tr></tbody></table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

Wir beschreiben die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und Differentialinterferenzkontrastbildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. NIQPM auf einem vereinfachten Modell der Wellenausbreitung auf der Basis, der sogenannten paraxialen Näherung mit drei zugrunde liegenden Annahmen: niedriger numerischer Apertur (NA) Beleuchtung, Schwach Streuung, und schwache Lichtabsorption durch die Probe. Glücklicherweise ungefärbten zellulären Proben erfüllen diese Annahmen und niedrigen NA Beleuchtung ist leicht zu kommerziellen Mikroskopen erreicht. HTDIC wird verwendet, um Informationen von Volumendurch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Aufhellung erhaltenation Bedingungen. Hohe NA Beleuchtung ermöglicht verbesserte Schneide der Probe entlang der optischen Achse. Hilbert-Transformationsverarbeitung auf der DIC Bildstapeln stark erhöht Kantenerkennungsalgorithmen für die Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Erreichbarkeit mit &quot;off-the-shelf&quot;-Mikroskope. Es gibt zwei grundlegende Einschränkungen dieser Methoden: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf gewerbliche Bereiche hebt derzeit die Untersuchung von Phänomenen schneller als 1 Bild / Minute, und zweitens, Beugungseffekte beschränken den Nutzen der NIQPM und HTDIC, um Objekte von 0,2 bis zu 10 (NIQPM) und 20 (HTDIC) um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden zu ermöglichen. Aufregend, die meisten Fest cellular Proben leicht mit diesen Methoden untersucht.

Korrekte Probenbeleuchtung während durch Fokus-Bildaufnahme ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung des NIQPM nd HTDIC Algorithmen. In Abbildung 2 veranschaulichen wir niedrigen und hohen NA Beleuchtung sowohl unter DIC und Hellfeld-Kontrast für eine Polystyrol-Kugel und der menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Zelllinie SW620. Fig. 2A, 2C, 2I, 2K und demonstrieren eine optimale Bildgebung für NIQPM. 2F, 2H, 2N und 2P demonstrieren optima...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Aufrufe.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Serie: Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Forschung

Biochemie

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, high-throughput imaging modalities utilizing bright field or fluorescence detection, are unable to resolve the overall 3D structure of the tumor spheroid due to limited light penetration, diffusion of fluorescent dyes and depth-resolvability. Recently, our lab demonstrated the use of optical coherence tomography (OCT), a label-free and non-destructive 3D imaging modality, to perform longitudinal characterization of multicellular tumor spheroids in a 96-well plate. OCT was capable of obtaining 3D morphological and physiological information of tumor spheroids growing up to about 600 &#181;m in height. In this article, we demonstrate a high-throughput OCT (HT-OCT) imaging system that scans the whole multi-well plate and obtains 3D OCT data of tumor spheroids automatically. We describe the details of the HT-OCT system and construction guidelines in the protocol. From the 3D OCT data, one can visualize the overall structure of the spheroid with 3D rendered and orthogonal slices, characterize the longitudinal growth curve of the tumor spheroid based on the morphological information of size and volume, and monitor the growth of the dead-cell regions in the tumor spheroid based on optical intrinsic attenuation contrast. We show that HT-OCT can be used as a high-throughput imaging modality for drug screening as well as characterizing biofabricated samples.

Optical coherence tomography (OCT), a three-dimensional imaging technology, was used to monitor and characterize the growth kinetics of multicellular tumor spheroids. Precise volumetric quantification of tumor spheroids using a voxel counting approach, and label-free dead tissue detection in the spheroids based on intrinsic optical attenuation contrast, were demonstrated.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Krebsforschung

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living cells. The proposed instrument extends the sensitivity of label-free optical microscopy to nanoscale changes in organelle size and shape and can be used to accelerate the study of the structure-function relationship pertaining to organelle dynamics underlying fundamental biological processes, such as programmed cell death or cellular differentiation. The microscope can be easily implemented on existing microscopy platforms, and can therefore be disseminated to individual laboratories, where scientists can implement and use the proposed methods with unrestricted access.
The proposed technique is able to characterize subcellular structure by observing the cell through two-dimensional optical Gabor filters. These filters can be tuned to sense with nanoscale (10's of nm) sensitivity, specific morphological attributes pertaining to the size and orientation of non-spherical subcellular organelles. While based on contrast generated by elastic scattering, the technique does not rely on a detailed inverse scattering model or on Mie theory to extract morphometric measurements. This technique is therefore applicable to non-spherical organelles for which a precise theoretical scatter description is not easily given, and provides distinctive morphometric parameters that can be obtained within unstained living cells to assess their function. The technique is advantageous compared with digital image processing in that it operates directly on the object's field transform rather than the discretized object's intensity. It does not rely on high image sampling rates and can therefore be used to rapidly screen morphological activity within hundreds of cells at a time, thus greatly facilitating the study of organelle structure beyond individual organelle segmentation and reconstruction by fluorescence confocal microscopy of highly magnified digital images of limited fields of view.
In this demonstration we show data from a marine diatom to illustrate the methodology. We also show preliminary data collected from living cells to give an idea of how the method may be applied in a relevant biological context.

We demonstrate a dark-field microscopy method based on Gabor-like filtering to measure subcellular dynamics within single living cells. The technique is sensitive to alterations in the structure of organelles, such as mitochondrial fragmentation.

Optical Microscopy Scatter auf zweidimensionalen Gabor-Filtern

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living ...

Biologie

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Entwicklungsbiologie

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Biotechnik

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

Quantitative Analyse der viskoelastischen Eigenschaften roter Blutkörperchen mittels optischer Pinzette und Defokussierungsmikroskopie

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

Imaging Biological Samples with Optical and Confocal Microscopy

Source: <a href="https://www.jove.com/author/Peiman_Shahbeigi-Roodposhti">Peiman Shahbeigi-Roodposhti</a> and Sina Shahbazmohamadi, Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, Storrs, Connecticut
Optical microscopes have been around for centuries, and while they reached their theoretical limitation of resolution decades ago, new equipment and techniques, such as confocal and digital image processing, have created new niches within the field of optical imaging. The best optical microscopes will typically have a resolution down to 200 nm in ideal conditions. However, optical microscopes are limited by the diffraction of waves, a function of the wavelength, which is around 500 nm for visible light. While the resolution of optical microscopes does not reach that of electron microscopes, they are the most valuable tools in the imaging of biological macrostructures and are a staple in any biological lab.
In conventional light microscopes, the signal produced from the imaged object is from the full thickness of the specimen, which does not allow most of it to be in focus to the observer. This causes the image to have &#34;out of focus blur&#34;. The confocal microscope, on the other hand, illuminates the sample through a pin-hole, and is therefore able to filter out the out-of-focus light from above and below the point of focus in the object.
This demonstration provides an introduction to image acquisition using optical and confocal microscopy methods. Here, a sectioned piece of mouse brain will be studied.&#160; Image acquisition and analysis, including the tools to generate topographical maps and composite images, will be covered. The advantages and disadvantages of different imaging methods as they relate to resolution, depth of focus and sample type will also be discussed. The purpose of this demonstration is to provide more information on optical and confocal microscopes to determine if these microscopy modules are the best fit for a type of biological sample.

Biological Sample Imaging with Optical and Confocal Microscopy

Bildgebung biologischer Proben mit optischer und konfokaler Mikroskopie

Source: Peiman Shahbeigi-Roodposhti and Sina Shahbazmohamadi, Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, Storrs, Connecticut
Optical ...